Mapowanie losu pojedynczej komórki u danio pręgowanego

Podsumowanie

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających białko fluorescencyjne w klatce za pomocą absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Sapphire. Aby zmapować los komórki aktywowanej światłem, stosuje się immunohistochemię. Tę technikę można zastosować do dowolnego typu komórki.

Streszczenie

Możliwość różnicowego oznaczania pojedynczych komórek ma ważne implikacje w biologii rozwoju. Na przykład określenie, w jaki sposób powstają linie krwiotwórcze, limfatyczne i naczyń krwionośnych w rozwijających się zarodkach, wymaga mapowania losu i śledzenia linii niezróżnicowanych komórek prekursorowych. Ostatnio dużym zainteresowaniem cieszą się fotoaktywowane białka, do których należą: Eos^{1, 2}, PAmCherry³, Kaede^4-7, pKindling⁸ i KikGR^{9, 10} jako sondy do śledzenia komórek. Widmo fluorescencji tych światłoczułych białek można łatwo przekształcić za pomocą wzbudzenia UV, co pozwala na odróżnienie populacji komórek od sąsiednich. Jednak fotowydajność aktywowanego białka może ograniczać długoterminowe śledzenie komórek¹¹. Jako alternatywa dla białek fotoaktywowanych, fluoresceina-dekstran w klatkach jest szeroko stosowany w modelowych systemach zarodków^{7, 12-14}. Tradycyjnie, aby uwolnić dekstran fluoresceinowy, stosuje się wzbudzenie UV z lampy fluorescencyjnej lub jednofotonowego lasera UV; Źródła te ograniczają jednak rozdzielczość przestrzenną fotoaktywacji. Tutaj zgłaszamy protokół mapy losu, śledzenia pochodzenia i wykrywania pojedynczych oznaczonych komórek. Pojedyncze komórki w zarodkach, którym wstrzyknięto fluoresceinę-dekstran w klatce, są fotoaktywowane impulsami laserowymi w bliskiej podczerwieni wytwarzanymi przez tytanowo-szafirowy laser femtosekundowy. Laser ten jest powszechnie stosowany we wszystkich dwufotonowych mikroskopach konfokalnych, takich jak mikroskop LSM 510 META NLO używany w tym artykule. Ponieważ tkanka biologiczna jest przezroczysta dla promieniowania w bliskiej podczerwieni¹⁵, impulsy laserowe mogą być skupiane głęboko w zarodku bez odłączania komórek powyżej lub poniżej wybranej płaszczyzny ogniskowej. Dlatego nieliniowa absorpcja dwufotonowa jest indukowana tylko w ognisku geometrycznym, aby uwolnić fluoresceinę-dekstran w pojedynczej komórce. Aby wykryć komórkę zawierającą nieklatkę z dekstranem fluoresceiny, opisujemy prosty protokół immunohistochemiczny¹⁶, aby szybko uwidocznić aktywowaną komórkę. Protokół aktywacji i detekcji przedstawiony w tym artykule jest wszechstronny i może być stosowany do dowolnego modelu systemu.

Uwaga: Odczynniki używane w tym protokole można znaleźć w tabeli dołączonej na końcu artykułu.

Protokół

1. Synteza fluoresceiny-dekstranu w klatce (zaadaptowana z Ref. 14)

1. Przygotować 0,1 M roztwór boranu sodu rozcieńczony w ddH₂O.
2. Odmierzyć 4 mg aminodsportu o stężeniu 10 kDa i dodać go do probówki fluoresceinowej z klatką CMNB.
3. Dodać 500 μl przygotowanego roztworu boranu sodu (krok 1.1) do probówki fluoresceinowej umieszczonej w sadzach CMNB. Zakryj probówkę i wiruj przez 30 sekund, aby rozpuścić mieszaninę.
4. Pozwól mieszaninie reagować przez noc na nutatorze w temperaturze pokojowej. Przykryj probówkę folią metalową, aby zapobiec wystawieniu mieszaniny na działanie światła otoczenia.
5. Zaopatrz się w kolumnę wirową Zeba do odsalania i odkręć dolną nasadkę. Zaznacz kropkę na kolumnie, która będzie używana do orientacji kolumny podczas wirowania. Umieść kolumnę w stożkowej probówce Falcon o pojemności 15 ml. Uwaga: Rozwiązaniem w kolumnie wirowania jest bufor kolumny.
6. Poluzuj górną nasadkę na kolumnie wirowej do odsalania. Umieść stożkową probówkę Falcona o pojemności 15 ml, w której znajduje się odsalana kolumna wirowa, w wirówce. Ustaw kolumnę wirującą tak, aby zaznaczona kropka (krok 1.4) była skierowana do środka wirnika wirówki. Odwirować probówkę o sile 1000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
7. Po odwirowaniu wyjmij odsalającą kolumnę wirową z probówki Falcon. Wyrzucić zarówno zebrany przepływ, jak i stożkową probówkę o pojemności 15 ml. Zaopatrz się w nową stożkową probówkę Falcon o pojemności 15 ml i umieść kolumnę wirową odsalającą w nowej probówce Falcon. Uwaga: Po odwirowaniu złoże żywicy kolumny powinno wyglądać na zagęszczone. Użyj kolumny od razu.
8. Otrzymać przereagowaną mieszaninę (dekstran fluoresceinowy umieszczony w sadzach) w kroku 1.3. Zdejmij nasadkę z kolumny wirowej i odessaj przereagowaną mieszaninę i powoli nałóż ją na środek kolumny wirowej do odsalania. Po nałożeniu przereagowanej mieszaniny załóż nasadkę na kolumnę wirową.
9. Umieść probówkę Falcona, w której znajduje się odsalana kolumna wirowa, w wirówce. Jak wykonano w kroku 1.5, ustaw kolumnę wirującą tak, aby zaznaczona kropka była skierowana do środka wirnika wirówki. Odwirować probówkę o sile 1000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
10. Po odwirowaniu żółta mieszanina (fluoresceina i dekstran w sadzie) zostanie zebrana (około 400 μl) w probówce Falcon o pojemności 15 ml. Przenieść mieszaninę fluoresceiny i dekstranu umieszczoną w sadzach do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
11. Natychmiast przykryj probówkę folią metalową, aby zapobiec wystawieniu mieszaniny na działanie światła otoczenia. Liofilizować umieszczoną w klatce mieszaninę fluoresceiny i dekstranu w speedvacu. Liofilizacja 350 μL powinna trwać około 4 godzin.
12. Po całkowitej liofilizacji ponownie zawiesić proszek (około 3 mg) w ddH₂O do końcowego stężenia około 1 % w/v. Wymieszać przez krótkie wirowanie w celu zawiesiny proszku.
13. Umieszczony w sadzce fluorescein-dekstran przelać do oddzielnych probówek pokrytych folią metalową i przechowywać w -20 °C.

2. Pobieranie zarodków i mikroiniekcja fluoresceiny-dekstranu w klatce

* Ta procedura wykorzystuje danio pręgowanego jako system modelu zwierzęcego.

1. Na dzień przed wstrzyknięciami należy ustawić krzyżówki danio pręgowanego 1:1 samiec z samicą lub 2:1 samiec z samicą w zbiornikach hodowlanych z przegrodami.
2. Następnego ranka wymień wodę w zbiorniku hodowlanym i usuń przegrody. Natychmiast przygotować 5 μl rozcieńczonego roztworu roboczego fluoresceiny-dekstranu w klatce w 1 x pożywce Danieau (patrz Przygotowanie roztworów) lub ddH₂O. Przykryć probówkę z roztworem roboczym folią metalową, aby zapobiec ekspozycji na światło.
3. Odpipetować przygotowany roztwór fluoresceiny i dekstranu w sadzkach (krok 2.2) do igły. Przed przycięciem końcówki igły do odpowiedniego rozmiaru pod mikroskopem preparacyjnym należy umieścić kawałek przezroczystego żółtego filtra przed źródłem białego światła. Żółty filtr zapobiega spontanicznemu rozmieszczaniu się dekstranu fluoresceiny w klatce podczas wstrzyknięć. Patrząc przez okular okularowy, źródło światła powinno być żółte.
4. Zebrać zarodki i pipetować je do tacki na formy do mikroiniekcji. Ustaw czas mikroiniekcji tak, aby dostarczyć od 3 do 4 nl dekstranu fluoresceiny w klatce. Pod mikroskopem preparacyjnym zorientuj zarodki za pomocą kleszczy i wstrzyknij (3 do 4 nL) fluoresceinę-dekstran w klatce do podstawy komórek blastomerów (granica blastomerów-żółtko). Stadium zarodka do wstrzyknięcia powinno wynosić od 1 do 2 komórek.
5. Po wstrzyknięciu należy wyjąć zarodki z tacki na formę do mikroiniekcji i umieścić je na czystej szalce Petriego zawierającej świeżą wodę dla ryb. Błękit metylenowy może być dodawany do wody dla ryb w celu zapobieżenia rozwojowi grzybów w końcowym stężeniu 0,02 % w/v. Przykryj szalkę Petriego folią metalową, aby zapobiec rozpakowaniu się w klatkę wstrzykniętego dekstranu fluoresceiny.
6. Podnieś wstrzyknięte zarodki do stanu, w którym interesujące komórki muszą zostać fotoaktywowane. W celu fotoaktywacji należy przygotować 0,6 % niskotopliwy roztwór agarozy w ddH₂O. W zależności od stadium zarodkowego, do niskotopliwej agarozy można dodać trikainę (MS222). W tym celu należy rozcieńczyć 0,02% trikainy w niskotopliwej agarozie do końcowego stężenia 0,0014 %.
7. Gdy tylko zarodki osiągną odpowiedni etap rozwoju, należy je zdechorionować w 1 X Danieau media za pomocą kleszczy. Podczas dechorionacji upewnij się, że przezroczysty żółty filtr jest umieszczony na drodze źródła białego światła (patrz krok 2.3).
8. Podgrzać 0,6 % niskotopliwy roztwór agarozy do temperatury 37 °C. Odpipetować 1 ml niskotopliwej agarozy do studzienki szkiełka nakrywkowego LabTek. Ostrożnie umieść 3 do 4 zarodków w niskotopliwej agarozie i ustaw je za pomocą kleszczy tak, aby komórki, które mają być fotoaktywowane, były skierowane w dół do dolnego szkiełka nakrywkowego.
9. Pozwól agarozie stężyć. Po zestaleniu odpipetować 1 ml 1 X pożywki Danieau na agarozę.
10. Powtórz kroki od 2.8 do 2.9, aby uzyskać więcej zarodków.

3. Dwufotonowa aktywacja fluoresceiny-dekstranu w klatce

* Ta procedura zakłada, że zarodek wykazuje ekspresję reporterowego GFP. Zarodek ogląda się za pomocą źródła laserowego z jonami argonu (488 nm) podłączonego do mikroskopu LSM 510 META NLO. Pojedyncza komórka dodatnia GFP jest wybierana i fotoaktywowana za pomocą lasera Mai Tai (laser femtosekundowy) sprzężonego z LSM 510. Procedura jest taka sama w przypadku zarodków niefluorescencyjnych. Alternatywnie można użyć białego światła do znalezienia komórki, która ma zostać aktywowana, a następnie aktywować za pomocą źródła lasera Mai Tai.

1. Załaduj oprogramowanie LSM 510. Umieść przezroczysty żółty filtr na ścieżce wiązki światła białego.
2. Wybierz opcję Skanuj nowy obraz i kliknij przycisk Uruchom tryb eksperta.
3. Wybierz zakładkę Laser (Laser). Włącz źródła lasera z jonami argonu (488 nm) i Mai Tai (femtosekundowe).
4. Ustaw długość fali Mai Tai na 740 nm.
5. Wybierz zakładkę konfiguracji. Ustaw konfigurację ścieżki optycznej dla jonu argonu i lasera Mai Tai.
6. Wybierz kartę Skanowanie. Zmień obiektyw na 20X/0,8.
7. Ustaw maksymalną szybkość skanowania, klikając opcję Maksymalna.
8. Ustaw Tryb, Metodę i Liczbę na Linia, Średnia i 1.
9. Na karcie Kanały odznacz wszystkie źródła lasera z wyjątkiem Mai Tai.
10. Umieść miernik mocy na ścieżce wiązki optycznej.
11. Wybierz przycisk Cont, aby aktywować skanowanie ciągłe.
12. Dostosuj % transmisji, aż miernik mocy wskaże średnią moc lasera 47 mW.
13. Zatrzymaj skanowanie, wybierając przycisk Zatrzymaj.
14. Na karcie Kanały odznacz źródło lasera Mai Tai i wybierz jon argonu (488 nm).
15. Wybierz przycisk Szybki xy. Na karcie Kanały dostosuj otworek, wzmocnienie detektora, przesunięcie wzmacniacza i wzmocnienie wzmacniacza dla lasera argonowo-jonowego, aby uzyskać najlepszą jakość obrazu.
16. Korzystając z kontrolera etapu, znajdź komórkę, którą chcesz aktywować, i skup się na niej.
17. Kliknij przycisk Zatrzymaj.
18. Za pomocą narzędzia do powiększania powiększaj aktywowaną komórkę, aż współczynnik powiększenia na karcie Tryb wyświetli od 50 do 70.
19. Zatrzymaj skanowanie, wybierając przycisk Zatrzymaj.
20. Na karcie Kanały odznacz laser argonowo-jonowy (488 nm) i wybierz laser Mai Tai.
21. Na karcie Tryb ustaw szybkość skanowania na 31,46 s.
22. Wybierz przycisk Pojedynczy, aby rozpocząć skanowanie w poszukiwaniu dwufotonowej aktywacji fluoresceiny-dekstranu w klatce wybranej komórki.
23. Po aktywacji odznacz laser Mai Tai w zakładce Kanały i ponownie wybierz laser argonowo-jonowy (488 nm).
24. Ustaw współczynnik powiększenia w obszarze Tryb na 1 i kliknij przycisk Max pod nagłówkiem Speed, aby ustawić najszybszą szybkość skanowania.
25. Wybierz Szybki xy, aby przejrzeć region aktywowany zdjęciem. Sprawdź, czy obszar aktywowany zdjęciem nie jest poddany ablacji laserowej. Aby uzyskać więcej informacji na temat ablacji laserowej, zapoznaj się z sekcją dyskusji.
26. Powtórz powyższe kroki dla innych zarodków.

4. Immunodetekcja nieklatkowego fluoresceiny-dekstranu (zaadaptowana z Ref. 16)

1. Po fotoatywacji umieść przezroczysty żółty filtr przed źródłem białego światła i ręcznie usuń każdy zarodek z niskotopliwej agarozy za pomocą ostrych kleszczy. Umieść wszystkie usunięte zarodki na nowej szalce Petriego zawierającej świeżą pożywkę 1 X Danieau. Przykryj szalkę Petriego metalową folią, aby zapobiec wystawieniu zarodków na działanie światła.
2. W razie potrzeby wyhoduj zarodki do pożądanego etapu rozwoju. W międzyczasie należy przygotować 4 % roztwór paraformaldehydu (patrz Przygotowanie roztworów). Podwielokrotność 1,5 ml przygotowanego paraformaldehydu do probówki do mikrowirówki.
3. Po osiągnięciu przez zarodki interesującego ich etapu rozwoju, należy je pipetować do probówki mikrowirówkowej (od kroku 4.2). Przykryj rurkę metalową folią, aby zapobiec ekspozycji na światło.
4. Nutować probówkę przez noc w temperaturze 4°C. Na następny dzień przygotować stopniowane roztwory etanolu (EtOH) w buforze fosforanowym, soli fizjologicznej (PBS) i_ddH2O; 30 % EtOH:PBS, 50 % EtOH:PBS, 70 % EtOH:_ddH2O i 100 % EtOH.
5. Następnego dnia usuń zarodki z 4°C. Usuń metalową folię przykrywającą probówkę i szybko odessaj paraformaldehye (pozostaw niewielką objętość, która wystarczy do przykrycia zarodków). Odpipetować 1,5 ml 30% EtOH:PBS do probówki. Ponownie przykryj tubę folią metalową. Nutować probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
6. Powtórz krok 4.5, używając roztworów EtOH o gradacji 50, 70 i 100%. Po przepłukaniu 100 % EtOH należy ponownie płukać zarodki w 100% EtOH przez 10 minut.
7. Po umyciu należy przechowywać zarodki przez noc w temperaturze -20 °C. Na następny dzień należy przygotować buforowany fosforanem tween (PBT; patrz Przygotowanie roztworów), 5 X bufor blokujący (patrz protokół producenta dotyczący przygotowania), kwas maleinowy (protokół przygotowania można znaleźć w protokole buforu blokującego), 10 mg/ml proteinazy K i 10 X roztwór przeciwciała (Anty-Fluoresceina-AP; patrz Przygotowanie roztworów).
8. Przygotować także 2 % surowicę jagnięcą (LS; patrz Przygotowanie roztworów) rozcieńczoną w PBT. Przechowywać przeciwciało w temperaturze 4 °C przez noc, wytrząsając nutator. 2 % LS można przechowywać w temperaturze 4 °C.
9. Następnego dnia usunąć zarodki z temperatury -20 °C. Usunąć metalową folię pokrywającą probówkę i szybko odessać 100 % EtOH. Dodać 1,5 ml 70 % EtOH:ddH₂O do probówki. Ponownie przykryj tubę folią metalową. Nutować probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
10. Powtórzyć krok 4.8, używając 50 i 30 % roztworów EtOH o gradacji i 100 % PBT. Po umyciu 100% PBT płucz zarodki jeszcze 3 razy w 100% PBT przez 10 minut.
11. Jeśli zarodki są starsze niż 24 godziny, leczenie proteinazą K . Jeśli nie, przejdź do kroku 4.13. W tym celu należy rozcieńczyć przygotowaną proteinazę K (krok 4.7) w stosunku 1:1000 w PBT. Inkubować zarodki w proteinazie K przez 10 minut lub dłużej, jeśli zarodki są starsze. Trzymaj zarodki przykryte folią metalową, aby zapobiec ekspozycji na światło.
12. Po leczeniu proteinazą K należy przemyć zarodki 5 razy w PBT przez 10 minut. Po umyciu utrwalić zarodki w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut w temperaturze pokojowej na nutatorze. Następnie natychmiast umyj zarodki 5 razy w PBT przez 10 minut. Trzymaj zarodki przykryte folią metalową, aby zapobiec ekspozycji na światło.
13. Sporządzić bufor blokujący, rozcieńczając 5 X bufor blokujący w buforze kwasu maleinowego do 1 X. Usunąć zarodki z PBT i umieścić je w buforze blokującym 1 X. Przykryj zarodki folią metalową i nutuj je w temperaturze pokojowej przez 5 do 6 godzin.
14. Po 5 do 6 godzinach od zablokowania należy poddać zarodki szokowi termicznemu w temperaturze 65 °C przez 15 do 20 minut.
15. Otrzymać roztwór przeciwciała i 2 % LS przygotowane poprzedniego dnia. Odwirować roztwór przeciwciała przy maksymalnej prędkości obrotowej. Przenieść fazę wodną do probówki z 2 % roztworem LS. Odwróć rurkę, aby wymieszać.
16. Przenieść zarodki z buforu blokującego do mieszaniny przeciwciał LS. Trzymaj zarodki przykryte folią metalową, aby zapobiec ekspozycji na światło. Nutować zarodki w temperaturze 4 °C przez noc.
17. Następnego dnia myj zarodki w temperaturze pokojowej 6 razy przez 15 minut w PBT. Przygotuj bufor AP (patrz Przygotowanie roztworów).
18. Umyj zarodki w temperaturze pokojowej 2 razy przez 10 minut w buforze AP. Przygotowanie roztworu rozwijającego NBT/BCIP (patrz Przygotowanie roztworów).
19. Przenieść zarodki do NBT/BCIP. Pozwól, aby plama rozwinęła się w ciemności.
20. Zatrzymaj rozwój, myjąc zarodki 3 razy w PBT przez 5 minut każdy.
21. W celu uzyskania obrazu należy zamontować zarodki w 0,6% niskotopliwej agarozie lub 3% metylocelulozie, a następnie uzyskać obrazy za pomocą odwróconego lub pionowego mikroskopu złożonego.
22. Próbki aktywowane fotoaktywem mogą być przechowywane do przyszłej analizy (barwienie pozostaje stabilne) poprzez ich odwodnienie w stopniowanym płukaniu EtOH. Wykonaj kroki od 4.4 do 4.7, aby odwodnić próbki.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Fotoaktywacja dekstranu fluoresceinowego w klatce. Panie przewodniczący, panie i panowie! Obraz jasnego pola i fluorescencji zarodka danio pręgowanego w widoku bocznym w stadium 13/14-somitowym przed fotoaktywacją. (C,D) Zarodek został fotoaktywowany w stadium 13/14-somitowym w jednym z somitów (strzałka) o długości fali 740 nm, czasie skanowania 31 sekund i średniej mocy lasera 47 mW. Po aktywacji (d) obserwuje się fluorescencję z nieklatkowniczego fluoresceiny-dekstranu. Orientacja: grzbietowa (po prawej), brzuszna (po lewej). Podziałka 100 μm.

Rysunek 2. Immunodetekcja dekstranu fluoresceiny w klatce. Rysunek 2 przedstawia barwienie immunologiczne nieklatkowniczego fluoresceiny-dekstranu w zarodku danio pręgowanego 18/19 hpf. W stadium 10-somitowym niewielki obszar zarodka został aktywowany w mezodermie płytki bocznej przy użyciu tych samych parametrów lasera, które podano na rycinie 1. Korzystając z procedury immunodetekcji, strzałka identyfikuje aktywowany region z minimalnym barwieniem tła. Orientacja: grzbietowa (góra), brzuszna (dół). Podziałka 100 μm.

Dyskusja

W artykule opisano wszechstronną metodę mapowania losu pojedynczej komórki w oparciu o fotoaktywację dekstranu fluoresceiny w klatce. Odtworzenie w klatkę dekstranu fluoresceinowego w pojedynczych komórkach odbywa się za pomocą absorpcji dwufotonowej z lasera femtosekundowego Mai Tai sprzężonego z mikroskopem konfokalnym Zeiss LSM 510 META. Nieumieszczony w klatce fluoresceina-dekstran w komórkach aktywowanych światłem jest szybko wizualizowany za pomocą prostej procedury immunohistochemicznej.

W tym protokole długość fali absorpcji dwóch fotonów do fotoaktywacji fluoresceiny-dekstranu w klatce wynosi 740 nm. Ta długość fali została eksperymentalnie określona przez fotoaktywację zarodków typu dzikiego z wstrzykniętymi fluoresceiną-dekstranem w klatkach. Długość fali wzbudzenia lasera wahała się od 600 do 800 nm, a obecność lub brak fluorescencji fluoresceiny po aktywacji określono jakościowo. Odkryliśmy, że 740 nm wytwarzało najsilniejszy sygnał fluoresceiny po aktywacji. Idealnie, 740 nm powinno działać dla wszystkich systemów modelowych; Zalecamy jednak przetestowanie szeregu długości fal w celu określenia optymalnej długości fali wzbudzenia dwufotonowego dla próbki.

W klatkach z wstrzykniętymi zarodkami fluoresceiny i dekstranu typu dzikiego, dla każdej badanej długości fali wzbudzenia dwufotonowego zmienialiśmy również średnią moc lasera. Dla długości fali wzbudzenia 740 nm, średnia moc lasera wynosząca 47 mW wytwarzała silniejszy sygnał fluoresceiny w aktywowanym obszarze w porównaniu z niższymi średnimi mocami lasera. Wyższe średnie moce lasera nie wytwarzały silniejszych sygnałów fluoresceinowych, ale indukowały ablację tkanki. Ponieważ femtosekundowe impulsy laserowe są skuteczne w ablacji tkanki biologicznej¹⁵, zalecamy określenie progowej średniej mocy lasera dla fotoaktywacji, która pozwala uniknąć ablacji tkanek.

Absorpcja dwufotonowa zachodzi w małej objętości oddziaływania. Aby zapewnić prawidłową aktywację dekstranu fluoresceiny w klatce, komórka musi być odpowiednio zogniskowana. W powyższym protokole komórki GFP dodatnie były jednocześnie obrazowane w świetle białym, aby potwierdzić skupienie komórek. Dlatego wskazana jest akwizycja światła białego wraz z innymi kanałami. Po potwierdzeniu ostrości komórki, nasz protokół sugeruje powiększenie aktywowanej komórki. Sugerowany jest współczynnik powiększenia od 50 do 70, jednak wartość ta zależy od rozmiaru wybranej komórki. Zwiększenie powiększenia izoluje aktywowaną komórkę od sąsiednich komórek i ogranicza obszar skanowania dla aktywacji dwufotonowej. Idealnie byłoby, gdyby obszar skanowania obejmował duży obszar komórki.

Wykrywanie pojedynczych aktywowanych komórek wymaga, aby barwienie tła było minimalne. W powyższym protokole immunodetekcji ważne jest, aby próbka była zablokowana w buforze blokującym przez 5 do 6 godzin (krok 4.13). Podczas wywoływania z NBT/BCIP fluoresceina-dekstran bez klatki powinien stać się widoczny w ciągu 10 do 20 minut. Jeśli barwienie tła jest silne, sugerujemy dłuższy czas blokowania i dodatkowe płukanie w celu usunięcia przeciwciała (krok 4.17).

Ryciny 1 i 2 przedstawiają reprezentatywne wyniki fotoaktywacji i immunodetekcji. Na rycinie 1 zarodki typu dzikiego we wczesnym stadium od 1 do 2 komórek wstrzyknięto z klatkowym dekstranem fluoresceiny. Zarodki podniesiono do środkowej somitogenezy i umieszczono w niskotopliwej agarozie w orientacji bocznej. Rycina 1(a,b) przedstawia obrazy zarodka w jasnym polu i fluorescencyjne przed fotoaktywacją. Dowodem na to, że zarodek pozostał bez klatki, jest brak fluorescencji fluoresceiny na rycinie 1(b). Mały obszar w somicie był aktywowany długością fali 740 nm przez 31 sekund przy użyciu średniej mocy lasera 47 mW, Rysunek 1(c; strzałka). Po aktywacji nastąpiło dwufotonowe rozpakowanie dekstranu fluoresceiny, jak pokazano na podstawie fluorescencji z aktywowanego obszaru, rysunek 1 (d; strzałka). Aktywacji nie towarzyszyła ablacja laserowa, ponieważ tkanka somityczna pozostała nienaruszona, ryc. 1 (c). Rycina 2 przedstawia immunodetekcję dekstranu fluoresceiny bez klatkowni. Mały obszar w mezodermie płytki bocznej zarodka w stadium 10-somitowym został fotoaktywowany przy użyciu tych samych parametrów lasera, jak wspomniano na rycinie 1. Zarodek został wyhodowany i przetworzony przy użyciu kroków od 4.1 do 4.20. Strzałka na rysunku 2 lokalizuje aktywowany obszar, na co wskazuje nagromadzenie niebieskiego osadu. Tylko aktywowana lokalizacja jest wyraźnie wykrywana bez zakłócającego barwienia tła.

Przygotowanie roztworów:

1 x PBT (1 l)
100 ml 10 x PBS
2 g BSA
10 ml 20 % Tween

10 x PBS (1 l)
80 g NaCl
2 g KCl
6,1 g Na₂HPO₄
1,9 g KH₂PO₄
ddH₂O do 1 L
pH do 7,3

4 % paraformaldehyd (160 ml)
32 % paraformaldehyd (dwie fiolki po 10 ml)
8 ml 20 x PBS
132 ml ddH₂O

Bufor AP ( 50 mL)
1 ml 5 M NaCl
2,5 ml 1 M MgCl₂
5 ml 1 M Tris pH 9,5
250 μL 20 % Animacja
41,25 ml ddH₂O

Roztwór przeciwciał (na 1 próbkę)
5,5 μl acetonu w proszku
40 μl PBT
0,8 μL LS
0,1 μl przeciwciała antyfluoresceiny AP

2 % LS (360 μL na 1 próbkę)
7,2 μL 100 % LS
352,8 μl PBT

1 x Danieau media (1 L)^‡
11,6 ml 5 M NaCl
700 μL 1 M KCl
400 μL 1 M_MgSO4
600 μL 1 M Ca(NO₃)₂
5 ml 1 M HEPES.
ddH₂O do 1 L
pH dostosuj do 7,6

^‡ Danieau jest idealnym roztworem soli do hodowli zarodków danio pręgowanego z dekorionacją. Dopuszcza się stosowanie innych pożywek, pod warunkiem, że są to roztwory izotoniczne o odpowiedniej osmolarności (~ 300 mOsm dla danio pręgowanego)

Bulion NBT (1 ml)
50 mg Nitro Blue Tetrazolium
0,7 ml bezwodnika dimetyloformamidu
0,3 ml ddH₂O

Zapas BCIP (1 ml)
50 mg fosforanu 5-bromo-4-chloro-3-indolylowego
1 ml bezwodnika dimetyloformamidu

Rozwiązanie rozwojowe NBT/BCIP
1 ml buforu AP
4,5 μl zapasu NBT
3,5 μL zapasu BCIP

Aceton w proszku

1. Wybierz 20 dorosłych ryb i zamroź je w ciekłym azocie.
2. Zmiel zamrożoną rybę za pomocą moździerza i tłuczka na proszek.
3. Przenieś proszek rybny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
4. Napełnij stożkową rurkę 100 % acetonem. Odwiruj rurkę.
5. Kręć rurkę z maksymalną prędkością obrotową przez 10 minut. Odrzucić supernatant.
6. Umyj granulkę jeszcze 3 razy w 100% acetonie i wiruj rurkę z maksymalną prędkością obrotową przez 10 minut. Do ostatniego płukania supernatant powinien być klarowny.
7. Ponownie dodać 100 % acetonu do osadu i odstawić probówkę w temperaturze pokojowej. Bardziej gęste cząstki osiądną, podczas gdy drobniejsze cząstki pozostaną w zawiesinie.
8. Przelej drobne cząstki do nowej probówki. Roztwór proszku rozdzielić na osobne probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CMNB-klatkowa fluoresceina SE	Invitrogen	C20050
10 kDa Aminodextran	Invitrogen	D1860
Zeba Desalt Spin Column	Pierce, Thermo Scientific	89889
Niskotopliwa agaroza	Amresco	0815-100G
Boran sodu	Amresco	1131117-100G
Trikaina Metylosulfonian / MS222	Research Organics	1347A
Anty-fluoresceina-AP	Grupa Roche 11376622
Bufor blokujący	Grupa Roche 11	096 176 001
Kwas maleinowy	Sigma-Aldrich	MO375-500G
Paraformaldehydowa	mikroskopia elektronowa	Nauki 15714
NBT	Sigma-Aldrich	I8377-250mg
BCIP	Fisher Scientific	PI-34040
Mikrowtryskiwacz	Aparat Harvard	PLI-2000
Szkiełka nakrywkowe z komorą LabTek	Nalge Nunc international	155380
Proteinaza K	Invitrogen	AM2544
Surowica jagnięca	Invitrogen	16070096
LSM 510 META NLO	Carl Zeiss, Inc.
Obiektyw apochromatyczny 20X 0.8 NA Air	Carl Zeiss, Inc.
Przezroczysty żółty filtr	Theatre House Inc.	Arkusz filtracyjny Roscolux Kolor: 312