Dwufotonowe obrazowanie in vivo dynamiki mikrogleju w hipokampie myszy

Streszczenie

Źródło: Kamei, R., et al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)

Film przedstawia proces konfiguracji i obrazowania do mikroskopii dwufotonowej in vivo dynamiki mikrogleju w hipokampie CA1 (Cornu ammonis 1) i zakręcie zębatym, zapewniając optymalne wyrównanie optyczne i ocenę integralności strukturalnej.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju in vivo przy użyciu myszy CX3CR1-GFP

1. Po indukcji znieczulenia umyj wnętrze metalowej rurki sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć zanieczyszczenia. Upewnij się, że biały pęcherzyk hipokampa jest widoczny przez szkło (ryc. 1A) i że nie ma żadnych powikłań, takich jak krwawienie pooperacyjne.
2. Ustaw mysz pod mikroskopem dwufotonowym w następujących krokach:
   1. Ustaw mysz w urządzeniu do trzymania głowy pod obiektywem mikroskopu dwufotonowego i na zmotoryzowanym stoliku skanującym XY. Użyj poduszki grzewczej do wsparcia termicznego. Monitoruj i dostosuj głębokość znieczulenia, ponieważ ta kontrola jakości może potrwać do 30 minut. nuta: Zalecana jest soczewka obiektywowa zanurzająca się w wodzie o odległości roboczej (WD) większej niż 3 mm i dużej przysłonie numerycznej (NA). Kołnierz korekcyjny soczewki obiektywu może poprawić rozdzielczość, kompensując niedopasowanie współczynnika załamania światła między szkłem a biomateriałami.
   2. Wypełnij przestrzeń między szkłem a soczewką obiektywu wodą, zwracając szczególną uwagę, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby rozszerz obszar metalowej płytki za pomocą folii z tworzywa sztucznego, która zatrzymuje więcej wody, aby pokryć całą przednią soczewkę obiektywu.
   3. Włącz femtosekundowy laser impulsowy o długości fali 920 nm w celu wzbudzenia sond fluorescencyjnych wyrażonych w mózgu i uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu.
   4. Dostosuj ostrość do CA1 (Cornu Ammonis 1) za pomocą zmotoryzowanego stage i zmotoryzowanego systemu ustawiania ostrości. Ustaw strukturę docelową pod kierunkiem fluorescencji emitowanej przez miąższ mózgu i światła odbitego od krawędzi metalowej rurki pod ciągłym oświetleniem lasera impulsowego.
   5. Zmierz głębokość miąższu mózgu dotykającego szklanego dna, regulując ostrość za pomocą zmotoryzowanego systemu ustawiania ostrości. Porównaj głębokości w różnych miejscach poziomych, aby ocenić wyrównanie szklanego dna i płaszczyzny obrazowania.
      1. Dostosuj kąt nachylenia głowicy myszy, przechylając urządzenie trzymające głowę, aż szklane dno zostanie ustawione tak, aby było równoległe do płaszczyzny obrazowania.
   6. Dostosuj kołnierz korekcyjny obiektywu, aby uzyskać najwyższą rozdzielczość na głębokości struktury docelowej w CA1.
3. Sprawdź jakość i intensywność obrazów uzyskanych przez dwufotonowe wzbudzenie hipokampa (ryc. 1B).
   UWAGA: Pogorszenie obrazu wskazuje na obecność uszkodzenia tkanki wewnątrz mózgu.
4. Upewnij się, że mikroglej już odzyskał swoją rozgałęzioną morfologię (ryc. 1C).
   UWAGA: Dane obrazowe mikrogleju wskazują, że potrzeba co najmniej 3-4 tygodni, aby mikroglej powrócił do stanu podstawowego.
5. Wykonaj obrazowanie in vivo w dowolnych warstwach CA1 dla określonego celu eksperymentu.

Wyniki

Rysunek 1: Obrazowanie in vivo mikrogleju u myszy CX3CR1-GFP w fazie przewlekłej. (A) Reprezentatywny wygląd wszczepionego okna na prawym grzbietowym CA1 (Cornu Ammonis 1) w fazie przew...

Materiały