Opisano prostą i wygodną metodę określania zakresu sprzężenia markerów złączy szczelinowych pomiędzy neuronami siatkówki. Technika ta umożliwia badanie funkcji synaps elektrycznych pomiędzy neuronami w nienaruszonej siatkówce w różnych warunkach oświetlenia oraz o różnych porach dnia i nocy.
Artykuł metodologiczny
Ładowanie przez przecięcie (cut-loading): użyteczne narzędzie do badania zakresu sprzężenia markerów złącz szczelinowych między neuronami siatkówki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Oprócz chemicznej transmisji synaptycznej, neurony połączone złączami szczelinowymi mogą również komunikować się szybko za pomocą elektrycznej transmisji synaptycznej. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że złącza szczelinowe nie tylko umożliwiają przepływ prądu elektrycznego i synchronizację aktywności między połączonymi lub sprzężonymi komórkami, ale że siła lub skuteczność komunikacji elektrycznej między sprzężonymi komórkami może być w dużym stopniu modulowana1,2. Ponadto duża średnica wewnętrzna (~1.2 nm) wielu kanałów złączy szczelinowych umożliwia nie tylko przepływ prądu elektrycznego, ale także dyfuzję wewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnałowych i małych metabolitów między połączonymi komórkami, dzięki czemu złącza szczelinowe mogą pośredniczyć również w komunikacji metabolicznej i chemicznej. Siłę komunikacji poprzez złącza szczelinowe między neuronami oraz jej modulację przez neurotransmitery i inne czynniki można badać poprzez jednoczesną rejestrację elektryczną ze sprzężonych komórek oraz poprzez określanie stopnia dyfuzji cząsteczek znacznika, które przenikają przez złącza szczelinowe, ale nie przez błonę komórkową, po wstrzyknięciu jontoforetycznym do pojedynczych komórek. Jednakże procedury te mogą być niezwykle trudne do przeprowadzenia na neuronach z małymi somatami w nienaruszonej tkance nerwowej.
Liczne badania nad synapsami elektrycznymi oraz modulacją komunikacji elektrycznej przeprowadzono w siatkówce kręgowców, ponieważ każdy z pięciu typów neuronów siatkówki jest połączony elektrycznie za pomocą połączeń szczelinowych3,4. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że zegar okołodobowy (24-godzinny) w siatkówce oraz zmiany w stymulacji światłem regulują sprzężenie w połączeniach szczelinowych3-8. Na przykład niedawne prace wykazały, że okołodobowy zegar siatkówki zmniejsza sprzężenie w połączeniach szczelinowych między fotoreceptorami pręcikowymi a czopkowymi w ciągu dnia poprzez zwiększenie aktywacji receptorów dopaminy D2, a drastycznie zwiększa sprzężenie pręcikowo-czopkowe w nocy poprzez redukcję aktywacji receptorów D27,8. Jednakże badania te są niezwykle trudne do przeprowadzenia na neuronach z małymi somatami w nienaruszonej tkance nerwowej siatkówki, a dodatkowo trudno jest odpowiednio kontrolować warunki oświetlenia podczas badań elektrofizjologicznych pojedynczych neuronów siatkówki, aby uniknąć zmian przewodnictwa połączeń szczelinowych indukowanych przez światło.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy prostą metodę określania zakresu sprzężenia poprzez połączenia szczelinowe między neuronami siatkówki w różnych warunkach oświetlenia oraz o różnych porach dnia i nocy. Technika ładowania przez cięcie (cut-loading) jest modyfikacją metody ładowania przez zeskrobnięcie (scrape loading)9-12, która opiera się na wprowadzaniu barwnika i jego dyfuzji przez otwarte kanały połączeń szczelinowych. Metoda ładowania przez zeskrobnięcie sprawdza się w komórkach hodowlanych, ale nie w grubych przekrojach, takich jak nienaruszone siatkówki. Technika ładowania przez cięcie była stosowana do badania sprzężenia fotoreceptorów w nienaruszonych siatkówkach ryb i ssaków7, 8,13 i może być wykorzystana do badania sprzężenia między innymi neuronami siatkówki, zgodnie z opisem przedstawionym w niniejszej pracy.
Protokół
1. Przygotowanie nienaruszonej siatkówki nerwowej u złotej rybki, myszy i królika
- Wykonaj wszystkie poniższe kroki, w tym te opisane w punkcie „2) Cut-loading”, w warunkach stałego oświetlenia otoczenia (tła). Należy zauważyć, że na potrzeby niniejszego protokołu procedury opisano jako wykonane w całkowitej ciemności (tj. w warunkach bardzo ciemnych (tzw. „skotopowych”) ≤ 0,0001 lux) przy użyciu gogli noktowizyjnych na podczerwień, jednak w celu określenia wpływu innych poziomów oświetlenia otoczenia na sprzęganie znakera w złączach szczelinowych można zastosować inne, wyższe poziomy stałego oświetlenia tła.
- Adaptuj zwierzę doświadczalne (złotą rybkę, mysz lub królika) do ciemności przez co najmniej 1 hr przed operacją.
- Zgodnie z wcześniejszym opisem7, poddaj głębokiej narkozie złote rybki, umieszczając je w roztworze metansylowianu tricainy (MS222; 150 mg/L w buforowanej (zawierającej wodorowęglan sodu) wodzie z akwarium), a myszy poddaj głębokiej narkozie kwasem ketaminą (100 mg/kg, i.p.) i rompunem (10 mg/kg, i.p.). Króliki poddaj głębokiej narkozie uretanem (dawka nasycająca: 2,0 g/kg, i.p.) oraz zastosuj miejscową znieczulenie okołopodbitkowe (2% Xylocaine), zgodnie z wcześniejszym opisem8. Wszystkie procedury eksperymentalne dotyczące opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania powinny być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi federalnymi oraz zostać przejrzane i zatwierdzone przez lokalne uczelniane komisje ds. opieki i wykorzystania zwierząt. (Uwaga: W opisanych tutaj eksperymentach wszystkie procedury dotyczące opieki i wykorzystania ryb, myszy i królików zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH i zostały przejrzane oraz zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu stanowego Ohio).
- W przypadku ryb, myszy i królików, po enukleacji usuń przednią część każdego gałki ocznej. Następnie połóż kawałek papieru filtracyjnego na górnej części tylnego odcinka oka i odwróć papier filtracyjny wraz z okiem tak, aby papier znalazł się pod tylnym odcinkiem oka. Następnie, używając precyzyjnej pęsety, wypreparuj nienaruszoną siatkówkę nerwową z tylnej części oka, delikatnie oddzielając nabłonek pigmentowy/naczyniówkę/twardówkę, które są ze sobą połączone, od siatkówki nerwowej przymocowanej do papieru filtracyjnego. Podczas tej czynności przetnij nerw wzrokowy za pomocą precyzyjnych nożyczek sprężynowych. Siatkówka nerwowa, zorientowana stroną fotoreceptorów do góry, powinna być teraz przymocowana do papieru filtracyjnego i oddzielona od reszty oka.
2. Załadunek z nacięciem
- Zanurz siatkówki w napowietrzonym roztworze Ringera (Tabela 1) w płytce 6-dołkowej (~5 mL/dołek) na 30 min przy stałym oświetleniu otoczenia (tła) (np. w warunkach bardzo ciemnych, tj. „skotopowych”), z dodatkiem leku testowego lub bez niego. Siatkówki ryb utrzymuj w napowietrzonym (5% CO2 /95% O2) roztworze Ringera na bazie wodorowęglanów w temperaturze 22°C, uszczelniając płytkę 6-dołkową parafilmem, natomiast siatkówki myszy i królika utrzymuj w temperaturze 36°C w inkubatorze z 5% CO2 /95% O2. W przypadku zastosowania leku testowego, powinien on być obecny podczas wszystkich kolejnych etapów aż do momentu fiksacji.
- Przygotuj roztwór znacznika (zwykle 100 μL), rozpuszczając neurobiotynę (0,5%), cząsteczkę biotynilowaną, w roztworze Ringera bezpośrednio przed wykonaniem cięcia siatkówki. Należy pamiętać, że do roztworu można dodać 0,5% dekstranu rodaminowego (o wysokiej masie cząsteczkowej > 10 000 MW). Ze względu na wysoką masę cząsteczkową dekstran rodaminowy nie przenika przez połączenia szczelinowe i znakuje jedynie komórki uszkodzone w wyniku cięcia. Jak pokazano na Rys. 3, jest to przydatny sposób na odróżnienie komórek, które zgromadziły neurobiotynę z powodu uszkodzenia, od tych, które zgromadziły znacznik w drodze dyfuzji przez połączenia szczelinowe.
- Umieść roztwór neurobiotyny na szklanej (lub plastikowej) szalce Petriego, osusz papier filtracyjny, do którego przymocowana jest siatkówka, uderzając nim o ręcznik papierowy w celu usunięcia nadmiaru roztworu Ringera, zanurz ostrze żyletki (lub inne ostre ostrze) w roztworze neurobiotyny, a następnie wykonaj cięcie radialne przez siatkówkę i papier filtracyjny. W razie potrzeby można zastosować dystanse, tak aby cięcie przeszło przez siatkówkę, ale nie przez papier filtracyjny. Cięcie powinno być skierowane prostopadle do powierzchni siatkówki. Ponownie zanurz ostrze żyletki w roztworze neurobiotyny i przetnij siatkówkę po raz drugi. Powtórz tę czynność do 4 cięć na siatkówkę (patrz Rys. 1). Podczas wykonywania cięć żyletką w siatkówkach myszy i innych małych zwierząt należy używać mikroskopu stereoskopowego.
- Jak pokazano na Rys. 1, ponownie zanurz siatkówkę w świeżym medium Ringera, z lekiem testowym lub bez niego, używając płytki 6-dołkowej (5 mL roztworu Ringera/dołek). Inkubuj siatkówkę przez 15 min, aby umożliwić załadowanie i dyfuzję znacznika.
- Przemyj trzy razy po 5 min świeżym medium Ringera, z lekiem testowym lub bez niego.
- Ufiksuj siatkówkę w 4% paraformaldehydzie w 0,1 M buforze fosforanowym (PBS, pH 7,4) przez 1 h w temperaturze pokojowej.
- Przemywaj w 0,1 M PBS przez noc w temperaturze 4°C.
- Następnego dnia inkubuj z 2% streptawidyną-Alexa 488 (stężenie końcowe 10 μg/mL) w 0,1 M PBS + 0,3% Triton X-100 i przechowuj przez noc w temperaturze 4°C.
- Przemyj trzy razy po 10 min w 0,1 M PBS w temperaturze pokojowej.
- W PBS oddziel siatkówkę od papieru filtracyjnego, a następnie, używając cienkiego pędzla, umieść siatkówkę na szkiełku, orientując ją stroną fotoreceptorów do góry.
- Delikatnie zamontuj, używając medium montażowego Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
- Wykonaj zdjęcia za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego (np. Zeiss 510 META) przy tym samym powiększeniu, rozdzielczości i ustawieniach dla każdego warunku eksperymentalnego, aby umożliwić porównanie wpływu różnych warunków (np. leków testowych, warunków oświetlenia) na zakres sprzężenia znacznika w połączeniach szczelinowych (Rys. 2A-C oraz Rys. 4A-C). Chociaż pojedynczy obraz może zawierać wszystkie znakowane komórki, zaleca się zebranie stosu obrazów z (z-stack) obszaru zainteresowania i spłaszczenie go do jednego obrazu.
3. Ilościowe oznaczenie sprzęgania znacznika przy użyciu programu ImageJ
- W przeglądarce obrazów LSM otwórz obraz, kliknij EXPORT i zapisz zdjęcie jako niekompresowany plik TIF-16 bit. Pasek skali powinien być zawarty w tym obrazie TIF.
- Za pomocą oprogramowania NIH ImageJ zmierz intensywność fluorescencji neurobiotyny znakowanej Alexa-488 na obrazach o niskim powiększeniu całych preparatów siatkówki. Otwórz plik TIF w programie ImageJ, a następnie narysuj linię prostą odpowiadającą paskowi skali. Przejdź do ANALYSE, SET SCALE i wprowadź znaną odległość oraz jednostkę długości, a następnie kliknij OK. Teraz wyniki pomiarów mogą być przedstawione w jednostkach skalibrowanych, takich jak milimetry.
- Wybierz obszar zainteresowania za pomocą narzędzia prostokątnego zaznaczenia. Szczyt fluorescencji powinien znajdować się przy lewej krawędzi zaznaczenia. Upewnij się, że w pobliżu prawej krawędzi nie ma sygnału fluorescencyjnego. Jeśli tak jest, obróć aktywny obraz (IMAGE, następnie ROTATE).
- Kliknij ANALYSE i PLOT PROFILE. Powinna pojawić się krzywa z wykładniczym spadkiem od lewej do prawej strony.
- Kliknij COPY w wyskakującym oknie i wklej zawartość do programu EXCEL. Pojawią się dwie kolumny przedstawiające odległość od cięcia (lewa kolumna) oraz intensywność fluorescencji jako funkcję odległości od cięcia (prawa kolumna).
- Podziel każdą surową wartość fluorescencji przez maksymalną wartość fluorescencji, aby uzyskać względną intensywność fluorescencji.
- Skopiuj dwie kolumny odpowiadające odległości od cięcia (X) i względnej intensywności fluorescencji (Y), a następnie wklej je do oprogramowania Origin.
- Dopasuj dane za pomocą funkcji EXPONENTIAL DECAY #1 (Ryc. 2D i Ryc. 4D), która ma postać:
Y = Y0 + Ymax*exp(-x/λ)
gdzie Y to względna intensywność fluorescencji, Yo to fluorescencja tła, Ymax to maksymalna względna fluorescencja, λ to stała przestrzenna (długości), a x to odległość od cięcia. - Porównaj wartości stałej przestrzennej (λ) dla różnych warunków eksperymentalnych za pomocą testu t lub ANOVA (Ryc. 2E i Ryc. 4E). Należy zauważyć, że alternatywne techniki kwantyfikacji zostały opisane przez innych autorów13,14.
4. Reprezentatywne wyniki
Reprezentatywne przykłady sprzężenia znakera w komórkach fotoreceptorów, określone metodą ładowania przez cięcie (cut-loading), przedstawiono na Rysunkach 2 i 3 (ryba) oraz na Rysunku 4 (królik). Obrazy konfokalne wykonano przy użyciu tych samych ustawień w celu porównania (Rys. 2A-C i Rys. 4A-C), a natężenie fluorescencji wykreślono jako funkcję odległości od miejsca cięcia i dopasowano do funkcji wykładniczej opisanej w punkcie 3.8 powyżej (Rys. 2D i Rys. 4D). Wartości stałej przestrzennej dla każdego stanu przedstawiono na Rysunkach 2E i 4E, co ilustruje, że zakres sprzężenia znakera poprzez połączenia szczelinowe może być ilościowo określony przy użyciu techniki ładowania przez cięcie. Dodatkowo wyniki są wysoce powtarzalne. Zastosowanie techniki ładowania przez cięcie jako sposobu ilościowego określania zakresu sprzężenia znakera poprzez połączenia szczelinowe jest również potwierdzone przez fakt, że we wszystkich badanych przypadkach natężenie fluorescencji maleje wykładniczo jako funkcja odległości od miejsca cięcia7,8 (patrz także Rys. 2D i 4D), co wskazuje, że neurobiotyna wniknęła do fotoreceptorów poprzez cięcie żyletką, a nie z innych obszarów siatkówki. Ponadto jakościowo podobna różnica między dniem a nocą w sprzężeniu znakera w komórkach fotoreceptorów, zaobserwowana u złotej rybki przy wstrzykiwaniu znakera do pojedynczych czopków oraz przy ładowaniu przez cięcie7, potwierdza, że ładowanie przez cięcie jest stosunkowo dokładną metodą pomiaru zakresu sprzężenia fotoreceptorów.
Technikę cut-loading można również wykorzystać do badania innych rodzajów synaps elektrycznych w siatkówce. Na przykład Rysunek 5 ilustruje, że króliki typu A (Rys. 5A) i typu B (Rys. 5B) komórki poziome wykazują homologiczne sprzężenie znacznika po zastosowaniu metody cut-loading i dyfuzji neurobiotyny w warunkach adaptacji do ciemności.
| Związek | Ryby | Mysz | Królik |
| NaCl | 130 | 120 | 117 |
| NaHCO33 | 20 | 25 | 30 |
| NaH2PO4 | - | 1 | 0.5 |
| KCL | 2.5 | 5 | 3.1 |
| Glukoza | 10 | 10 | 10 |
| MgCl22 | 1 | - | - |
| MgSO₄4-7H2O | - | 1 | 1.2 |
| Glutamina | - | 0.1 | 0.1 |
| CaCl22 | 0.7 | 2 | 2 |
Tabela 1: Skład roztworów Ringera dla siatkówek złotej rybki, myszy i królika. Stężenia podano w mM. Roztwory Ringera są napowietrzane mieszanką 5% CO2 /95% O2 i utrzymywane w temperaturze 22 °C (ryby) lub 36 °C (ssaki). „-” : składnik nieobecny w roztworze Ringera dla danego gatunku.
Rycina 1.: Schemat przedstawiający procedurę ładowania znaczników poprzez nacięcia. Po wyizolowaniu nienaruszonej siatkówki nerwowej wykonano kilka nacięć radialnych za pomocą ostrza, które uprzednio zanurzono w 0,5% roztworze neurobiotyny. Siatkówkę inkubowano w celu załadowania i dyfuzji znacznika, a następnie przemyto przed utrwaleniem w 4% paraformaldehydzie (PFA) w 0,1M buforze fosforanowym (PB). Sprzęganie znacznika zbadano przy użyciu streptawidyny sprzężonej z Alexa-488.
Rysunek 2. Różnica między dniem a nocą w sprzężeniu znacznika w fotoreceptorach u złotej rybki, wykazana za pomocą techniki ładowania poprzez cięcie. Sprzężenie poprzez połączenia szczelinowe komórek fotoreceptorów z użyciem znacznika neurobiotyny było rozległe w nocy (B) oraz w dzień po zastosowaniu spiperonu (10 μM), selektywnego antagonisty receptorów dopaminergicznych D2 (C), lecz nie występowało w dzień w warunkach kontrolnych (A). D) Znormalizowana względna intensywność fluorescencji w funkcji odległości od cięć (oznaczonych strzałkami na A-C). E) Wartości stałej przestrzennej uzyskane z danych w D oraz z innych eksperymentów (n = 4). ***P < 0,001.
Rysunek 3. Reprezentatywny przykład wykazujący fluorescencję w warstwie komórek fotoreceptorów siatkówki złotej rybki przystosowanej do ciemności w nocy, po wprowadzeniu roztworu neurobiotyny i dekstranu rodaminowego metodą nacięcia (cut-loading). Dekstran rodaminowy (zaznaczony na czerwono), który nie dyfunduje przez otwarte kanały połączeń szczelinowych ze względu na wysoką masę cząsteczkową (> 10 000 MW), znakował jedynie komórki w pobliżu nacięcia. W przeciwieństwie do niego, neurobiotyna (zaznaczona na zielono) dyfundowała przez połączenia szczelinowe i jest widoczna w komórkach fotoreceptorów oddalonych od nacięcia. Miejsce nacięcia jest wskazane strzałką na każdym panelu. Pasek skali: 200 μm.
Rycina 4. Różnica między dniem a nocą w sprzężeniu znacznika fotoreceptorów w siatkówce królika ujawniona za pomocą techniki ładowania przez cięcie (cut-loading). Sprzężenie znacznika neurobiotyny w połączeniach szczelinowych komórek fotoreceptorowych było rozległe w nocy (B) oraz w dzień po zastosowaniu spiperonu (10 μM) (C), ale nie występowało w dzień w warunkach kontrolnych (A). Na obrazach A-C przedstawiono widoki prostopadłe rekonstrukcji 3D fotoreceptorów królika w pobliżu miejsca cięcia. D) Znormalizowana względna intensywność fluorescencji w funkcji odległości od miejsc cięcia. E) Wartości stałej przestrzennej uzyskane z danych w D oraz z innych eksperymentów (n = 3). ***P < 0.001.
Rysunek 5. Metoda cut-loading wykazuje, że ciemnoadaptowane komórki poziome królika są sprzężone za pomocą znacznika. Zarówno komórki poziome typu A (A), jak i typu B (B) w ciemnoadaptowanych siatkówkach królika wykazały homologiczną sprzężenie znacznika neurobiotyny.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda ładowania przez cięcie (cut-loading) jest użyteczną i prostą techniką służącą do określania zakresu sprzęgania markerów poprzez połączenia szczelinowe między neuronami siatkówki w różnych warunkach oświetlenia oraz o różnych porach dnia i nocy. Do zalet tej techniki należy możliwość ilościowego określenia zakresu sprzęgania markerów poprzez połączenia szczelinowe między neuronami w nienaruszonej tkance siatkówki w różnych warunkach oświetlenia w ciągu dnia i nocy, a także możliwość przeprowadzenia takiej analizy dla sprzężonych neuronów o małej średnicy ciał komórkowych. Ograniczenia tej techniki w badaniu połączeń szczelinowych w nienaruszonej tkance dzielą się na dwie ogólne kategorie. Po pierwsze, dyfuzja markera przez otwarte połączenia szczelinowe może być stosunkowo trudna do zaobserwowania ze względu na a) małą średnicę lub ładunek związany z otwartymi kanałami oraz b) względne objętości sprzężonych przedziałów komórkowych1,14,15. Oznacza to, że dyfuzja markera z małej komórki do większej komórki lub grupy komórek sprzężonych, w porównaniu do dyfuzji markera z większej komórki do mniejszej, może być trudniejsza do wykrycia ze względu na rozcieńczenie markera. Po drugie, w niektórych warunkach fizjologicznych zakres dyfuzji markera przez połączenia szczelinowe w nienaruszonej tkance może nie odzwierciedlać dokładnie siły przewodnictwa połączeń szczelinowych ze względu na różnice w przewodnictwie małych jonów przenoszących prąd elektryczny w porównaniu do przepuszczalności stosunkowo dużych cząsteczek markerów1,14,15. Ogólnie rzecz biorąc, dowody na sprzęganie markerów silnie sugerują obecność funkcjonujących, otwartych kanałów połączeń szczelinowych, jednak w niektórych warunkach fizjologicznych dyfuzja markera może nie zachodzić lub nie być obserwowalna, mimo że rejestracje elektrofizjologiczne wskazują na obecność funkcjonujących, otwartych połączeń szczelinowych.
Wydaje się prawdopodobne, że technikę ładowania przez cięcie można wykorzystać również do badania zakresu sprzężenia znakowników poprzez połączenia szczelinowe między neuronami w nienaruszonej tkance z innych obszarów ośrodkowego układu nerwowego.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była finansowana z grantów NIH EY005102 dla S.C.M. oraz EY018640 dla C.P.R.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Metanosulfonian tricainy (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | 150 mg/L buforowanej wody w akwariach rybnych |
| Uretan | Sigma-Aldrich | U2500 | dawka nasycająca 2 g/kg |
| Gogle noktowizyjne z podwójną tubą | Night Optics USA | D-221 | |
| Papier filtracyjny, stopień nr 4 | Whatman, GE Healthcare | 1004-090 | |
| Pęseta precyzyjna, Dumont nr 5, biologiczna, długość 11 cm | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Nożyczki precyzyjne, z pod sprężyną, ostrze 8 mm, proste | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Neurobiotyna | Vector Laboratories | SP-1120 | 0,5% |
| Streptawidyna sprzężona z Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | 2% |
| Rodamina dekstranowa (wysoka masa cząsteczkowa (> 10 000 MW)) | Invitrogen | D1817 | 0,5% |
| Medium montażowe Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Konfokalny mikroskop skaningowy Zeiss 510 META | Carl Zeiss, Inc. | ||
| LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Oprogramowanie ImageJ | National Institutes of Health | ||
| OriginPro 8.0 | OriginLab |
Bibliografia
- Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain. Neuron. 41, 495-511 (2004).
- Connors, B. W., Long, M. A. Electrical synapses in the mammalian brain. Annu. Rev. Neurosci. 27, 393-418 (2004).
- Vaney, D. I. Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin. Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).
- Bloomfield, S. A., Völgyi, B. The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina. Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).
- Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine. Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).
- Xin, D., Bloomfield, S. A. Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina. Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).
- Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling. Neuron. 59, 790-801 (2008).
- Ribelayga, C., Mangel, S. C. Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina. PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).
- Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O'Brien, J. Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway. Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).
- Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP. Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).
- Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes. Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).
- Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimarães, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina. J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).
- Li, H., Chuang, A. Z., O'Brien, J. Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina. J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).
- Mills, S. L., Massey, S. C. The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina. Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).
- Mills, S. L., Massey, S. C. A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina. J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).
Przedruki i uprawnienia
