Przedstawiamy prostą metodę rozmieszczania komórek w wybranych miejscach na podłożu. Metoda ta polega na tworzeniu wzorów komórkowych poprzez odwrócenie krzemowego chipa zawierającego wypełnione komórkami mikrownęki i dociśnięcie go do podłoża. Metoda ta stanowi nowy sposób modulowania sygnalizacji dyfuzyjnej oraz jukstakrynnej między komórkami.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wzorowanie embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem Bio Flip Chip
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Interakcje międzykomórkowe, obejmujące sygnalizację dyfuzyjną oraz kontakt międzykomórkowy (sygnalizację jukstakrynną), odgrywają istotną rolę w licznych procesach biologicznych, takich jak wzrost guza, różnicowanie komórek macierzystych oraz ich samoodnawianie. Obecnie istnieje szereg metod modulowania sygnalizacji komórkowej in vitro. Jedną z metod regulacji całkowitej ilości sygnałów dyfuzyjnych jest zmiana gęstości wysiewu komórek podczas hodowli. Ze względu na losowy charakter wysiewu prowadzi to do znacznych różnic w rzeczywistym rozmieszczeniu komórek i ilości kontaktów międzykomórkowych, a także nie pozwala na precyzyjne określenie środowiska lokalnego. Bardziej specyficznym podejściem do modulowania sygnalizacji komórkowej jest stosowanie inhibitorów molekularnych lub metod genetycznych w celu wyciszenia konkretnych białek sygnałowych, jednak obie te metody najlepiej sprawdzają się w manipulowaniu niewielkimi liczbami cząsteczek. W niniejszej pracy prezentujemy nowe podejście do modulowania sygnalizacji międzykomórkowej, które modyfikuje lokalne środowisko skupiska komórek poprzez rozmieszczanie różnej liczby komórek w wybranych miejscach na podłożu. Metoda ta stanowi uzupełniający sposób kontrolowania lokalnej sygnalizacji dyfuzyjnej i jukstakrynnej między komórkami. Nasza metoda wykorzystuje Bio Flip Chip (BFC), mikrofabrykowany chip silikonowy zawierający od setek do tysięcy mikrootworów, z których każdy jest dostosowany do pomieszczenia pojedynczej komórki lub niewielkiej liczby komórek. Wypełniamy chip komórkami, po prostu pipetując je na matrycę otworów, a następnie wypłukując komórki, które nie osiadły w otworach. Następnie chip zostaje odwrócony na podłożu, w wyniku czego komórki wypadają z otworów na podłoże, zachowując swój wzór rozmieszczenia. Po przytwierdzeniu się komórek chip można usunąć (lub pozostawić). To podejście do wzorowania komórek jest wyjątkowe, ponieważ: 1) nie zmienia chemii podłoża, co pozwala komórkom na proliferację i migrację; 2) umożliwia wzorowanie na dowolnym podłożu, w tym na polistyrenie do hodowli tkanek, szkle, Matrigelu, a nawet na warstwach komórek karmiących; oraz 3) jest kompatybilne z tradycyjnym drukiem mikrokontaktowym, co pozwala na tworzenie wysepek macierzy zewnątrzkomórkowej z komórkami umieszczonymi wewnątrz tych wysepek. W tym filmie demonstrujemy wzorowanie mysich embrionalnych komórek macierzystych na polistyrenie do hodowli tkanek przy użyciu BFC.
Protokół
Przygotowanie BFC
BFC są wytwarzane poprzez formowanie polidimetylosiloksanu (PDMS) na 4" matrycy krzemowej (Si).
Przygotowanie płytki matki
- Rozpocznij od odwodnienia wafli krzemowych (Si) przez 30 min w temperaturze 130°C.
- Umieść wafel na powlekarce rotacyjnej, nanieś SU8-2050 (Microchem) na wafel, zwiększ prędkość obrotową od 300 rpm/s do 3000-4000 rpm i wiruj przez 30 s, aby uzyskać wysokość struktur odpowiednio 40-30 mm.
- Po wirowaniu umieść wafel na płycie grzejnej o temperaturze 65°C, natychmiast zwiększ temperaturę do 95°C na 5-6 min, a następnie obniż ją do 65°C....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż przedstawiony tutaj protokół i film opisują wykorzystanie BFC 1 do wzorowania embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESCs), BFC mogą być stosowane do wzorowania praktycznie każdego interesującego nas typu komórek. Jedyną zmianą, jaką może być konieczne wprowadzenie, jest zmiana rozmiaru mikrootworów. W naszym doświadczeniu, aby użyć BFC do wzorowania pojedynczych komórek innego typu, najlepiej sprawdza się średnica i wysokość mikrootworu większe o 10 mikronów od średnicy nieprzylegającej komórki.<.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez grant NIH EB007278.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Krzemowa forma matrycowa | |||
| Szalki do hodowli tkankowej | Falcon BD | 35-3001 | 35 mm |
| Klamry do papieru 3/4" | |||
| PBS | |||
| heksametylodisiloksan | Shin-Etsu MicroSi | ||
| Nowy element | MicroChem Corp. | SU8-2050 | |
| Octan PM | |||
| Izopropanol | |||
| BSA | 7.5% albumina surowicy bydlęcej |
Bibliografia
- Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment. Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
