Ładowanie cięte: przydatne narzędzie do badania zakresu sprzężenia znacznika połączenia szczelinowego między neuronami siatkówki

Podsumowanie

Opisana jest łatwa i wygodna metoda określania stopnia sprzężenia znaczników między neuronami siatkówki. Technika ta umożliwia zbadanie funkcji synaps elektrycznych między neuronami w nienaruszonej siatkówce w różnych warunkach oświetleniowych oraz o różnych porach dnia i nocy.

Streszczenie

Oprócz chemicznej transmisji synaptycznej, neurony, które są połączone połączeniami szczelinowymi, mogą również szybko komunikować się za pomocą elektrycznej transmisji synaptycznej. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że złącza szczelinowe nie tylko umożliwiają przepływ prądu elektrycznego i aktywność synchroniczną między połączonymi lub sprzężonymi ogniwami, ale także, że siła lub skuteczność komunikacji elektrycznej między sprzężonymi ogniwami może być w dużym stopniu modulowana^1,2. Ponadto duża średnica wewnętrzna (~1,2 nm) wielu kanałów połączeń szczelinowych umożliwia nie tylko przepływ prądu elektrycznego, ale także dyfuzję wewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnałowych i małych metabolitów między połączonymi komórkami, dzięki czemu połączenia szczelinowe mogą również pośredniczyć w komunikacji metabolicznej i chemicznej. Siłę komunikacji szczelinowej między neuronami i jej modulację przez neuroprzekaźniki i inne czynniki można badać poprzez jednoczesne rejestrowanie elektryczne ze sprzężonych komórek i określanie zakresu dyfuzji cząsteczek znacznikowych, które są przepuszczalne dla połączeń szczelinowych, ale nie przepuszczalne dla błony, po wstrzyknięciu jonoforetycznym do pojedynczych komórek. Jednak procedury te mogą być niezwykle trudne do wykonania na neuronach z małymi somatami w nienaruszonej tkance nerwowej.

Przeprowadzono liczne badania nad synapsami elektrycznymi i modulacją komunikacji elektrycznej w siatkówce kręgowców, ponieważ każdy z pięciu typów neuronów siatkówki jest elektrycznie połączony połączeniami szczelinowymi^3,4. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że zegar okołodobowy (24-godzinny) w siatkówce i zmiany w stymulacji świetlnej regulują sprzężenie złączy szczelinowych^3-8. Na przykład ostatnie prace wykazały, że zegar okołodobowy siatkówki zmniejsza sprzężenie połączeń szczelinowych między komórkami fotoreceptorów pręcików i czopków w ciągu dnia poprzez zwiększenie aktywacji receptora dopaminowego D2 i dramatycznie zwiększa sprzężenie pręcik-czopek w nocy poprzez zmniejszenie aktywacji receptora D2^7,8. Jednak badania te są nie tylko niezwykle trudne do przeprowadzenia na neuronach z małymi somatami w nienaruszonej tkance nerwowej siatkówki, ale może być trudno odpowiednio kontrolować warunki oświetlenia podczas badania elektrofizjologicznego pojedynczych neuronów siatkówki, aby uniknąć wywołanych światłem zmian w przewodnictwie połączeń szczelinowych.

Tutaj prezentujemy prostą metodę określania stopnia sprzężenia znacznika połączenia szczelinowego między neuronami siatkówki w różnych warunkach oświetleniowych oraz o różnych porach dnia i nocy. Ta technika ładowania cięcia jest modyfikacją ładowania skrobacznego^9-12, która opiera się na ładowaniu i dyfuzji barwnika przez kanały połączeń z otwartą szczeliną. Ładowanie skrobaniem działa dobrze w hodowanych komórkach, ale nie w grubych plasterkach, takich jak nienaruszone siatkówki. Technika ładowania przez cięcie została wykorzystana do badania sprzężenia fotoreceptorów w nienaruszonych siatkówkach ryb i ssaków^{7, 8,13} i może być wykorzystana do badania sprzężenia między innymi neuronami siatkówki, jak opisano tutaj.

Protokół

1. Nienaruszone preparaty siatkówki nerwowej dla złotych rybek, myszy i królików

1. Wykonaj wszystkie poniższe czynności, w tym te opisane w "2) Cięcie-ładowanie" przy stałym oświetleniu otoczenia (tła). Należy pamiętać, że do celów niniejszego protokołu procedury są opisane jako wykonywane w ciągłej ciemności (tj. w bardzo ciemnych (tj. "skotopowych") warunkach ≤ 0,0001 luksa) przy użyciu noktowizyjnych gogli na podczerwień, ale zamiast tego można zastosować inne poziomy stałego oświetlenia otoczenia o wyższej intensywności w celu określenia wpływu innych poziomów oświetlenia otoczenia na sprzężenie znacznika skrzyżowania szczelinowego.
2. Przystosuj zwierzę doświadczalne do ciemności (złotą rybkę, mysz lub królika) przez co najmniej 1 godzinę przed operacją.
3. Jak opisano wcześniej⁷, głęboko znieczul złote rybki, umieszczając je w metanosulfonianu trikainy (MS222; 150 mg / L buforowanej (zawierającej wodorowęglan sodu) wodzie w akwarium) i głęboko znieczul myszy ketaminą (100 mg / kg, i.p.) i rompunem (10 mg / kg, i.p.). Króliki należy głęboko znieczulić uretanem (dawka nasycająca: 2,0 g/kg, i.p.), a także zastosować miejscowe znieczulenie wewnątrzoczodołowe (2% Xylocaine), jak opisano wcześniej⁸. Wszystkie procedury eksperymentalne związane z opieką i wykorzystaniem zwierząt powinny być wykonywane zgodnie z wytycznymi federalnymi oraz powinny być przeglądane i zatwierdzane przez lokalne uniwersyteckie komitety ds. opieki i wykorzystania zwierząt. (Uwaga: W opisanych tutaj eksperymentach wszystkie procedury eksperymentalne obejmujące opiekę i wykorzystanie ryb, myszy i królików zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH i zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Ohio.)
4. W przypadku ryb, myszy i królików, po wyłuszczeniu, należy usunąć przednią część każdej gałki ocznej. Następnie umieść kawałek bibuły filtracyjnej na tylnej części oka i odwróć bibułę filtracyjną i oko, tak aby bibuła filtracyjna znalazła się pod tylną częścią oka. Następnie za pomocą cienkich kleszczyków wypreparuj nienaruszoną siatkówkę nerwową z tylnej części oka, delikatnie odrywając nabłonek pigmentowy / naczyniówkę / twardówkę, które są ze sobą połączone, z siatkówki nerwowej, która jest przymocowana do bibuły filtracyjnej. Gdy to zrobisz, przetnij nerw wzrokowy za pomocą cienkich nożyczek sprężynowych. Siatkówka nerwowa, zorientowana fotoreceptorem do góry, powinna być teraz przymocowana do bibuły filtracyjnej i oddzielona od reszty oka.

2. Wczytywanie cięć

1. Zanurz siatkówki w natlenionym roztworze Ringera (Tabela 1) na 6-dołkowej płytce (~5 ml / dołek) na 30 minut przy stałym oświetleniu otoczenia (tła) (np. w bardzo ciemnych (tj. "skotopowych") warunkach) z badanym lekiem lub bez niego. Utrzymuj siatkówki ryb w natlenionych (5% CO₂ / 95% O₂) wodorowęglanowych siatkówkach Ringera w temperaturze 22°C, uszczelniając 6-dołkową płytkę parafilmem i utrzymuj siatkówki myszy i królików w temperaturze 36°C w inkubatorze 5% CO₂ / 95% O₂ . W przypadku stosowania badanego leku powinien on być obecny podczas wszystkich kolejnych etapów, aż do utrwalenia
2. Przygotować roztwór znacznikowy (zwykle 100 μl), rozpuszczając neurobiotynę (0,5%), cząsteczkę biotynylowaną, w roztworze Ringera bezpośrednio przed przecięciem siatkówki. Należy pamiętać, że do roztworu można dodać 0,5% dekstranu rodaminy (o wysokiej (> 10 000) MW). Ze względu na wysoką masę cząsteczkową dekstran rodaminy nie przenika przez połączenia szczelinowe i znakuje tylko komórki, które zostały uszkodzone przez cięcie. Jak pokazano na ryc. 3, jest to użyteczny sposób na odróżnienie komórek, które zgromadziły neurobiotynę, ponieważ zostały uszkodzone, od tych, które zgromadziły znacznik przez dyfuzję przez połączenia szczelinowe.
3. Umieść roztwór neurobiotyny na szklanej (lub plastikowej) szalce Petriego, postukaj w bibułę filtracyjną, do której przymocowana jest siatkówka, w ręcznik papierowy, aby usunąć nadmiar Ringera, zanurz żyletkę (lub inne ostre ostrze) w roztworze neurobiotyny, a następnie wykonaj promieniste nacięcie przez siatkówkę i bibułę filtracyjną. W razie potrzeby można użyć przekładek, aby cięcie było wykonywane przez siatkówkę, ale nie przez bibułę filtracyjną. Cięcie powinno być zorientowane prostopadle do powierzchni siatkówki. Ponownie zanurz żyletkę w roztworze neurobiotyny i przetnij siatkówkę po raz drugi. Powtórz to do 4 cięć na siatkówkę (patrz ryc. 1). Użyj mikroskopu preparacyjnego podczas wykonywania nacięć brzytwą przez myszy i inne małe siatkówki.
4. Jak pokazano na ryc. 1, ponownie zanurz siatkówkę w świeżym pożywce Ringera, z badanym lekiem lub bez, używając 6-płytkowej studzienki (5 ml Ringera/studzienkę). Inkubuj siatkówkę przez 15 minut, aby umożliwić ładowanie i dyfuzję.
5. Przemyć trzy razy przez 5 minut, każdy świeżym pożywką Ringera z badanym lekiem lub bez.
6. Utrwalić siatkówkę za pomocą 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (PBS, pH 7,4) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
7. Prać 0,1 M PBS przez noc w temperaturze 4°C.
8. Następnego dnia przereagować z 2% streptawidyną-Alexa 488 (końcowe stężenie 10 μg/ml) w 0,1 M PBS + 0,3% Triton X-100 i przechowywać przez noc w temperaturze 4°C.
9. Umyj trzy razy po 10 minut za pomocą 0,1 mln PBS w temperaturze pokojowej
10. W PBS odłącz siatkówkę od bibuły filtracyjnej, a następnie za pomocą cienkiej szczoteczki umieść siatkówkę, zorientowaną stroną fotoreceptorową do góry, na szkiełku.
11. Delikatnie zamontuj za pomocą medium montażowego Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
12. Rób zdjęcia za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (np. Zeiss 510 META) w tym samym powiększeniu, rozdzielczości i ustawieniach dla każdego warunku eksperymentalnego, tak aby można było porównać wpływ różnych warunków eksperymentalnych (np. badanych leków; warunki oświetlenia) na stopień sprzężenia znacznika złącza szczelinowego (rys. 2A-C i rys. 4A-C). Mimo że pojedynczy obraz może zawierać wszystkie oznaczone komórki, zaleca się zebranie stosu z obszaru zainteresowania i zwinięcie go w jeden obraz.

3. Kwantyfikacja sprzężenia znacznika za pomocą ImageJ

1. W przeglądarce obrazów LSM otwórz obraz, kliknij EKSPORTUJ i zapisz obraz jako plik TIF-16 bit NOT skompresowany. Podziałka liniowa powinna być dołączona do tego obrazu TIF.
2. Za pomocą oprogramowania NIH ImageJ zmierz intensywność fluorescencji neurobiotyny znakowanej Alexa-488 na podstawie obrazów siatkówki w małym powiększeniu. Otwórz plik TIF za pomocą oprogramowania ImageJ, a następnie narysuj linię prostą odpowiadającą podziałce liniowej. Przejdź do ANALIZA, USTAW SKALĘ i wprowadź znaną odległość oraz jednostkę długości, a następnie kliknij przycisk OK. Teraz wyniki pomiarów mogą być prezentowane w skalibrowanych jednostkach, takich jak milimetry.
3. Zaznacz obszar zainteresowania za pomocą narzędzia do zaznaczania prostokątnego. Szczyt fluorescencji powinien znajdować się na lewej krawędzi wyboru. Upewnij się, że w pobliżu prawej granicy nie ma sygnału fluorescencji. Jeśli nie, obróć aktywny obraz (IMAGE, a następnie ROTATE).
4. Kliknij przycisk ANALIZUJ i KREŚL PROFIL. Powinieneś zobaczyć krzywą z wykładniczym zanikiem od lewej do prawej.
5. Kliknij KOPIUJ w wyskakującym okienku i wklej go w EXCELU. Teraz widzisz dwie kolumny pokazujące odległość od cięcia (lewa kolumna) i intensywność fluorescencji w funkcji odległości od cięcia (prawa kolumna).
6. Podziel każdą surową wartość fluorescencji przez maksymalną wartość fluorescencji, aby uzyskać względną intensywność fluorescencji.
7. Skopiuj dwie kolumny odpowiadające odległości od cięcia (X) i względnej intensywności fluorescencji (Y), a następnie wklej je do oprogramowania Origin.
8. Dopasuj do funkcji ROZKŁAD WYKŁADNICZY #1 (rys. 2D i rys. 4D), która ma postać:
   Y = Y₀ + Y_max*exp^(-x/λ)
   gdzie Y jest względną intensywnością fluorescencji, Y_o jest fluorescencją tła, Y_max jest maksymalną względną fluorescencją, λ jest stałą przestrzeni (długością), a x jest odległością od cięcia.
9. Porównaj wartości stałej przestrzennej (λ) w różnych warunkach doświadczalnych za pomocą testu t lub ANOVA (rys. 2E i rys. 4E). Należy zauważyć, że alternatywne techniki kwantyfikacji zostały opisane przez innych^13,14.

4. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywne przykłady sprzężenia znacznika komórek fotoreceptorowych przez ładowanie są przedstawione na rysunkach 2 i 3 (ryby) oraz na rysunku 4 (królik). Obrazy konfokalne wykonano przy użyciu tych samych ustawień porównawczych (rys. 2A-C i rys. 4A-C), a intensywność fluorescencji wykreślono w funkcji odległości od cięcia i dopasowano za pomocą funkcji wykładniczej pokazanej na rys. 3.8 powyżej (rys. 2D i rys. 4D). Wartości stałej przestrzennej dla każdego warunku przedstawiono na rysunkach 2E i 4E, co ilustruje, że zakres sprzężenia znacznika ze złączem szczelinowym można określić ilościowo przy użyciu techniki obciążenia cięciem. Ponadto wyniki są wysoce powtarzalne. Zastosowanie techniki ładowania przez cięcie jako sposób ilościowego określania zakresu sprzężenia znacznika złącza szczelinowego jest również potwierdzone przez ustalenie, że intensywność fluorescencji zmniejsza się wykładniczo w funkcji odległości od cięcia we wszystkich badanych przypadkach^7,8 (patrz również ryc. 2D i 4D tutaj), co wskazuje, że neurobiotyna dostała się do fotoreceptorów przez cięcie brzytwą, a nie z innych miejsc siatkówki. Co więcej, jakościowo podobna różnica dzień/noc w sprzężeniu znaczników komórek fotoreceptorowych obserwowana u złotych rybek po wstrzyknięciach znacznika do pojedynczych czopków i przy obciążeniu cięciem⁷ uzasadnia obciążenie tnące jako stosunkowo dokładny sposób pomiaru zakresu sprzężenia fotoreceptorów.

Technika ładowania może być również wykorzystana do badania innych typów synaps elektrycznych w siatkówce. Na przykład rysunek 5 ilustruje, że poziome komórki królika typu A (ryc. 5A) i typu B (ryc. 5B) wykazują homologiczne sprzężenie znacznikowe po obciążeniu i dyfuzji neurobiotyny w warunkach przystosowanych do ciemności.

związek ryba mysz królik Zawartość NaCl 130 szt. 120 szt. Rozdział 117 NaHCO₃ 20 25 Rozdział 30 NaH₂PO₄ - 1 0,5 Kcl Rozdział 2.5 5 3.1 glukoza 10 10 10 MgCl₂ 1 - - MgSO 4-7H2 O - 1 Rozdział 1.2 glutamina - 0,1 0,1 CaCl₂ 0,7 cyfra arabska cyfra arabska

Tabela 1: Skład roztworów Ringera dla siatkówki złotych rybek, myszy i królików. Stężenia podane są w mM. Roztwory Ringera są bąbelkowe z 5% CO₂ / 95% O₂ i utrzymywane w temperaturze 22 °C (ryby) lub 36 °C (ssaki). "-" : nie jest uwzględniony w Ringer dla tego gatunku.

Rysunek 1.: Schemat blokowy przedstawiający procedurę załadunku przez cięcie. Po wyizolowaniu nienaruszonej siatkówki nerwowej, wykonano kilka promieniowych nacięć za pomocą ostrza, które najpierw zanurzono w 0,5% roztworze neurobiotyny. Siatkówkę inkubowano w celu obciążenia znacznikiem i dyfuzji, a następnie przemyto przed utrwaleniem 4% paraformaldehydem (PFA) w 0,1 M buforze fosforanowym (PB). Sprzężenie znacznikowe badano przy użyciu Alexa-488 sprzężonej ze streptawidyną.

Rysunek 2. Różnica dzień-noc w sprzężeniu znaczników fotoreceptorów u złotych rybek ujawnia się za pomocą techniki ładowania przez cięcie. Sprzężenie znacznika neurobiotyny z połączeniem szczelinowym komórki fotoreceptora było rozległe w nocy (B) i w ciągu dnia po zastosowaniu spiperonu (10 μM), selektywnego antagonisty receptora dopaminowego_{D 2} (C), ale nie w dzień w warunkach kontrolnych (A). D) Znormalizowana względna intensywność fluorescencji w funkcji odległości od nacięć (wskazywana strzałkami w A-C). E) Wartości stałych przestrzennych uzyskane z danych w D i innych eksperymentach (n = 4). P < 0,001.

Rysunek 3. Reprezentatywny przykład pokazujący fluorescencję w warstwie komórek fotoreceptorowych siatkówki złotej rybki przystosowanej do ciemności w nocy po obciążeniu roztworem zarówno neurobiotyny, jak i dekstrany rodaminy. Dekstran rodaminy (pokazany na czerwono), który nie dyfunduje przez kanały połączeniowe z otwartą szczeliną ze względu na wysoką masę cząsteczkową (> 10 000 MW), znakuje komórki tylko w pobliżu cięcia. W przeciwieństwie do tego, neurobiotyna (pokazana na zielono) dyfundowała przez połączenia szczelinowe i można ją zobaczyć w komórkach fotoreceptorów daleko od cięcia. Położenie cięcia jest oznaczone strzałką w każdym panelu. Podziałka: 200 μm.

Rysunek 4. Różnica dzień-noc w sprzężeniu znaczników fotoreceptorów w siatkówce królika ujawnia się za pomocą techniki ładowania przez cięcie. Sprzężenie znacznika neurobiotyny z połączeniem szczelinowym komórki fotoreceptorowej było rozległe w nocy (B) i w ciągu dnia po zastosowaniu spiperonu (10 μM) (C), ale nie w ciągu dnia w warunkach kontrolnych (A). W A-C pokazane są prostopadłe widoki rekonstrukcji 3D fotoreceptorów królika w pobliżu cięcia. D) Znormalizowana względna intensywność fluorescencji w funkcji odległości od nacięć. E) Wartości stałych przestrzennych uzyskane z danych w D i innych eksperymentach (n = 3). P < 0,001.

Rysunek 5. Ładowanie przez cięcie ujawnia, że przystosowane do ciemności poziome komórki królika są sprzężone ze znacznikiem. Zarówno komórki poziome typu A (A), jak i typu B (B) w przystosowanych do ciemności siatkówkach królików wykazywały homologiczne sprzężenie znacznikowe neurobiotyny.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda ładowania przez cięcie jest użyteczną i prostą techniką określania zakresu sprzężenia znacznika połączenia szczelinowego między neuronami siatkówki w różnych warunkach oświetlenia oraz o różnych porach dnia i nocy. Do zalet tej techniki należy możliwość ilościowego określenia zakresu sprzężenia znacznika połączenia szczelinowego między neuronami w nienaruszonej tkance siatkówki w różnych warunkach oświetleniowych w dzień i w nocy, a także w przypadku sprzężonych neuronów o małej średnicy somatów. Ograniczenia techniki w badaniu połączeń szczelinowych w nienaruszonej tkance dzielą się na dwie ogólne kategorie. Po pierwsze, dyfuzja znacznika przez otwarte złącza szczelinowe może być stosunkowo trudna do zaobserwowania ze względu na a) małą średnicę lub ładunek związany z otwartymi kanałami oraz b) względne objętości sprzężonych przedziałów komórkowych^1,14,15. Oznacza to, że dyfuzja znacznika z małej komórki do większej komórki lub grupy sprzężonych komórek, w porównaniu z dyfuzją znacznika z większej komórki do mniejszej komórki, może być trudniejsza do wykrycia ze względu na rozcieńczenie znacznika. Po drugie, w pewnych warunkach fizjologicznych zakres dyfuzji znacznika przez połączenia szczelinowe w nienaruszonej tkance może nie odzwierciedlać dokładnie siły przewodnictwa węzłów szczelinowych ze względu na różnice w przewodności małych jonów przewodzących prąd elektryczny, w porównaniu z przepuszczalnością stosunkowo dużych cząsteczek znacznikowych^1,14,15. Ogólnie rzecz biorąc, dowody na sprzężenie znacznika silnie sugerują obecność funkcjonalnych, otwartych kanałów połączeń szczelinowych, ale w pewnych warunkach fizjologicznych dyfuzja znacznika może nie wystąpić lub nie być obserwowana, mimo że zapisy elektrofizjologiczne sugerują obecność funkcjonujących, otwartych połączeń szczelinowych.

Wydaje się prawdopodobne, że technika ładowania przez cięcie może być również wykorzystana do zbadania zakresu sprzężenia znacznika połączenia szczelinowego między neuronami w nienaruszonej tkance z innych regionów ośrodkowego układu nerwowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sulfonian metanu trikainy (MS222)	Sigma-Aldrich	A5040	150 mg/L buforowanej wody w akwarium
Uretan	Sigma-Aldrich	U2500	2 g/kgdawka nasycająca
Gogle noktowizyjne z podwójną rurką	Optyka nocna USA	D-221
Bibuła filtracyjna, klasa nr 4	Whatman, GE Healthcare	1004-090
Kleszcze drobnoziarniste, Dumont nr 5, Biologie, 11 cm długości	Fine Science Tools	11295-10
Cienkie nożyczki, sprężynowe, ostrze 8 mm, proste	Fine Science Tools	15025-10
Neurobiotyna	Vector Laboratories	SP-1120	0,5%
Streptawidyna sprzężona z Alexa 488	Invitrogen	S11223	2%
Dekstran rodamina (wysoka (> 10 000) MW)	Invitrogen	D1817	0,5%
Medium montażowe Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Zeiss 510 META Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny	Carl Zeiss, Inc.
Przeglądarka obrazów LSM-5 3,2,0,115	Carl Zeiss, Inc.
Oprogramowanie ImageJ	Narodowe Instytuty Zdrowia
OriginPro 8.0	OriginLab