Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.
Artykuł metodologiczny
Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zdolność do różnicowego znakowania pojedynczych komórek ma istotne znaczenie w biologii rozwoju. Na przykład określenie, w jaki sposób powstają linie krwiotwórcze, limfatyczne i naczyniowe w rozwijających się embrionach, wymaga mapowania losów i śledzenia linii niezróżnicowanych komórek prekursorowych. Ostatnio szerokie zainteresowanie jako sondy do śledzenia komórek wzbudziły białka fotoaktywowalne, do których należą: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8 oraz KikGR9, 10. Spektrum fluorescencji tych białek światłoczułych może być łatwo konwertowane za pomocą wzbudzenia UV, co pozwala odróżnić populację komórek od sąsiednich. Jednak wydajność fotoaktywacji białka może ograniczać długoterminowe śledzenie komórek11. Jako alternatywa dla białek fotoaktywowalnych, w systemach modelowych embrionów szeroko stosowano uwięziony (caged) fluoresceinowy dekstran7, 12-14. Tradycyjnie do uwalniania fluoresceinowego dekstranu z klatki stosowano wzbudzenie UV z lampy fluorescencyjnej lub jednofotonowego lasera UV; jednak źródła te ograniczają rozdzielczość przestrzenną fotoaktywacji. Przedstawiamy tutaj protokół mapowania losów, śledzenia linii oraz detekcji pojedynczo znakowanych komórek. Pojedyncze komórki w embrionach wstrzykniętych z uwięzionym fluoresceinowym dekstranem są fotoaktywowane impulsami lasera bliskiej podczerwieni generowanymi przez femtosekundowy laser tytanowo-szafirowy. Laser ten jest standardowy we wszystkich dwufotonowych mikroskopach konfokalnych, takich jak mikroskop LSM 510 META NLO wykorzystany w niniejszej pracy. Ponieważ tkanka biologiczna jest przezroczysta dla promieniowania bliskiej podczerwieni15, impulsy laserowe mogą być ogniskowane głęboko wewnątrz embrionu bez uwalniania dekstranu z komórek powyżej lub poniżej wybranej płaszczyzny ogniskowania. W związku z tym nieliniowa absorpcja dwufotonowa jest indukowana tylko w ognisku geometrycznym, aby uwolnić fluoresceinowy dekstran w pojedynczej komórce. W celu wykrycia komórki zawierającej uwolniony fluoresceinowy dekstran opisujemy prosty protokół immunohistochemiczny16 do szybkiej wizualizacji aktywowanej komórki. Przedstawiony w niniejszej pracy protokół aktywacji i detekcji jest wszechstronny i może być zastosowany w dowolnym systemie modelowym.
Uwaga: Odczynniki wykorzystane w tym protokole znajdują się w tabeli dołączonej na końcu artykułu.
Protokół
1. Synteza klatkowanej fluoresceiny-dekstranu (adaptacja z ref. 14)
- Przygotować 0,1 M roztwór boranu sodu rozcieńczony w ddH2O.
- Odważyć 4 mg aminodekstranu 10 kDa i dodać go do probówki z fluoresceiną klatkowaną CMNB.
- Dodać 50 μL przygotowanego roztworu boranu sodu (krok 1.1) do probówki z fluoresceiną klatkowaną CMNB. Zamknąć probówkę i mieszać wortexie przez 30 sekund do rozpuszczenia mieszaniny.
- Pozostawić mieszaninę do reakcji przez noc na nutatorze w temperaturze pokojowej. Przykryć probówkę folią aluminiową, aby zapobiec wystawieniu mieszaniny na działanie światła otoczenia.
- Pobrać kolumienkę odsalającą Zeba desalt spin column i odkręcić dolną zatyczkę. Zaznaczyć kropkę na kolumience, która posłuży do jej orientacji podczas wirowania. Umieścić kolumienkę w stożkowej probówce Falcon 15 mL. Uwaga: Roztwór w kolumience to bufor kolumnowy.
- Poluzować górną zatyczkę kolumienki odsalającej. Umieścić stożkową probówkę Falcon 15 mL z kolumienką w wirówce. Zorientować kolumienkę tak, aby zaznaczona kropka (krok 1.4) była skierowana w stronę środka rotora wirówki. Wirować probówkę przy 10 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
- Po wirowaniu wyjąć kolumienkę odsalającą z probówki Falcon. Wyrzucić zarówno zebraną frakcję przepływową, jak i stożkową probówkę 15 mL. Pobrać nową stożkową probówkę Falcon 15 mL i umieścić w niej kolumienkę odsalającą. Uwaga: Po wirowaniu złoże żywicy w kolumience powinno być zbite. Użyć kolumienki niezwłocznie.
- Pobrać mieszaninę poreakcyjną (klatkowany fluorescein-dekstran) z kroku 1.3. Zdjąć zatyczkę z kolumienki, odessać mieszaninę poreakcyjną i powoli nanieść ją na środek kolumienki odsalającej. Po naniesieniu mieszaniny poreakcyjnej założyć zatyczkę na kolumienkę.
- Umieścić probówkę Falcon z kolumienką odsalającą w wirówce. Podobnie jak w kroku 1.5, zorientować kolumienkę tak, aby zaznaczona kropka była skierowana w stronę środka rotora wirówki. Wirować probówkę przy 10 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
- Po wirowaniu w probówce Falcon 15 mL zostanie zebrana żółta mieszanina (klatkowany fluorescein-dekstran) w ilości około 400 μL. Przenieść mieszaninę klatkowanego fluoresceiny-dekstranu do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
- Niezwłocznie przykryć probówkę folią aluminiową, aby zapobiec wystawieniu mieszaniny na działanie światła otoczenia. Liofilizować mieszaninę klatkowanego fluoresceiny-dekstranu w wirówce próżniowej (speedvac). Liofilizacja 350 μL powinna trwać około 4 godzin.
- Po całkowitej liofilizacji resuspender proszek (około 3 mg) w ddH2O do stężenia końcowego około 1 % w/v. Wymieszać, krótko w vortexie, aby zawiesić proszek.
- Rozdzielić klatkowany fluorescein-dekstran na alykwoy do osobnych probówek przykrytych folią aluminiową i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
2. Pobieranie zarodków i mikroiniekcja fluoresceiny-dekstranu w klatce
* W tej procedurze jako model zwierzęcy wykorzystano danio pręgowanego.
- Dzień przed iniekcjami przygotuj krzyżówki danio pręgowanych w stosunku 1:1 (samiec do samicy) lub 2:1 w zbiornikach hodowlanych z przegrodami.
- Następnego ranka wymień wodę w zbiorniku hodowlanym i usuń przegrody. Bezzwłocznie przygotuj 5 μL 1/10 rozcieńczonego roztworu roboczego klatkowanej fluoresceiny-dekstranu w 1 X pożywce Danieau (patrz Przygotowanie roztworów) lub ddH2O. Owiń probówkę z roztworem roboczym folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.
- Naciągnij przygotowany roztwór klatkowanej fluoresceiny-dekstranu (krok 2.2) do igły. Przed przycięciem końcówki igły do odpowiedniej wielkości pod mikroskopem sekcyjnym, umieść przezroczysty żółty filtr przed białym źródłem światła. Żółty filtr zapobiegnie spontanicznemu odklatkowaniu fluoresceiny-dekstranu podczas iniekcji. Podczas patrzenia przez okular, źródło światła powinno wydawać się żółte.
- Zbierz embriony i przenieś je pipetą do formy do mikroiniekcji. Ustaw czas mikroiniekcji tak, aby podać od 3 do 4 nL klatkowanej fluoresceiny-dekstranu. Pod mikroskopem sekcyjnym uorientuj embriony za pomocą pincety i wstrzyknij (3 do 4 nL) klatkowanej fluoresceiny-dekstranu do podstawy blastomerów (interfejs blastomer-żółtko). Stadium embrionu podczas iniekcji powinno odpowiadać stadium 1- lub 2-komórkowemu.
- Po iniekcji usuń embriony z formy do mikroiniekcji i umieść je w czystej szalce Petri z czystą wodą dla ryb. Do wody dla ryb można dodać błękit metylenowy w stężeniu końcowym 0,02 % w/v, aby zapobiec rozwojowi grzybów. Przykryj szalkę Petri folią aluminiową, aby zapobiec odklatkowaniu wstrzykniętej klatkowanej fluoresceiny-dekstranu.
- Hoduj wstrzyknięte embriony do stadium, w którym wymagana jest fotoaktywacja wybranych komórek. Do fotoaktywacji przygotuj 0,6 % roztwór agarozy niskotopliwej w ddH2O. W zależności od stadium embrionu, do agarozy niskotopliwej można dodać trikainę (MS2). W tym celu rozcieńcz 0,02% trikainy w agarozie niskotopliwej do stężenia końcowego 0,014 %.
- Gdy tylko embriony osiągną odpowiednie stadium rozwojowe, usuń otoczki chorionowe za pomocą pincety w 1 X pożywce Danieau. Podczas usuwania chorionu upewnij się, że na drodze białego źródła światła znajduje się przezroczysty żółty filtr (patrz krok 2.3).
- Podgrzej 0,6 % roztwór agarozy niskotopliwej do 37 °C. Pipetuj 1 mL agarozy niskotopliwej dołka szkiełka podstawowego z komorą LabTek. Ostrożnie zamontuj 3 do 4 embrionów w agarozie niskotopliwej i uorientuj je pincetą tak, aby komórki do fotoaktywacji były skierowane w dół, w stronę dolnego szkiełka nakrywkowego.
- Pozostaw agarozę do stężenia. Po zestaleniu pipetuj 1 mL 1 X pożywki Danieau na agarozę.
- Powtórz kroki 2.8 do 2.9 dla kolejnych embrionów.
3. Aktywacja dwufotonowa klatkowanej fluoresceiny-dekstranu
* Procedura ta zakłada, że zarodek wykazuje ekspresję reportera GFP. Obserwację zarodka przeprowadzono przy użyciu argonowego źródła laserowego (48 nm) podłączonego do mikroskopu LSM 510 META NLO. Wybrano pojedynczą komórkę wykazującą ekspresję GFP, a następnie poddano ją fotoaktywacji przy użyciu lasera Mai Tai (lasera femtosekundowego) sprzężonego z LSM 510. Procedura jest taka sama w przypadku zarodków niewykazujących fluorescencji. Alternatywnie, do zlokalizowania komórki do aktywacji można użyć światła białego, a następnie przeprowadzić aktywację za pomocą źródła laserowego Mai Tai.
- Uruchom oprogramowanie LSM 510. Umieść przezroczysty żółty filtr w torze wiązki światła białego.
- Wybierz Scan New Image i kliknij Start Expert Mode.
- Wybierz zakładkę Laser. Włącz źródła laserowe: jon argonowy (488 nm) oraz Mai Tai (femtosekundowy).
- Ustaw długość fali lasera Mai Tai na 740 nm.
- Wybierz zakładkę config. Ustaw konfigurację toru optycznego dla lasera jonowego argonowego oraz lasera Mai Tai.
- Wybierz zakładkę Scan. Zmień obiektyw na 20X/0.8.
- Ustaw maksymalną prędkość skanowania, klikając Max.
- Ustaw parametry Mode, Method oraz Number na Line, Mean i 1.
- W zakładce Channels odznacz wszystkie źródła laserowe z wyjątkiem Mai Tai.
- Umieść miernik mocy w torze wiązki optycznej.
- Wybierz przycisk Cont, aby aktywować skanowanie ciągłe.
- Reguluj wartość transmisji % aż miernik mocy wskaże średnią moc lasera 47 mW.
- Zatrzymaj skanowanie, wybierając przycisk Stop.
- W zakładce Channels odznacz źródło laserowe Mai Tai i wybierz laser jonowy argonowy (48 nm).
- Wybierz przycisk Fast xy. W zakładce Channels dostosuj aperturę pinhole, wzmocnienie detektora, offset wzmacniacza oraz wzmocnienie wzmacniacza dla lasera jonowego argonowego, aby uzyskać najlepszą jakość obrazu.
- Za pomocą kontrolera stolika znajdź i ustaw ostrość na komórce, którą chcesz aktywować.
- Kliknij przycisk Stop.
- Używając narzędzia powiększania, powiększ aktywowaną komórkę, aż czynnik powiększenia w zakładce Mode będzie wynosić od 50 do 70.
- Zatrzymaj skanowanie, wybierając przycisk Stop.
- W zakładce Channels odznacz laser jonowy argonowy (48 nm) i wybierz laser Mai Tai.
- W zakładce Mode ustaw prędkość skanowania na 31.46 sec.
- Wybierz przycisk Single, aby rozpocząć skanowanie w celu dwufotonowej aktywacji klatkowanego flurosecyny-dekstranu w wybranej komórce.
- Po aktywacji odznacz laser Mai Tai w zakładce Channels i ponownie wybierz laser jonowy argonowy (488 nm).
- Ustaw czynnik powiększenia w zakładce Mode na 1 i kliknij przycisk Max w sekcji Speed, aby ustawić maksymalną prędkość skanowania.
- Wybierz Fast xy, aby przejrzeć obszar fotoaktywacji. Sprawdź, czy obszar fotoaktywacji nie uległ ablacji laserowej. Więcej informacji na temat ablacji laserowej znajduje się w sekcji dyskusji.
- Powtórz powyższe kroki dla pozostałych embrionów.
4. Immunodetekcja uwolnionej flurosecyny-dekstranu (na podstawie Ref. 16)
- Po fotoaktywacji umieść przezroczysty żółty filtr przed białym źródłem światła i ręcznie usuń każdy embrion z niskotopiwego agarozu za pomocą ostrych pincet. Umieść wszystkie usunięte embriony w nowej płytce Petri zawierającej świeże podłoże Danieau 1 X. Przykryj płytkę Petri folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji embrionów na światło.
- W razie potrzeby hoduj embriony do pożądanego stopnia rozwoju. W międzyczasie przygotuj 4 % roztwór paraformaldehydu (patrz Preparation of Solutions). Odmierz 1,5 mL przygotowanego paraformaldehydu do probówki do mikrocentryfugi.
- Gdy embriony osiągną interesujący stopień rozwoju, przenieś je pipetą do probówki do mikrocentryfugi (z kroku 4.2). Przykryj probówkę folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.
- Inkubuj probówkę przez noc w temperaturze 4°C na nutatorze. Na następny dzień przygotuj stopniużone roztwory etanolu (EtOH) w buforze fosforanowym z solą (PBS) i ddH2O; 30 % EtOH:PBS, 50 % EtOH:PBS, 70 % EtOH:ddH2O oraz 100 % EtOH.
- Następnego dnia wyjmij embriony z temperatury 4°C. Usuń folię aluminiową pokrywającą probówkę i szybko odessij paraformaldehyd (pozostawiając niewielką objętość wystarczającą do zakrycia embrionów). Pipetą dodaj do probówki 1,5 mL 30 % EtOH:PBS. Ponownie przykryj probówkę folią aluminiową. Inkubuj probówkę na nutatorze w temperaturze pokojowej przez 10 min.
- Powtórz krok 4.5, używając stopniużonych roztworów EtOH o stężeniach 50, 70 i 10 %. Po przemyciu 10 % EtOH ponownie wypłucz embriony w 10 % EtOH przez 10 min.
- Po przemyciu przechowuj embriony przez noc w temperaturze -20 °C. Na następny dzień przygotuj bufor tween fosforanowy (PBT; patrz Preparation of Solutions), 5 X bufor blokujący (patrz protokół producenta dotyczący przygotowania), kwas maleinowy (protokół przygotowania znajduje się w protokole buforu blokującego), 10 mg/ml proteinazy K oraz 10 X roztwór przeciwciał (Anti-fluorescein-AP; patrz Preparation of Solutions).
- Przygotuj również 2 % surowicę owczą (LS; patrz Preparation of Solutions) rozcieńczoną w PBT. Przechowuj przeciwciała w temperaturze 4 °C przez noc, mieszając na nutatorze. 2 % LS można przechowywać w 4 °C.
- Następnego dnia wyjmij embriony z temperatury -20 °C. Usuń folię aluminiową pokrywającą probówkę i szybko odessij 10 % EtOH. Dodaj do probówki 1,5 mL 70 % EtOH:ddH2O. Ponownie przykryj probówkę folią aluminiową. Inkubuj probówkę na nutatorze w temperaturze pokojowej przez 10 min.
- Powtórz krok 4.8, używając stopniużonych roztworów EtOH o stężeniach 50 i 30 % oraz 10 % PBT. Po przemyciu w 100 % PBT wypłucz embriony jeszcze 3 razy w 10 % PBT przez 10 min.
- Jeśli embriony mają więcej niż 24 godziny, poddaj je działaniu proteinazy K. Jeśli nie, przejdź do kroku 4.13. Aby to zrobić, rozcieńcz przygotowaną proteinazę K (krok 4.7) w stosunku 1:10 w PBT. Inkubuj embriony w proteinazie K przez 10 min lub dłużej, jeśli embriony są starsze. Przechowuj embriony przykryte folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.
- Po traktowaniu proteinazą K przemyj embriony 5 razy w PBT przez 10 min. Po przemyciu utrwal embriony w 4 % paraformaldehydzie przez 30 min w temperaturze pokojowej na nutatorze. Następnie niezwłocznie przemyj embriony 5 razy w PBT przez 10 min. Przechowuj embriony przykryte folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.
- Przygotuj bufor blokujący, rozcieńczając 5 X bufor blokujący w buforze kwasu maleinowego do stężenia 1 X. Usuń embriony z PBT i umieść je w 1 X buforze blokującym. Przykryj embriony folią aluminiową i inkubuj na nutatorze w temperaturze pokojowej przez 5 do 6 godzin.
- Po 5 do 6 godzinach blokowania poddaj embriony szokowi termicznemu w temperaturze 65 °C przez 15 do 20 min.
- Pobierz roztwór przeciwciał oraz 2 % LS przygotowane poprzedniego dnia. Odwiruj roztwór przeciwciał przy maksymalnej prędkości obrotowej (rpm). Przenieś fazę wodną do probówki z 2 % LS. Odwróć probówkę, aby wymieszać.
- Przenieś embriony z buforu blokującego do mieszaniny LS-przeciwciała. Przechowuj embriony przykryte folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło. Inkubuj embriony na nutatorze w temperaturze 4 °C przez noc.
- Następnego dnia przemyj embriony w temperaturze pokojowej 6 razy przez 15 min w PBT. Przygotuj bufor AP (patrz Preparation of Solutions).
- Przemyj embriony w temperaturze pokojowej 2 razy przez 10 min w buforze AP. Przygotuj roztwór wywoływujący NBT/BCIP (patrz Preparation of Solutions).
- Przenieś embriony do NBT/BCIP. Pozostaw barwnik do wywołania w ciemności.
- Zatrzymaj wywoływanie, przemywając embriony 3 razy w PBT po 5 min każdy.
- W celu akwizycji obrazów zamontuj embriony w 0,6 % niskotopiwym agarozie lub 3 % metylocelulozie i wykonaj zdjęcia za pomocą odwróconego lub pionowego mikroskopu złożonego.
- Próbki fotoaktywowane mogą być przechowywane do późniejszych analiz (barwienie pozostaje stabilne) poprzez ich odwodnienie w stopniużonych przemywaniach EtOH. W celu odwodnienia próbek postępuj zgodnie z krokami od 4.4 do 4.7.
5. Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 1. Fotoaktywacja klatkowanego (caged) dekstranu z fluoresceiną. (A,B) Obraz w jasnym polu i obraz fluorescencyjny zarodka rybki danio w widoku bocznym na etapie 13/14 somitu przed fotoaktywacją. (C,D) Zarodek na etapie 13/14 somitu został poddany fotoaktywacji w jednym z somitów (strzałka) przy użyciu długości fali 740 nm, czasie skanowania 31 s i średniej mocy lasera 47 mW. Po aktywacji (d) obserwuje się fluorescencję uwolnionej fluoresceiny-dekstranu. Orientacja: grzbietowa (prawo), brzuszna (lewo). Pasek skali 100 μm.
Rycina 2. Immunodetekcja klatkowanej fluoresceiny-dekstranu. Rysunek 2 przedstawia immunobarwienie odklatkowanej fluoresceiny-dekstranu w embrionie ryby danio gordona w 18/19 hpf. Na etapie 10 somitów niewielki obszar embrionu w mezodermie płytki bocznej został aktywowany przy użyciu tych samych parametrów lasera, które podano na Rysunku 1. W procedurze immunodetekcji strzałka wskazuje obszar aktywowany przy minimalnym barwieniu tła. Orientacja: Grzbietowa (góra), Brzuszna (dół). Pasek skali 100 μm.
Dyskusja
Niniejsza praca opisuje wszechstronną metodę mapowania losów pojedynczych komórek opartą na fotoaktywacji klatkowanego fluoresceiny-dekstranu. Odklatkowanie fluoresceiny-dekstranu w pojedynczych komórkach odbywa się poprzez absorpcję dwufotonową z laserem femtosekundowym Mai Tai połączonym z konfokalnym mikroskopem Zeiss LSM 510 META. Odklatkowany fluoresceiny-dekstran w fotoaktywowanych komórkach jest szybko wizualizowany przy użyciu prostej procedury immunohistochemicznej.
W niniejszym protokole długość fali absorpcji dwufotonowej dla fotoaktywacji klatkowanego dekstranu z fluoresceiną wynosi 740 nm. Długość fali ta została wyznaczona eksperymentalnie poprzez fotoaktywację klatkowanego dekstranu z fluoresceiną wstrzykniętego do zarodków typu dzikiego. Zmieniano długość fali wzbudzenia laserowego w zakresie od 600 do 800 nm, a następnie jakościowo określano obecność lub brak fluorescencji fluoresceiny po aktywacji. Stwierdzono, że 740 nm generuje najsilniejszy sygnał fluoresceiny po aktywacji. W idealnych warunkach 740 nm powinno być odpowiednie dla wszystkich systemów modelowych; zalecamy jednak przetestowanie zakresu długości fal w celu wyznaczenia optymalnej długości fali wzbudzenia dwufotonowego dla danej próbki.
W embrionach typu dzikiego, do których wstrzyknięto fluoresceinę-dekstran w klatce, dla każdej testowanej długości fali wzbudzenia dwufotonowego zmieniano również średnią moc lasera. Dla długości fali wzbudzenia 740 nm średnia moc lasera 47 mW wygenerowała silniejszy sygnał fluoresceinowy w obszarze aktywowanym w porównaniu do niższych średnich mocy lasera. Wyższe średnie moce lasera nie powodowały silniejszych sygnałów fluoresceinowych, lecz indukowały ablację tkanki. Ponieważ femtosekundowe impulsy laserowe są skuteczne w ablacji tkanek biologicznych15, zalecamy określenie progowej średniej mocy lasera dla fotoaktywacji, która zapobiega ablacji tkanki.
Absorpcja dwufotonowa zachodzi w niewielkiej objętości oddziaływania. Aby zapewnić prawidłową aktywację klatkowanego fluoresceiny-dekstranu, komórka musi zostać odpowiednio ustawiona w ognisku. W powyższym protokole komórki GFP-dodatnie obrazowano jednocześnie w świetle białym, aby potwierdzić ostrość obrazu komórki. Dlatego zaleca się akwizycję w świetle białym oprócz pozostałych kanałów. Po potwierdzeniu ostrości obrazu komórki nasz protokół sugeruje powiększenie aktywowanej komórki. Sugerowany współczynnik powiększenia wynosi od 50 do 70, jednak wartość ta zależy od rozmiaru wybranej komórki. Zwiększenie powiększenia izoluje aktywowaną komórkę od komórek sąsiednich i ogranicza obszar skanowania dla aktywacji dwufotonowej. Idealnie obszar skanowania powinien obejmować znaczną część komórki.
Wykrywanie pojedynczych aktywowanych komórek wymaga zminimalizowania barwienia tła. W powyższym protokole immunodetekcji ważne jest, aby próbkę blokowano w buforze blokującym przez 5 do 6 godzin (krok 4.13). Podczas wywoływania z użyciem NBT/BCIP, nieuwięziony flurosecyna-dekstran powinien stać się widoczny w ciągu 10 do 20 min. Jeśli barwienie tła jest silne, sugerujemy wydłużenie czasu blokowania oraz wykonanie dodatkowych przemyć w celu usunięcia przeciwciał (krok 4.17).
Ryciny 1 i 2 przedstawiają reprezentatywne wyniki fotoaktywacji i immunodetekcji. Na Rycini 1 wczesne embriony typu dzikiego w stadium 1-2 komórek zostały wstrzyknięte klatkowanym fluoresceina-dekstranem. Embriony hodowano do etapu środkowej somitogenezy, a następnie osadzono w agarozie niskotopliwej w orientacji bocznej. Rycina 1(a,b) przedstawia obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencyjne embrionu przed fotoaktywacją. Dowodem na to, że fluoresceina pozostała w formie klatkowanej, jest brak fluorescencji fluoresceiny na Rycini 1(b). Mały obszar w obrębie somitu został aktywowany długością fali 740 nm przez 31 s przy średniej mocy lasera 47 mW, Rycina 1(c; strzałka). Po aktywacji nastąpiło dwufotonowe uwalnianie fluoresceina-dekstranu, co potwierdza fluorescencja z obszaru aktywowanego, Rycina 1(d; strzałka). Aktywacja nie wiązała się z ablacją laserową, ponieważ tkanka somityczna pozostała nienaruszona, Rycina 1(c). Rycina 2 obrazuje immunodetekcję uwolnionego fluoresceina-dekstranu. Mały obszar w mezodermie płytki bocznej embrionu w stadium 10 somitów został poddany fotoaktywacji przy użyciu tych samych parametrów lasera, które wspomniano przy Rycini 1. Embrion hodowano i przetwarzano zgodnie z krokami od 4.1 do 4.20. Strzałka na Rycini 2 wskazuje obszar aktywowany, co objawia się gromadzeniem niebieskiego osadu. Wyłącznie miejsce aktywowane jest wyraźnie wykrywane bez zakłócającego barwienia tła.
Przygotowanie roztworów:
1 X PBT (1 L)
100 mL 10 X PBS
2 g BSA
10 mL 20 % Tween
10 X PBS (1 L)
80 g NaCl
2 g KCl
6,1 g Na2HPO4
1,9 g KH2PO4
ddH2O do 1 L
pH do 7,3
4 % Paraformaldehydu (160 mL)
32 % Paraformaldehydu (dwie fiolki po 10 mL)
8 mL 20 X PBS
132 mL ddH2O
Bufor AP ( 50 mL)
1 mL 5 M NaCl
2,5 mL 1 M MgCl2
5 mL 1 M Tris pH 9,5
250 μL 20 % Tween
41,25 mL ddH2O
Roztwór przeciwciał (na 1 próbkę)
5,5 μL proszku acetonu
40 μL PBT
0,8 μL LS
0,1 μL przeciwciał anty-fluoresceina-AP
2 % LS (360 μL na 1 próbkę)
7,2 μL 100 % LS
352,8 μL PBT
Pożywka Danieau 1X (1 L)‡
11,6 mL 5 M NaCl
700 μL 1 M KCl
400 μL 1 M MgSO4
600 μL 1 M Ca(NO3)2
5 mL 1 M HEPES
ddH2O do 1 L
dostosować pH do 7,6
‡ Roztwór Danieau jest idealnym roztworem soli do hodowli zdechorionowanych zarodków zebrafish. Można stosować inne media, pod warunkiem, że są to roztwory izotoniczne o odpowiedniej osmolarności (~ 300 mOsm dla zebrafish)
Roztwór zapasowy NBT (1 mL)
50 mg Nitro Blue Tetrazolium
0,7 mL bezwodnego dimetyloformamidu
0,3 mL ddH2O
Roztwór zapasowy BCIP (1 mL)
50 mg 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate
1 mL bezwodnego dimetylformamidu
Roztwór wywołujący NBT/BCIP
1 mL buforu AP
4,5 μL roztworu zapasowego NBT
3,5 μL roztworu zapasowego BCIP
Proszek acetonowy
- Wybrać 20 dorosłych ryb i zamrozić je w ciekłym azocie.
- Rozetrzeć zamrożone ryby w moździerzu z tłuczkiem na proszek.
- Przenieść proszek z ryb do stożkowatej probówki o pojemności 50 mL.
- Wypełnić probówkę stożkowatą 100 % acetonem. Poddać próbkę działaniu wirówki typu vortex.
- Wirować próbkę z maksymalną prędkością obrotową przez 10 mins. Odrzucić nadsącz.
- Przemyć osad dodatkowo 3 razy w 100 % acetonie i wirować probówkę z maksymalną prędkością obrotową przez 10 mins. Po ostatnim przemyciu nadsącz powinien być klarowny.
- Ponownie dodać do osadu 100 % aceton i pozostawić probówkę w temperaturze pokojowej. Gęstsze cząstki opadną na dno, natomiast drobniejsze pozostaną w zawiesinie.
- Zdekantować drobne cząstki do nowej probówki. Rozdzielić roztwór proszku na aalikwoty w osobnych probówkach i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy J. Chen za udostępnienie protokołu syntezy klatkowanej fluroscyny-dekstranu. Badania te były wspierane przez grant March of Dimes nr 5-FY09-78, grant American Heart Association nr 09BGIA2090075 oraz grant NIH / NHLBI nr R01 HL107369-01 przyznany S.S. Szczególne podziękowania kierujemy do C. Closson za pomoc w zakresie mikroskopii.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Fluoresceina SE klatkowana CMNB | Invitrogen | C20050 | |
| Aminodekstran 10 kDa | Invitrogen | D1860 | |
| Kolumna do odsalania Zeba Desalt Spin Column | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| Agaroza niskotopliwa | Amresco | 0815-100G | |
| Boran sodu | Amresco | 1131117-100G | |
| Metanosulfonian tricainy/ MS222 | Research Organics | 1347A | |
| Przeciwciało anty-fluoresceina-AP | Roche Group | 11376622 | |
| Bufor blokujący | Roche Group | 11 096 176 001 | |
| Kwas maleinowy | Sigma-Aldrich | MO375-500G | |
| Paraformaldehyd | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| NBT | Sigma-Aldrich | I8377-250mg | |
| BCIP | Fisher Scientific | PI-34040 | |
| Mikroinjektor | Harvard Apparatus | PLI-2000 | |
| Klawiczki z komorą LabTek | Nalge Nunc international | 155380 | |
| Proteinaza K | Invitrogen | AM2544 | |
| Surowica jagnięca | Invitrogen | 16070096 | |
| LSM 510 META NLO | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Obiektyw apochromatyczny 20X 0,8 NA Air | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Przezroczysty żółty filtr | Theatre House Inc. | Arkusz filtra Roscolux Kolor: 312 |
Bibliografia
- Mathur, J. mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants. Plant physiology. 154, 1573-1587 Forthcoming.
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).
- Subach, F. V. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature. 6, 153-159 (2009).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nature protocols. 1, 960-967 (2006).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Watanabe, W. Single-organelle tracking by two-photon conversion. Optics express. 15, 2490-2498 (2007).
- Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation. Developmental cell. 16, 744-755 (2009).
- Chudakov, D. M. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nature. 21, 191-194 (2003).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
- Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery. Nature. 414, 216-220 (2001).
- Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula. Nature. 443, 337-339 (2006).
- Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).
- Niemz, M. H. Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications. , Springer. (2003).
- Jowett, T. Analysis of protein and gene expression. Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).
Przedruki i uprawnienia
