Ocena neuroprotekcyjnego wpływu kwaśnego kondycjonowania końcowego w mysim modelu niedokrwienia mózgu

Abstract

Źródło: Zheng, Y., et al. Modele eksperymentalne do badania neuroprotekcji kwaśnego kondycjonowania końcowego przed niedokrwieniem mózgu. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film przedstawia zastosowanie kwaśnego kondycjonowania końcowego (APC) w celu oceny jego neuroprotekcyjnego działania przeciwko uszkodzeniu niedokrwiennemu w mysim modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO). Przedstawiono w nim etapy związane z reperfuzją w modelu MCAO i zastosowaniem APC podczas reperfuzji w celu złagodzenia ekscytotoksyczności, stresu oksydacyjnego i śmierci neuronów.

Protocol

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Niedrożność tętnicy środkowej mózgu (MCAO):
   1. Umieść i zamocuj znieczuloną mysz (z sondą do laserowego dopplerowskiego przepływomierza (LDF) przymocowaną do czaszki) w pozycji leżącej na plecach i utrzymuj temperaturę ciała za pomocą lampy grzewczej przez cały czas trwania operacji. Zdezynfekuj szyję 70% alkoholem etylowym.
   2. Wykonaj przyśrodkowe nacięcie skóry na szyi za pomocą skalpela; tępo wypreparuj tkanki miękkie kleszczami, aby odsłonić naczynia. Dodaj jedną kroplę soli fizjologicznej do odsłoniętych tkanek, aby je nawodnić.
   3. Wyciąć tętnicę szyjną wspólną z otaczającej tkanki i nerwu błędnego za pomocą kleszczy okulistycznych. Uważaj, aby nie uszkodzić nerwu błędnego. Ponownie zdezynfekuj skórę szyi jodoforem po odsłonięciu tętnicy szyjnej wspólnej.
   4. Umieść zacisk mikronaczynia na dystalnym końcu tętnicy szyjnej wspólnej, a następnie zawiąż martwy węzeł za pomocą jedwabnych szwów 6-0 na bliższym końcu. Umieść clamp jak najbardziej proksymalnie do kolejnych operacji. Upewnij się, że długość naczynia między zaciskiem a martwym węzłem jest jak najdłuższa dla kolejnych operacji.
   5. Wykonaj tymczasowy szew proksymalny do zacisku, zawiązując luźny węzeł. Upewnij się, że między dwoma węzłami jest wystarczająco dużo miejsca na włożenie żyłki.
   6. Wykonaj małe podłużne nacięcie między dwoma węzłami za pomocą nożyczek mikrookulistycznych. Upewnij się, że nacięcie znajduje się jak najbliżej martwego węzła dla kolejnych operacji. Uważaj, aby nie odciąć naczynia.
   7. Przełóż przez nacięcie 12-milimetrową żyłkę końcówką, aby wejść do światła tętnicy i przesunąć ją o kilka mm. Zaciśnij luźny węzeł wokół końcówki żyłki, a następnie zdejmij zacisk.
   8. Wsuń włókno do tętnicy szyjnej wewnętrznej (10 mm, aby zamknąć tętnicę środkową mózgu) za pomocą kleszczyków okulistycznych, aż oprogramowanie LDF wykaże gwałtowny spadek (>80% zmniejszenie w stosunku do wyjściowego przepływu krwi). Zapisz czas rozpoczęcia okluzji.
   9. Niedrożność tętnicy środkowej mózgu na 1 godzinę. Odciąć sondę LDF i umieścić myszy w inkubatorze o temperaturze 30 °C na czas okluzji.
2. Reperfuzja i kondycjonowanie kwasowe (APC):
   1. Ponownie znieczulić zwierzęta izofluranem, jak opisano powyżej, 55 minut po rozpoczęciu okluzji. Umieść i unieruchom myszy w pozycji leżącej. Otwórz nacięcie szyi i ponownie odsłoń tętnicę szyjną wspólną.
   2. Delikatnie wyciągnij włókno za pomocą kleszczyków okulistycznych po okresie okluzji, aby uzyskać reperfuzję i zamień szew tymczasowy w stały, zaciskając węzeł.
   3. W leczeniu kwasicy należy zmienić gaz wdychany przez stożek nosowy na mieszaninę gazów zawierających 20% CO₂, 20% O₂ i 60% N₂ przez 5 minut po 5, 50 lub 100 minutach po reperfuzji. Zamknij nacięcie przerwanym szwem chirurgicznym.
   4. Umieść myszy w klatce grzewczej o temperaturze 30 °C, aż myszy odzyskają przytomność, a następnie zwróć myszy do czystych, oddzielnych klatek. Zapewnij myszom szalkę Petriego z wodą i zwilżonym pokarmem. Uważnie monitoruj myszy po operacji pod kątem nadmiernego bólu i śmierci.

Materials