Wzorowanie embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem Bio Flip Chip

Podsumowanie

Przedstawiamy prostą metodę rozmieszczania komórek w wybranych miejscach na podłożu. Metoda ta polega na tworzeniu wzorów komórkowych poprzez odwrócenie krzemowego chipa zawierającego wypełnione komórkami mikrownęki i dociśnięcie go do podłoża. Metoda ta stanowi nowy sposób modulowania sygnalizacji dyfuzyjnej oraz jukstakrynnej między komórkami.

Streszczenie

Interakcje międzykomórkowe, obejmujące sygnalizację dyfuzyjną oraz kontakt międzykomórkowy (sygnalizację jukstakrynną), odgrywają istotną rolę w licznych procesach biologicznych, takich jak wzrost guza, różnicowanie komórek macierzystych oraz ich samoodnawianie. Obecnie istnieje szereg metod modulowania sygnalizacji komórkowej in vitro. Jedną z metod regulacji całkowitej ilości sygnałów dyfuzyjnych jest zmiana gęstości wysiewu komórek podczas hodowli. Ze względu na losowy charakter wysiewu prowadzi to do znacznych różnic w rzeczywistym rozmieszczeniu komórek i ilości kontaktów międzykomórkowych, a także nie pozwala na precyzyjne określenie środowiska lokalnego. Bardziej specyficznym podejściem do modulowania sygnalizacji komórkowej jest stosowanie inhibitorów molekularnych lub metod genetycznych w celu wyciszenia konkretnych białek sygnałowych, jednak obie te metody najlepiej sprawdzają się w manipulowaniu niewielkimi liczbami cząsteczek. W niniejszej pracy prezentujemy nowe podejście do modulowania sygnalizacji międzykomórkowej, które modyfikuje lokalne środowisko skupiska komórek poprzez rozmieszczanie różnej liczby komórek w wybranych miejscach na podłożu. Metoda ta stanowi uzupełniający sposób kontrolowania lokalnej sygnalizacji dyfuzyjnej i jukstakrynnej między komórkami. Nasza metoda wykorzystuje Bio Flip Chip (BFC), mikrofabrykowany chip silikonowy zawierający od setek do tysięcy mikrootworów, z których każdy jest dostosowany do pomieszczenia pojedynczej komórki lub niewielkiej liczby komórek. Wypełniamy chip komórkami, po prostu pipetując je na matrycę otworów, a następnie wypłukując komórki, które nie osiadły w otworach. Następnie chip zostaje odwrócony na podłożu, w wyniku czego komórki wypadają z otworów na podłoże, zachowując swój wzór rozmieszczenia. Po przytwierdzeniu się komórek chip można usunąć (lub pozostawić). To podejście do wzorowania komórek jest wyjątkowe, ponieważ: 1) nie zmienia chemii podłoża, co pozwala komórkom na proliferację i migrację; 2) umożliwia wzorowanie na dowolnym podłożu, w tym na polistyrenie do hodowli tkanek, szkle, Matrigelu, a nawet na warstwach komórek karmiących; oraz 3) jest kompatybilne z tradycyjnym drukiem mikrokontaktowym, co pozwala na tworzenie wysepek macierzy zewnątrzkomórkowej z komórkami umieszczonymi wewnątrz tych wysepek. W tym filmie demonstrujemy wzorowanie mysich embrionalnych komórek macierzystych na polistyrenie do hodowli tkanek przy użyciu BFC.

Protokół

Przygotowanie BFC

BFC są wytwarzane poprzez formowanie polidimetylosiloksanu (PDMS) na 4" matrycy krzemowej (Si).

Przygotowanie płytki matki

1. Rozpocznij od odwodnienia wafli krzemowych (Si) przez 30 min w temperaturze 130°C.
2. Umieść wafel na powlekarce rotacyjnej, nanieś SU8-2050 (Microchem) na wafel, zwiększ prędkość obrotową od 300 rpm/s do 3000-4000 rpm i wiruj przez 30 s, aby uzyskać wysokość struktur odpowiednio 40-30 mm.
3. Po wirowaniu umieść wafel na płycie grzejnej o temperaturze 65°C, natychmiast zwiększ temperaturę do 95°C na 5-6 min, a następnie obniż ją do 65°C.
4. Naświetl wafle dawką UV o wartości 200 mJ/cm² w alignerze kontaktowym, używając maski ciemnego pola.
5. Umieść wafle na płycie grzejnej o temperaturze 65°C, natychmiast zwiększ temperaturę do 95°C na 4-5 min, a następnie obniż ją do 65°C.
6. Wywołaj wafle w octanie PM i izopropanolu.
7. Przeprowadź silanizację wafli przez 30 min, używając heksametylodisiloksanu (Shin-Etsu MicroSi) lub (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilanu (t2492-KG, UCT Specialities, Bristol, PA), aby zapobiec przyleganiu PDMS do krzemowego wafla wzorcowego.

Formowanie chipów

1. Wymieszać PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) w stosunku 10:1, wylać go na matrycę z wafla krzemowego (~15 g na wafel) i pozostawić do utwardzenia przez noc w temperaturze pokojowej.
2. Oddzielić utwardzony PDMS od wafla krzemowego i wyciąć poszczególne chipy za pomocą żyletki.
3. Przykleić każdy chip do wyciętego fragmentu szkiełka przedmiotowego o wymiarach 1x1 cm, aby ułatwić manipulację.

Przygotowanie BFC do użycia

1. Namocz BFC przez noc w PBS, aby zapobiec absorpcji pożywki przez PDMS podczas eksperymentu.
2. Osusz chipy za pomocą chusteczki Kimwipe (Kimtech Science).
3. Nanieś kroplę 7,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (~200 mL) na wzorowaną powierzchnię BFC, a następnie rozprowadź BSA i usuń pęcherzyki powietrza z dołków za pomocą końcówki do pipety.
4. Pozostaw BSA na powierzchni BFC na co najmniej 0,5 godziny. W celu zapobiegania wysychaniu i tworzeniu się skorupy zaleca się mieszanie BSA co 15 min.
5. Aby dopasować BFC do naczynia TCPS o wymiarach 35x10 mm (Falcon, 35-3001), przetnij krawędzie naczynia TCPS do połowy wysokości, tak aby żabki biurowe ¾" (Office Depot) mogły zostać założone na krawędź naczynia w celu zaciśnięcia chipu i naczynia razem.
6. Wytnij uszczelkę dystansową (w kształcie ramki o zewnętrznej krawędzi 20´20 mm, wewnętrznej krawędzi 15´15 mm i grubości 250-500 mm) z arkusza PDMS (Silicone Specialty Products) lub innego silikonu, a następnie przymocuj ją do naczynia za pomocą pęsety.

Wzorowanie komórek za pomocą BFC

1. Zesterylizować pod UV przez 1 minutę szalkę, uszczelkę, chip powlekany BSA oraz 2 żabki biurowe.
2. Odssać BSA i przepłukać BFC dwukrotnie 200 µL PBS.
3. Jeśli jest to wymagane dla danej linii komórkowej, dodać żelatynę do wyciętej szalki TCPS. W przeciwnym razie zwilżyć powierzchnię TCPS niewielką ilością medium przed nałożeniem jej na chip (patrz poniżej). Zapobiega to powstawaniu pęcherzyków powietrza w komorze.
4. Po odessaniu PBS, nanieść pipetą 200 µL zawiesiny komórek (~1×10⁶ komórek/mL) na powierzchnię BFC. Pozostawić komórki do osiadania na 5-10 min.
5. Przechylić BFC w jeden róg pod kątem ~15° i powoli odessać zawiesinę komórek pipetą 200 µL. Następnie ułożyć BFC płasko i dodać 100 µL PBS lub medium bez dodatków w przeciwległy róg BFC. W ten sposób przepłukać BFC dodatkowo 2-4 razy, w zależności od potrzeb, aby usunąć wszystkie komórki z obszarów między studzienkami.
6. Nanieść pipetą 200 µL medium na powierzchnię chipa. Odessać żelatynę/medium z TCPS. Następnie odwrócić wcześniej zwilżoną szalkę i powoli wsunąć BFC do góry, do wnętrza szalki.
7. Zastosować po jednej żabce biurowej z dwóch stron komory, aby ją uszczelnić. Usunąć metalowe uchwyty z żabek, aby szalka pozostała w poziomie po obróceniu.
8. Na koniec szybko obrócić cały układ, unikając zbędnych ruchów, i umieścić go w inkubatorze.

Dyskusja

Chociaż przedstawiony tutaj protokół i film opisują wykorzystanie BFC ¹ do wzorowania embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESCs), BFC mogą być stosowane do wzorowania praktycznie każdego interesującego nas typu komórek. Jedyną zmianą, jaką może być konieczne wprowadzenie, jest zmiana rozmiaru mikrootworów. W naszym doświadczeniu, aby użyć BFC do wzorowania pojedynczych komórek innego typu, najlepiej sprawdza się średnica i wysokość mikrootworu większe o 10 mikronów od średnicy nieprzylegającej komórki.<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Krzemowa forma matrycowa
Szalki do hodowli tkankowej	Falcon BD	35-3001	35 mm
Klamry do papieru 3/4"
PBS
heksametylodisiloksan	Shin-Etsu MicroSi
Nowy element	MicroChem Corp.	SU8-2050
Octan PM
Izopropanol
BSA			7.5% albumina surowicy bydlęcej