Dwufotonowe obrazowanie in vivo dynamiki mikrogleju w hipokampie myszy

Streszczenie

Źródło: Kamei, R., et al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)

Film przedstawia proces konfiguracji i obrazowania do mikroskopii dwufotonowej in vivo dynamiki mikrogleju w hipokampie CA1 (Cornu ammonis 1) i zakręcie zębatym, zapewniając optymalne wyrównanie optyczne i ocenę integralności strukturalnej.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju in vivo przy użyciu myszy CX3CR1-GFP

1. Po indukcji znieczulenia umyj wnętrze metalowej rurki sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć zanieczyszczenia. Upewnij się, że biały pęcherzyk hipokampa jest widoczny przez szkło (ryc. 1A) i że nie ma żadnych powikłań, takich jak krwawienie pooperacyjne.
2. Ustaw mysz pod mikroskopem dwufotonowym w następujących krokach:
   1. Ustaw mysz w urządzeniu do trzymania głowy pod obiektywem mikroskopu dwufotonowego i na zmotoryzowanym stoliku skanującym XY. Użyj poduszki grzewczej do wsparcia termicznego. Monitoruj i dostosuj głębokość znieczulenia, ponieważ ta kontrola jakości może potrwać do 30 minut. nuta: Zalecana jest soczewka obiektywowa zanurzająca się w wodzie o odległości roboczej (WD) większej niż 3 mm i dużej przysłonie numerycznej (NA). Kołnierz korekcyjny soczewki obiektywu może poprawić rozdzielczość, kompensując niedopasowanie współczynnika załamania światła między szkłem a biomateriałami.
   2. Wypełnij przestrzeń między szkłem a soczewką obiektywu wodą, zwracając szczególną uwagę, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby rozszerz obszar metalowej płytki za pomocą folii z tworzywa sztucznego, która zatrzymuje więcej wody, aby pokryć całą przednią soczewkę obiektywu.
   3. Włącz femtosekundowy laser impulsowy o długości fali 920 nm w celu wzbudzenia sond fluorescencyjnych wyrażonych w mózgu i uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu.
   4. Dostosuj ostrość do CA1 (Cornu Ammonis 1) za pomocą zmotoryzowanego stage i zmotoryzowanego systemu ustawiania ostrości. Ustaw strukturę docelową pod kierunkiem fluorescencji emitowanej przez miąższ mózgu i światła odbitego od krawędzi metalowej rurki pod ciągłym oświetleniem lasera impulsowego.
   5. Zmierz głębokość miąższu mózgu dotykającego szklanego dna, regulując ostrość za pomocą zmotoryzowanego systemu ustawiania ostrości. Porównaj głębokości w różnych miejscach poziomych, aby ocenić wyrównanie szklanego dna i płaszczyzny obrazowania.
      1. Dostosuj kąt nachylenia głowicy myszy, przechylając urządzenie trzymające głowę, aż szklane dno zostanie ustawione tak, aby było równoległe do płaszczyzny obrazowania.
   6. Dostosuj kołnierz korekcyjny obiektywu, aby uzyskać najwyższą rozdzielczość na głębokości struktury docelowej w CA1.
3. Sprawdź jakość i intensywność obrazów uzyskanych przez dwufotonowe wzbudzenie hipokampa (ryc. 1B).
   UWAGA: Pogorszenie obrazu wskazuje na obecność uszkodzenia tkanki wewnątrz mózgu.
4. Upewnij się, że mikroglej już odzyskał swoją rozgałęzioną morfologię (ryc. 1C).
   UWAGA: Dane obrazowe mikrogleju wskazują, że potrzeba co najmniej 3-4 tygodni, aby mikroglej powrócił do stanu podstawowego.
5. Wykonaj obrazowanie in vivo w dowolnych warstwach CA1 dla określonego celu eksperymentu.

Wyniki

Rysunek 1: Obrazowanie in vivo mikrogleju u myszy CX3CR1-GFP w fazie przewlekłej. (A) Reprezentatywny wygląd wszczepionego okna na prawym grzbietowym CA1 (Cornu Ammonis 1) w fazie przew...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
A femtosekundowy laser impulsowy	Spectra-Physics	MaiTai Deep See	A Ti:Sapphire laser używany na długości fali 920 nm.
Mikroskop dwufotonowy	Nikon	A1R MP+	Microscope do obrazowania CA1.
Soczewka obiektywowa do obrazowania dwufotonowego	Olympus	XLPLN25XSVMP	obiektyw 25× o dużej odległości roboczej, dużej aperturze numerycznej i kołnierzu korekcyjnym
Płytki aluminiowe	Narishige	CP-1	Płytki wykonane z alminum do mocowania głowy.
Szkiełka nakrywkowe okrągłe	Matsunami Glass	3φ No.1	Szkiełka nakrywkowe przyklejane do rurek ze stali nierdzewnej.
Myszy CX3CR1-GFP	Jackson Laboratory	8451	Myszy transgeniczne do obrazowania mikrogleju.
Cylindryczne rurki ze stali nierdzewnej	MORISHITA	Wykonane na zamówienie	rurki metalowe do implantacji. Średnica zewnętrzna 3,0 mm, średnica wewnętrzna 2,8 mm, wysokość 1,7 mm.
Cement z żywicy dentystycznej (Super-Bond C&B)	Sun Medical	204610555	Cement dentystyczny.
Urządzenie do trzymania głowy	Narishige	MAG-2	Urządzenie do trzymania głowy myszy z regulatorami kąta
Poduszka grzewcza	Bio Research Center	BWT-100A i HB-10	Narzędzia zapewniające wsparcie termiczne myszy podczas operacji.
Poduszka grzewcza	ALA Scientific	HEATINGPAD-1 i Hot-1	Tools zapewniające termiczne wsparcie myszy na urządzeniu trzymającym głowę.
Ketamina (Ketalar)	Daiichi Sankyo Company	S9-001665	Znieczulenie podczas operacji.
Maść okulistyczna	Sato Pharmaceutical		Stosowana w celu zapobiegania suchości oczu podczas zabiegu chirurgicznego.
Roztwór peelingujący powidonu i jodu	Meiji Seika Pharma	2612701Q1137	Służy do dezynfekcji miejsca operowanego.
Mikroskopy stereoskopowe	Leica Microsystems	S8 APO	Mikroskopy do chirurgii.
Sterylna sól fizjologiczna	Fabryka Farmaceutyczna Otsuka	3311401A2026	Roztwór myjący podczas operacji.
Sterylna wodoodporna podkładka	AS ONE	8-5945-01	Platforma chirurgiczna.
Ksylazyna (Celactal 2%)	Znieczulenie	Bayera

podczas zabiegu.