Ocena leczenia osoczem pod ciśnieniem atmosferycznym w komórkach nerwiaka zarodkowego pozbawionego glukozy

Streszczenie

Źródło: Yan, X., et al., Nowe zastosowanie strumienia plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym jako środka neuroprotekcyjnego przeciwko uszkodzeniom komórek SH-SY5Y wywołanym deprywacją glukozy. J. Vis. Exp. (2017)

Film demonstruje neuroprotekcyjne działanie leczenia osoczem o niskim ciśnieniu atmosferycznym w komórkach neuroblastoma pozbawionych glukozy poprzez modulację stresu oksydacyjnego i zwiększanie żywotności komórek.

Protokół

1. Obróbka APPJ (Atmospheric Pressure Plasma Jet) SH-SY5Y

1. Dostosuj odległość między dyszą rurki kwarcowej a platformą, na której zostanie umieszczona 96-dołkowa płytka, do 3 cm. Upewnij się, że wiązka może dotykać powierzchni pożywki hodowlanej.
   UWAGA: Odległość nie jest mierzona od spodu płytki. Najpierw ustawia się go na 3 cm między dyszą rurki kwarcowej a platformą służącą do umieszczenia płytki 96-dołkowej.
2. Przed poddaniem działaniu APPJ (Atmospheric Pressure Plasma Jet) należy zmienić pożywkę hodowlaną w każdym dołku z wyjątkiem studzienek kontrolnych na RPMI 1640 bez pożywki glukozowej.
3. Umieść płytkę pod dyszą APPJ i upewnij się, że dysze mogą strzelać pionowo do każdej studzienki.
4. Traktuj komórki w oddzielnych studzienkach za pomocą APPJ przez 0 s, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s i 12 s.
   UWAGA: APPJ jest generowany przez jonizację helu (ryc. 1). Komórki uszkodzone przez deprywację glukozy są leczone przepływem helu przez 4 s i 8 s w celu wyeliminowania wpływu helu na komórki. Wszystkie zabiegi należy wykonać w trzech egzemplarzach.

2. Test żywotności komórek

UWAGA: Nie zmieniaj pożywki na tym etapie.

1. Po zabiegu APPJ inkubować komórki przez 1 godzinę w inkubatorze komórkowym.
2. Dodaj 10 μl roztworu Cell Counting Kit-8 (CCK-8) do każdej studzienki.
3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 4 godziny
   UWAGA: Linia komórkowa SH-SY5Y jest wrażliwa na warunki niedoboru glukozy. Żywotność komórek spada do prawie 50% po 1 godzinie deprywacji glukozy, co jest optymalnym warunkiem żywotności komórek w badaniach farmakodynamicznych. CCK-8 nie ma cytotoksyczności dla komórek, a komórki inkubuje się z odczynnikiem CCK-8 przez kolejne 4 godziny w warunkach deprywacji glukozy po leczeniu APPJ w celu sprawdzenia żywotności komórek. Po 8 godzinach deprywacji glukozy i leczeniu APPJ ochronne działanie APPJ zostało znacznie zmniejszone, ponieważ długi czas trwania deprywacji glukozy doprowadził do poważnego uszkodzenia komórek SH-SY5Y. Nie znaleziono dowodów na istnienie żywych komórek po 24 godzinach deprywacji glukozy.
4. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.

Wyniki

Rysunek 1: Typowe reakcje RNS (reaktywne formy azotu) i ROS (reaktywne formy tlenu) w emisjach APPJ (Atmospheric Pressure Plasma Jet).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
komórkowa SH-SY5Y	Chińskie Centrum Zbierania Kultur Typu	3111C0001CCC000026
RPMI 1640 średni	Thermo Scientific	21875091	Przechowywany w temperaturze 4 °C
RPMI 1640 średni bez glukozy	Thermo Scientific	11879020	Przechowywany w temperaturze 4 °C
Surowica cielęca płodu	Thermo Scientific 16000044		Przechowywany w temperaturze -20 °C
96-dołkowa płyta	corning	3599
Zestaw do liczenia komórek-8 (CCK-8)	Dojindo Laboratories	CK04	Przechowywany w temperaturze 4 °C
Czytnik mikropłytek	Tecan	M200 Pro	Do pomiaru absorbancji przy 450 nm
Wysokonapięciowy wzmacniacz mocy	Trek	PD06087	Do wzmacniania mocy
Funkcja Generator sygnału	MaZe Elektronika Nauka i Technologia	AT30120	Do dostarczania określonego sygnału
Sonda wysokonapięciowa	Tektronix	P6015A	Do wykrywania wysokiego napięcia
Oscyloskop cyfrowy	Tektronix	DPO4104B	Do wyświetlania sygnału

linia