Obrazowanie in vitro w czasie rzeczywistym rozgałęzień aksonalnych w neuronach korowych myszy

Streszczenie

Źródło: Winkle, C. C., et al. Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film przedstawia technikę obrazowania na żywo z wykorzystaniem mikroskopii różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) do obserwacji rozgałęzień aksonalnych w czasie rzeczywistym w neuronach korowych. Filmy poklatkowe ukazują efekty leczenia netryną-1, cząsteczką sygnałową, która indukuje zlokalizowaną egzocytozę i rearanżacje cytoszkieletu w aksonach. Procesy te inicjują wypukłości błony, które rozwijają się w dojrzałe gałęzie aksonów, zapewniając wgląd w rozwój neuronów.

Protokół

1. Różnicowy kontrast interferencyjny (DIC) Mikroskopia poklatkowa rozgałęzień aksonów

Uwaga: Chociaż ten protokół wykorzystuje DIC, inne metody mikroskopii światła przechodzącego mogą być używane do tych samych celów (na przykład: kontrast fazowy).

1. Po 2 dniach in vitro (DIV) umieść szklane naczynie do obrazowania zawierające nietransfekowane neurony we wstępnie ogrzanej komorze środowiskowej, aby utrzymać wilgotne środowisko z 5% CO2 i 37 °C. Użyj mikroskopu wyposażonego w 60-krotny planapochromat, soczewkę obiektywową DIC o aperturze numerycznej 1,4 (NA) i kondensor o wysokiej NA, aby uzyskać najlepszą jakość i rozdzielczość obrazu.
2. Dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aby znaleźć neurony przez okulary za pomocą oświetlenia światłem przechodzącym.
3. Korzystając z funkcji akwizycji wielu obszarów w oprogramowaniu do obrazowania, znajdź i zapisz lokalizacje XYZ co najmniej 6 komórek. Ustaw stolik tak, aby interesujące go neurony mieściły się w polu widzenia, aby uzyskać najlepsze wyniki.
   1. Stymuluj 250 ng/ml netrin-1 i naciśnij 'rozpocznij akwizycję wielu obszarów'. Sekwencyjnie rejestruj obrazy w każdej pozycji co 20 sekund przez 24 godziny, zatrzymując akwizycję i ponownie ustawiając ostrość w razie potrzeby.
4. Przeglądanie obrazów w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu za pomocą opcji Apps>Review Multi Dimensional Data>open file name. Zidentyfikuj stabilne gałęzie aksonów (o długości 20 μm), które tworzą się podczas sesji obrazowania. Użyj narzędzia do rysowania linii, aby zmierzyć stabilną gałąź aksonu od podstawy aksonu do końcówki, aby upewnić się, że spełnione są wymagania dotyczące długości 20 μm.
   1. W arkuszu kalkulacyjnym zapisz numer klatki po stymulacji netryny, gdy wystające membrany zaczynają się w obszarach, gdzie później tworzą się gałęzie, a także numer klatki po stymulacji netryny, gdy powstające gałęzie osiągają 20 μm długości.
   2. Pomnóż liczbę ramek między występem a formacją gałęzi przez 20 sekund, aby obliczyć czas formowania na gałąź.

Materiały