Obrazowanie szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwowych myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej

Streszczenie

Źródło: Zhilyakov, N. V. et al., Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film przedstawia technikę obrazowania polegającą na rejestrowaniu szybkich stanów przejściowych wapnia na zakończeniach nerwowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Stymulując nerw i wychwytując zmiany fluorescencji spowodowane barwnikami wiążącymi wapń, wizualizuje dynamiczny napływ i usuwanie wapnia na końcu nerwu, oferując precyzyjny wgląd w aktywność synaptyczną i sygnalizację nerwowo-mięśniową.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

Doświadczenia przeprowadzono na izolowanych preparatach nerwowo-mięśniowych dźwigacza auris długiego (m. LAL) od myszy BALB/C (20-23 g, 2-3 miesiące).

1. Przygotowanie roztworu Ringera i roztworu Ringera

1. Przygotuj roztwór Ringera dla mięśni ssaków, mieszając następujące składniki: chlorek sodu, NaCl (137 mM), chlorek potasu, KCl (5 mM), chlorek wapnia, CaCl₂ (2 mM), MgCl₂ (1 mM), NaH₂PO₄ (1 mM), NaHCO₃ (11,9 mM) i glukoza (11 mM). Przepuścić przez roztwór z 95% tlenem (_O2) i 5% dwutlenkiem węgla (CO₂) i dostosować jego pH do 7,2-7,4, dodając kwas solny / wodorotlenek sodu (HCl / NaOH), jeśli to konieczne.
2. Przygotuj roztwór do ładowania barwnika.
   1. Przygotuj roztwór kwasu (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) (10 mM) o pH w zakresie 7,2-7,4. 500 μg barwnika handlowego znajduje się w fiolce o pojemności 500 μL. Rozpuścić barwnik w 14 μl roztworu HEPES, aby uzyskać stężenie barwnika 30 mM. Dobrze wstrząsnąć i odwirować aż do całkowitego rozpuszczenia.
   2. Rozcieńczyć roztwór wskaźnika Ca²⁺ roztworem HEPES do stężenia 1 mM. Przechowywać w zamrażarce (-20 °C) i unikać ekspozycji na światło.

2. Procedura ładowania barwnika

UWAGA: Procedura ładowania barwnika jest wykonywana zgodnie z protokołem ładowania przez kikut nerwu, dostosowanym do wcześniej opublikowanych protokołów.

1. Wypreparować mięsień LAL zgodnie z procedurą preparacji dla tego preparatu, opisaną we wcześniej opublikowanych protokołach.
   1. Lekko rozciągniętą tkankę (nie więcej niż 30% od początkowej długości) umocować na pokrytej elastomerem szalce Petriego za pomocą drobnych szpilek ze stali nierdzewnej i dodawać roztwór Ringera, aż mięsień zostanie całkowicie pokryty.
      UWAGA: Szalka Petriego została wstępnie wypełniona elastomerem zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
2. Przygotuj pipetę do napełniania
   1. Za pomocą ściągacza do mikropipet (patrz Tabela materiałów), przygotuj mikropipetę z cienką końcówką, która jest jak najbardziej ostra dla nagrań wewnątrzkomórkowych. Używaj kapilar bez wewnętrznych włókien (1.5 mm średnicy zewnętrznej i 0.86 lub 1.10 mm średnicy wewnętrznej).
   2. Odłamać końcówkę mikropipety po nacięciu stożka materiałem ściernym, pozostawiając końcówkę otwartą do średnicy około 100 μm. Wypoleruj końcówkę na gorąco, aby ograniczyć czas, gdy średnica wewnętrzna zmniejsza się z >80 μm do 12-13 μm. Podłącz silikonową rurkę po jednej stronie pipety napełniającej, a strzykawkę (bez igły) po drugiej stronie.
3. Pod mikroskopem stereoskopowym znajdź miejsce, w którym pień nerwowy zamienia się w oddzielne gałęzie nerwowe. Umieścić pipetę napełniającą z zamontowaną rurką i strzykawką na szalce Petriego za pomocą wosku. Przesuń końcówkę pipety, aż znajdzie się nad nerwem.
4. Cienkimi nożyczkami przetnij nerw blisko włókna mięśniowego, pozostawiając mały kawałek kikuta nerwu o długości około 1 mm. Delikatnie zassać kikut nerwu razem z odrobiną roztworu Ringera, nie ściskając go, do końcówki pipety napełniającej. Wyjmij silikonową rurkę z pipety napełniającej.
5. Pobrać pewną ilość roztworu obciążającego barwnik (~0,3 μL) za pomocą strzykawki z długim filamentem. Objętość ta odpowiada około 3 cm żarnika.
   UWAGA: Początkowo konieczne jest wykonanie żarnika z końcówki pipety o objętości 10 μl, ciągnąc za ogień za pomocą lampy alkoholowej lub palnika gazowego.
6. Delikatnie włóż końcówkę filamentu z roztworem ładującym do pipety napełniającej. Uwolnij mieszaninę bezpośrednio na kikut nerwu. Preparat inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.
7. Następnie przepłukać preparat świeżym roztworem Ringera i inkubować w temperaturze 25 °C przez maksymalnie 2 godziny w szklanej zlewce z 50 ml (lub więcej) roztworu Ringera (preparat musi być pokryty roztworem). W tym czasie barwnik dotrze do synaps.

3. Rejestracja wideo za pomocą mikroskopii konfokalnej

UWAGA: Rejestracja stanów przejściowych wapnia odbywa się za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (LSCM) (patrz tabela materiałów). Do rejestracji szybkich stanów przejściowych wapnia wykorzystano oryginalny protokół, który pozwalał na rejestrację sygnałów o wystarczającej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Mikroskop został wyposażony w obiektyw z 20-krotnym zanurzeniem w wodzie (apertura numeryczna 1,00 (NA)). Linię lasera o długości fali 488 nm osłabiono do 10% intensywności, a fluorescencję emisyjną zebrano od 503 do 558 nm.

1. Zamontuj preparat w komorze doświadczalnej pokrytej elastomerem silikonowym i przymocuj ją, lekko rozciągniętą, za pomocą zestawu stalowych mikroigieł. Preparat należy dokładnie przepłukać roztworem Ringera.
   UWAGA: Zastosowano prostą, wykonaną na zamówienie perfuzyjną komorę doświadczalną wykonaną ze szkła organicznego, której dno komory pokryte było elastomerem (przygotowanym zgodnie z instrukcją producenta; patrz Tabela Materiałów). W komorze znajduje się rurka doprowadzająca roztwór. Roztwór wypompowuje się za pomocą igły strzykawkowej, zamontowanej na uchwycie magnetycznym (patrz tabela materiałów). Jako komorę doświadczalną można by użyć szalki Petriego (takiej jak ta używana do inkubacji preparatu), ale z dołączonymi rurkami zasilającymi i ssącymi.
2. Zainstaluj elektrodę ssącą, która będzie używana do stymulacji nerwu.
   UWAGA: Umieść i zamocuj elektrodę, woskując ją obok wanny. Przesuń końcówkę blisko kikuta nerwu i zassaj ją do elektrody.
3. Zamontuj komorę przygotowawczą na stoliku mikroskopu i umieść w komorze złączki wlotowe i wylotowe.
4. Aby ukrwić preparat, należy użyć prostego systemu napędzanego przepływem grawitacyjnym. Włącz perfuzyjną pompę ssącą, aby usunąć nadmiar roztworu.
5. Podłącz stymulującą elektrodę ssącą do stymulatora elektrycznego i upewnij się, że po stymulacji wystąpią skurcze mięśni. Patrz punkty 3.9-3.12 w celu zapoznania się z warunkami stymulacji i rejestracją.
6. Napełnij system perfuzyjny roztworem Ringera z d-tubokuraryną (10 μM).
   UWAGA: Ten roztwór pomaga zapobiegać skurczom mięśni. D-tubokuraryna lub specyficzne dla alfa-bungarotoksyny blokery nikotynowych receptorów acetylocholiny na błonie postsynaptycznej całkowicie lub częściowo blokują skurcze mięśni50. Ponadto, w celu zapobiegania skurczom mięśni, można zastosować specyficzne blokery postsynaptycznych kanałów sodowych, takie jak μ-konotoksyna GIIIB51.
7. Włączyć perfuzyjną pompę ssącą i rozpocząć perfuzję preparatu roztworem Ringera zawierającym d-tubokurarynę.
8. Ustaw parametry obrazowania w oprogramowaniu LSCM w następujący sposób.
   1. W oprogramowaniu LCM (LAS, AF; patrz Tabela materiałów), wybierz Elektrofizjologia.
      UWAGA: W tym trybie, gdy obraz jest rejestrowany w punkcie czasowym, impuls synchronizujący jest wysyłany do stymulatora za pomocą pola wyzwalającego. Powoduje to wytwarzanie potencjału czynnościowego w preparacie (ryc. 1; jednostka stymulująca).
   2. Wybierz tryb akwizycji. Aby wyzwolić stymulator za pomocą impulsu synchronizacji mikroskopu, w ustawieniach menu Zadanie wybierz ustawienia wyzwalania. Ustaw pole Wyzwalaj przy klatce na kanał out1.
   3. Użyj następujących ustawień: Tryb skanowania: XYT, Częstotliwość skanowania: 1400 Hz, Współczynnik powiększenia: 6.1, Otwór: całkowicie otwarty. Upewnij się, że włączony jest dwukierunkowy tryb X z sekwencyjnym trans-passingiem.
   4. Ustaw minimalny czas tworzenia klatki na 52 ms i klatki do zebrania w filmie RAW na 20 klatkach.
      UWAGA: Te ustawienia umożliwiają przechwytywanie obrazu w rozdzielczości 128 x 128 pikseli przy wykonywaniu pojedynczej klatki co 52 ms.
   5. Ustaw długość fali wzbudzenia lasera argonowego na 488 nm z 8% mocy wyjściowej.

Naciśnij przycisk Live Mode, aby przełączyć się w tryb Live, który pomaga uzyskać podgląd zakończeń nerwowych załadowanych barwnikiem.

9. Jednostka stymulacji
   UWAGA: To urządzenie pozwala na ustawienie czasowych parametrów stymulacji za pomocą oprogramowania MATLAB.
   1. Utwórz nowy plik, wklej kod z w/w artykułu do okna kodu MatLab i zapisz plik. Kliknij Uruchom, aby pojawiło się okno z parametrami stymulacji. Ustaw czas opóźnienia i czas trwania bodźca.
      UWAGA: Opóźnienie określa rozdzielczość czasową odtworzonego sygnału fluorescencyjnego. Impuls elektryczny o czasie trwania 0,2 ms jest opóźniony, a następnie wysyłany do jednostki izolacyjnej. Ten ostatni kształtuje amplitudę i biegunowość impulsu stymulującego i elektrycznie izoluje obiekt biologiczny od urządzenia rejestrującego.
   2. Aby stymulować nerw, wybierz supramaksymalną amplitudę impulsu stymulującego (25%-50% większą niż maksymalna intensywność stymulacji niezbędna do aktywacji wszystkich włókien nerwowych).
      UWAGA: Przedstawiona metoda opiera się na specjalnym algorytmie rejestracji pojedynczych szybkich sygnałów fluorescencyjnych za pomocą LSCM ze zminimalizowanym przemiataniem . Na każdym kroku opracowanego algorytmu zarejestrowany sygnał fluorescencyjny jest przesuwany w stosunku do poprzedniego o przedział czasowy krótszy niż przemiatanie mikroskopowe. Wartość przesunięć w czasie określa rozdzielczość czasową wymaganego sygnału. Liczba kroków (przesunięć) w algorytmie zależy od wymaganej rozdzielczości czasowej i pierwotnej rozdzielczości czasowej. Przy tej metodzie rejestracji stymulacja preparatu odbywa się z częstotliwością 0,25 Hz.
10. W trybie na żywo wyszukaj zwrot z inwestycji i uzyskaj najlepszą ostrość. Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych.
11. Przesuń opóźnienie na stymulatorze o 2 ms mniej w stosunku do poprzedniej wartości i uruchom oprogramowanie do akwizycji danych.
12. Powtórz krok 3.11 26 razy, aby uzyskać 26 sekwencji, z których każda jest przesunięta o 2 ms w stosunku do poprzedniej.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat konfiguracji eksperymentalnej. 1. Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny (LSCM). 2. Moduł synchronizacji LSCM (skrzynka spustowa). 3. Stymulator. 4. Jednostka izolacyjna. 5. Próbka biologiczna. 6. Elektroda ssąca do elektrycznej stymu...

Materiały