Artykuł metodologiczny

Modelowanie embrionalnych komórek macierzystych za pomocą Bio Flip Chip

DOI:

10.3791/318

⸱

1 października 2007

 ,  , 
1Dept of Physics, MIT - Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, MIT - Massachusetts Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy prostą metodę umieszczania komórek w pożądanych miejscach na podłożu. Ta metoda modeluje komórki poprzez odwrócenie silikonowego chipa zawierającego mikrodołki wypełnione komórkami na podłoże. Metoda ta zapewnia nowy sposób modulowania sygnalizacji dyfuzyjnej i przybuktakrynowej między komórkami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje komórka-komórka, składające się z dyfuzyjnej sygnalizacji i kontaktu komórka-komórka (sygnalizacja jukstakrynowa) są ważne w wielu procesach biologicznych, takich jak wzrost guza, różnicowanie komórek macierzystych i samoodnawianie komórek macierzystych. Obecnie istnieje wiele metod modulowania sygnalizacji komórkowej in vitro. Jedną z metod modulowania całkowitej ilości sygnalizacji dyfuzyjnej jest zmiana gęstości wysiewu komórek podczas hodowli. Ze względu na losowy charakter wysiewu komórek, powoduje to znaczne różnice w rzeczywistych odstępach między komórkami i ilości kontaktu komórka-komórka i nie może określić lokalnego środowiska. Bardziej specyficznym podejściem do modulowania sygnalizacji komórkowej jest użycie inhibitorów molekularnych lub podejść genetycznych w celu zniszczenia określonych białek sygnałowych, ale obie te metody najlepiej nadają się do manipulowania niewielką liczbą cząsteczek. Tutaj demonstrujemy nowe podejście do modulowania sygnalizacji komórka-komórka, które moduluje lokalne środowisko klastra komórek poprzez umieszczenie różnej liczby komórek w pożądanych miejscach na podłożu. Metoda ta zapewnia komplementarny sposób kontrolowania lokalnej sygnalizacji dyfuzyjnej i przybuktakrynowej między komórkami. Nasza metoda wykorzystuje Bio Flip Chip (BFC), mikrowytwarzany chip silikonowy zawierający od setek do tysięcy mikrostudzienek, z których każda może pomieścić pojedynczą komórkę lub niewielką liczbę komórek. Ładujemy chip komórkami, po prostu pipetując je do matrycy studzienek i zmywając rozładowane komórki z tablicy. Chip jest następnie przenoszony na podłoże, w wyniku czego komórki wypadają z dołków na podłoże, zachowując swój wzór. Po przyczepieniu ogniw chip można wyjąć (lub pozostawić włączony). To podejście do wzorcowania komórek jest wyjątkowe, ponieważ: 1) nie zmienia chemii substratu, umożliwiając w ten sposób komórkom proliferację i migrację; 2) umożliwia modelowanie na dowolnym podłożu, w tym polistyrenie z kultur tkankowych, szkle, matrygelu, a nawet warstwach komórek zasilających; oraz 3) jest kompatybilny z tradycyjnym drukiem mikrokontaktowym, umożliwiając tworzenie wysp macierzy zewnątrzkomórkowej z komórkami umieszczonymi wewnątrz tych wysp. W tym filmie pokazujemy wzór embrionalnych komórek macierzystych myszy na polistyrenie z hodowli tkankowej za pomocą BFC.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tworzenie BFC

BFC są wytwarzane przez formowanie polidimetylosiloksanu (PDMS) na 4-calowym waflu głównym Si.

Robienie wafla wzorcowego

  1. Zacznij od odwodnienia wafli krzemowych przez 30 minut w temperaturze 130°C.
  2. Umieścić wafel na wirówce, wlać SU8-2050 (Microchem) na wafel, zwiększyć prędkość od 300 obr./min / s do 3000-4000 obr./min i wirować przez 30 s, aby uzyskać odpowiednio wysokość 40-30 mm.
  3. Po odwirowaniu umieść wafel na płycie grzejnej o temperaturze 65°C, natychmiast zwiększ temperaturę do 95°C na 5-6 minut, a następnie zmniejsz ją do 65°C.
  4. Wystaw wafle na działanie dawki UV 200 mJ/cm2 na nakładce kontaktowej za pomocą maski ciemnego pola.
  5. Umieść wafle na płycie grzejnej o temperaturze 65°C, natychmiast zwiększ temperaturę do 95°C na 4-5 minut, a następnie zmniejsz ją do 65°C.
  6. Rozwiń wafle w octanie PM i izopropanolu.
  7. Sylanizować wafle przez 30 minut za pomocą heksametylodiloksanu (Shin-Etsu MicroSi) lub (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilanu (t2492-KG, UCT Specialities, Bristol, PA), aby zapobiec przywieraniu PDMS do płytki głównej Si.

Wióry do formowania

  1. Wymieszaj PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) w proporcji 10:1, zalej nim główny wafel Si (~15 g na wafel) i pozostaw do utwardzenia przez noc w temperaturze pokojowej.
  2. Oderwij utwardzony PDMS od wafla Si i wytnij każdy wiór za pomocą żyletki.
  3. Przyklej każdy wiór do szkiełka mikroskopowego o wymiarach 1x1 cm, aby ułatwić obsługę.

Przygotowanie BFC do użycia

  1. Namocz BFC na noc w PBS, aby zapobiec wchłanianiu pożywki do PDMS podczas eksperymentu.
  2. Wysusz frytki za pomocą Kimwipe (Kimtech Science).
  3. Umieść kroplę 7,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (~ 200 ml) na wzorzystej powierzchni BFC, a następnie zeskrob ją końcówką pipety, aby rozproszyć BSA i usunąć wszelkie pęcherzyki z dołków.
  4. Pozostaw BSA na powierzchni BFC na co najmniej 0,5 godziny. Najlepiej mieszać BSA co 15 minut, aby zapobiec tworzeniu się skorupy.
  5. Aby zmieścić BFC w czaszy TCPS 35x10 mm (Falcon, 35-3001), przytnij krawędzie naczynia TCPS do połowy, tak aby klipsy do segregatora 3/4" (Office Depot) pasowały do krawędzi naczynia, aby zacisnąć chip i miskę razem.
  6. Wytnij uszczelkę dystansową (w kształcie ramy z krawędzią zewnętrzną 20'20 mm, krawędzią wewnętrzną 15'15 mm i grubością 250-500 mm) z arkusza PDMS (Silikonowe Produkty Specjalistyczne) lub innego silikonu i nałóż ją na naczynie za pomocą pęsety.

Wzorowanie komórek za pomocą BFC

  1. Sterylizuj naczynie, uszczelkę, wiór pokryty BSA i 2 spinki do segregatora w świetle UV przez 1 minutę.
  2. Odessać BSA i dwukrotnie przepłukać BFC 200 ml PBS.
  3. Dodaj żelatynę do pokrojonej miski TCPS, jeśli jest to wymagane dla twojej linii komórkowej. W przeciwnym razie zwilż powierzchnię TCPS odrobiną nośnika przed nałożeniem go na chip (patrz poniżej). Zapobiega to tworzeniu się pęcherzyków w komorze.
  4. Po zaessaniu PBS odpipetować 200 ml roztworu komórek (~1×106 komórek/ml) na powierzchnię BFC. Pozwól komórkom osiąść na 5-10 minut.
  5. Przechyl BFC do jednego rogu pod kątem ~15° i powoli odpipetuj roztwór komórek za pomocą pipety o pojemności 200 ml. Następnie umieść BFC płasko i dodaj 100 ml PBS lub ślepego nośnika do przeciwległego rogu BFC. Przepłucz BFC w ten sposób dodatkowo 2-4 razy, jeśli to konieczne, aby usunąć wszystkie komórki z obszarów międzydołkowych.
  6. Odpipetować 200 ml pożywki na powierzchnię chipa. Odessać żelatynę/pożywkę z TCPS. Następnie odwróć wstępnie zwilżone naczynie i powoli wepchnij BFC do góry, do naczynia.
  7. Przyłóż po jednym klipsie do segregatora z dwóch stron komory, aby ją uszczelnić. Usuń metalowe zęby z klipsów do segregatora, aby naczynie pozostało poziome po odwróceniu.
  8. Na koniec szybko odwróć zestaw, unikając niepotrzebnych ruchów, i umieść go w inkubatorze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż przedstawiony tutaj protokół i film opisują użycie BFC 1 do modelowania embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC), BFC mogą być używane do modelowania praktycznie każdego typu komórek będących przedmiotem zainteresowania. Jedyną zmianą, którą może być konieczne wprowadzenie, jest zmiana rozmiaru mikrostudzienek. Z naszego doświadczenia wynika, że aby użyć BFC do modelowania pojedynczych komórek innego typu ogniwa, najlepiej sprawdza się średnica i wysokość mikrostudzienki równa 10 mikronomów wię...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez EB007278 grantu NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PDMSDow CorningSylgard 184
Silikonowa forma
Naczynia do hodowli tkankowychFalcon BD35-300135 mm
3/4" spinacze do segregatora
PBS
hexamethyldisiloxaneShin-Etsu MicroSi
Nowy przedmiotMicroChem Corp.SU8-2050
PM octan
Izopropanol
BSA7,5% albumina surowicy bydlęcej
wzorcowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment. Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cell PatterningMicrowell ArraySubstrate CompatibilitySoft LithographyPDMS MoldingCell Seeding DensityJuxtacrine SignalingDiffusible Signaling

Powiązane artykuły