Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek macierzystych wątroby CD133+ do ekspansji klonalnej

26K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3183

⸱

10 października 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics and Pharmacology, Pennsylvania State College of Medicine, 2Department of Pharmacology, Pennsylvania State College of Medicine, 3Department of Pediatrics, University of California Los Angeles, School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tutaj izolację wykazujących ekspresję CD133 komórek macierzystych wątroby oraz nowotworowych komórek macierzystych z całej wątroby mysiej, co jest procesem wymagającym trawienia tkanki, wzbogacania frakcji komórkowej oraz izolacji metodą cytometrii przepływowej. Przedstawiamy metody zaawansowanej izolacji pojedynczych komórek oraz ekspansji klonalnej.

Streszczenie

Macierzyste komórki wątroby, czyli komórki owalne, proliferują podczas przewlekłego uszkodzenia wątroby i według hipotez różnicują się zarówno w hepatocyty, jak i cholangiocyty. Ponadto zakłada się, że macierzyste komórki wątroby są prekursorami pewnej grupy nowotworów wątroby, takich jak rak hepatokomórkowy. Jednym z głównych wyzwań w badaniach nad komórkami macierzystymi w dowolnym narządzie litego, takim jak wątroba, jest izolacja rzadkiej populacji komórek do szczegółowej analizy. Na przykład ogromna większość komórek w wątrobie to hepatocyty (frakcja parenchymatyczna), które są znacznie większe od komórek nieparenchymatycznych. Poprzez wzbogacanie specyficznych przedziałów komórkowych wątroby (tj. frakcji parenchymatycznej i nieparenchymatycznej) oraz selekcję komórek CD45-ujemnych, jesteśmy w stanie zwiększyć populację wyjściową komórek macierzystych ponad 600-krotnie. Procedury opisane w niniejszym raporcie pozwalają na efektywne sortowanie stosunkowo rzadkiej populacji komórek z narządu litego. Proces ten można wykorzystać do izolacji macierzystych komórek wątroby z normalnej wątroby mysiej, jak i z modeli przewlekłego uszkodzenia wątroby, w których wykazano zwiększoną proliferację macierzystych komórek wątroby. Metoda ta ma wyraźne zalety w porównaniu ze standardową immunohistochemią mrożonej lub utrwalonej w formalinie wątroby, ponieważ po wstępnych eksperymentach z kolokalizacji można przeprowadzić badania funkcjonalne z wykorzystaniem żywych komórek. Aby zrealizować procedurę opisaną w niniejszym raporcie, zdecydowanie zaleca się współpracę z ośrodkiem cytometrii przepływowej o profilu badawczym, ponieważ szczegóły izolacji metodą FACS są w wysokim stopniu zależne od specjalistycznej aparatury i biegłej wiedzy z zakresu podstawowych procedur cytometrii przepływowej. Specyficznym celem tego procesu jest izolacja populacji macierzystych komórek wątroby, które mogą być powielane klonalnie in vitro.

Protokół

Wszystkie roztwory, podłoża, instrumenty, filtry i probówki powinny być sterylne i obsługiwane zgodnie z techniką sterylną, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji. Wszystkie bufory i podłoża należy przygotować z 24-godzinnym wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4°C.

1. Separacja frakcji parenchymalnej i nieparenchymalnej z całej wątroby

  1. Przygotować roztwór enzymów do trawienia w probówce o pojemności 15 cc z nakrętką, w 10 ml sterylnego PBS zawierającego 5 mg kolagenazy, 5 mg pronazy i 1 mg DNazy.
  2. Eutanizować mysz metodą zatwierdzoną przez instytucję (Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt - IACUC), np. poprzez uduszenie CO2. Przetrzeć okolice brzucha eutanatyzowanych zwierząt 70% roztworem etanolu. Za pomocą sterylnych narzędzi otworzyć jamę brzuszną i wyciąć wątrobę w całości. Usunąć pęcherzyk żółciowy z wycięcia wątroby. Przenieść całą wątrobę do dygestorium z laminarnym przepływem powietrza w zamkniętym sterylnym naczyniu.
  3. Tę procedurę wykonuje się w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą sterylnego ostrza żyletki posiekać wątrobę w sterylnym naczyniu przez 1 minutę, wykonując seria cięć poziomych i pionowych. Umieścić ¼ posiekanej masy wątrobowej w probówce 15 cc z 10 cc PBS z kolagenazą, pronazą i DNazą z kroku 1.1 powyżej. Powtórzyć czynność dla każdej z pozostałych części ¼ posiekanej wątroby.
  4. Umieścić probówki z ¼ posiekanej masy wątrobowej i enzymami w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C na 45 minut, przy użyciu wytrząsarki z prędkością 1-2 cykli/sekundę. Po wyjęciu z kąpieli wodnej, a przed przeniesieniem do dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, przetrzeć probówki 70% etanolem.
  5. Tę procedurę wykonuje się w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Przetrzeć strawioną masę wątrobową przez filtr siatkowy o oczkach 70 mikronów do sterylnego naczynia. Używając 2 ml alikwotów sterylnego medium DMEM:F12 z 10% inaktywowaną ciepłem płodową surowicą bydlęcą, wypłukać filtr i za pomocą gumowego końcówki tłoka strzykawki przecisnąć strawioną masę przez filtr. Powtórzyć czynność 5 razy, aby uzyskać całkowitą objętość filtratu wynoszącą około 20 mL. Podzielić filtrat na dwie równe probówki po 15 mL.
  6. Wszystkie przeniesienia powinny być wykonywane w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza; jeśli jest dostępna, należy użyć wirówki chłodzącej w temperaturze 4°C. Wirować przy 50 x g przez 1 minutę. Zebrać supernatant nr 1 i odrzucić osad miąższowy. Wirować supernatant nr 1 przy 50 x g przez 1 minutę. Zebrać supernatant nr 2 i odrzucić osad. Wirować supernatant nr 2 przy 50 x g przez 1 minutę. Zebrać supernatant nr 3 i odrzucić osad. Wirować końcowy supernatant nr 3 przy 180 x g przez 8 minut w celu uzyskania frakcji niepamiąższowej.

2. Lizja krwinek czerwonych

Pracę należy prowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, komórki należy utrzymać w niskiej temperaturze, a roztwory schłodzić do 4°C.

  1. W noc przed procedurą przygotować bufor do lizy erytrocytów, rozcieńczając 10X stężony roztok BD Pharm Lyse w sterylnej wodzie destylowanej w stosunku 1:10. Roztwór 1X należy przechowywać przez 30 dni w temperaturze 4°C.
  2. W noc przed procedurą przygotować bufor Miltenyi, używając sterylnego PBS, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej Albumin oraz 2mM EDTA. Przefiltrować roztwór za pomocą jednostki filtracyjnej próżniowej z filtrem 0,45 mikrona. Przykryć górę jednostki filtrującej oryginalną plastikową pokrywką i zabezpieczyć folią spożywczą. Przechowywać całą jednostkę filtrującą w temperaturze 4°C przez 12 godzin w celu odgazowania EDTA. Po 12 godzinach jednostkę filtrującą można zastąpić standardową sterylną zakrętką.
  3. Procedurę tę wykonuje się w komorze z laminarnym przepływem powietrza. W sterylnej probówce o pojemności 5 ml zawiesić ponownie osad komórek nieparenchymalnych z kroku 1.6 powyżej w 1 mL rozcieńczonego 1X buforu do lizy erytrocytów z kroku 2.1 powyżej. Zakręcić probówkę przed wyniesieniem jej z komory laminarnej.
  4. Delikatnie mieszać na wortexie przez 5 sekund i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4°C, chroniąc przed światłem.
  5. Odwirować przy 20 x g przez 5 minut.
  6. Procedurę tę wykonuje się w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Odrzucić zlizowane erytrocyty znajdujące się w nadłożu i zawiesić ponownie osad w 1 ml schłodzonego do temperatury lodowej, sterylnego buforu Miltenyi.
  7. Odwirować przy 200 x g przez 5 minut.
  8. Procedurę tę wykonuje się w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Odrzucić nadłożu i zawiesić ponownie osad w 1 ml schłodzonego do temperatury lodowej, sterylnego buforu Miltenyi.
  9. Pobrać 10 μl zawiesiny komórkowej w PBS i dodać 10 μl błękitu trypanowego. Policzyć pozostałe komórki nieparenchymalne za pomocą hemocytometru.

3. Usuwanie komórek hematopoetycznych CD45 z frakcji nieparenchymalnej

Pracę należy prowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, komórki należy przechowywać w niskiej temperaturze, a roztwory schłodzić do 4°C.

  1. Resuspender komórki w 10 μL buforu Miltenyi na każde 107 komórek, do maksymalnie 108 komórek łącznie.
  2. Nanieść 20 μL przeciwciał sprzężonych z mikrokulkami Miltenyi CD45 na każde 107 komórek i inkubować w temperaturze 4°C przez 15 minut.
  3. Dodać kolejne 2 ml buforu Miltenyi i odwirować przy 20 x g przez 5 minut. Usunąć nadsącz. Resuspender pellet komórkowy (do 108 komórek łącznie) w 1 ml buforu Miltenyi.
  4. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przefiltrować komórki, używając kolumny magnetycznej Miltenyi LD. Rozpocząć od umieszczenia kolumny w uchwycie magnetycznym (Miltenyi MidiMACS lub QuadroMACS). Pod filtrem umieścić sterylną probówkę o pojemności 5 ml w celu zbierania filtratu. Przygotować kolumnę, nasycając ją 2 ml buforu Miltenyi.
  5. Po zakończeniu płukania wstępnego nanieść komórki na kolumnę LD. Gdy zawiesina komórkowa znajdzie się w kolumnie, dodać 1 ml buforu Miltenyi i powtórzyć płukanie 1 ml buforu Miltenyi jeszcze 2 razy. NIE używać tłoka dołączonego do kolumny w celu przyspieszenia filtracji. Filtratu należy zbierać WYŁĄCZNIE wtedy, gdy filtr znajduje się w uchwycie magnetycznym.
  6. Odwirować zebrany filtrat (około 5 ml, pozostały 1 ml zostaje w kolumnie) komórek nieparenchymalnych pozbawionych CD45 przy 200 x g przez 5 minut. Kolumnę z zatrzymanymi komórkami CD45-dodatnimi wyrzucić.

4. Izolacja komórek CD13-dodatnich za pomocą cytometrii przepłyewej

  1. Przygotuj pożywkę dla komórek owalnych. Jako bazę zastosuj pożywkę DMEM:F12 w stosunku 1:1 z dodatkiem 10% nieaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, a następnie dodaj insulinę (1 μg/ml), HEPES (5 mol/L) oraz penicylinę/streptomycynę (1% obj./obj.). Roztwór należy przefiltrować za pomocą jednostki filtracyjnej próżniowej z filtrem 0,45 mikrona.
  2. Resuspendować komórki w buforze Miltenyi w stężeniu 100 μL na 107 komórki. Dodać 2 μL przeciwciał sprzężonych z CD133-PE. Drugą grupę komórek inkubować z przeciwciałami sprzężonymi z IgG-PE w celu uzyskania kontroli. Trzecią grupę komórek zachować bez barwienia jako kontrolę niebarwioną do analizy FACS.
  3. Inkubować w temperaturze 4°C przez 15 minut w ciemności. Ponownie zawiesić w 2 ml buforu do barwienia. Centryfugować przy 20 x g przez 5 minut. Odlać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu Miltenyi.
  4. Ten etap przeprowadza się zgodnie ze standardowymi procedurami sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej, które mogą być specyficzne dla danej instytucji. Wykorzystując komórki niebarwione oraz komórki barwione IgG PE, należy dostosować parametry sortowania w celu zoptymalizowania bramkowania populacji komórek CD13+. PE (R-fykoerytryna) może być zazwyczaj stosowana w każdym cytometrze przepływowym wyposażonym w laser emitujący światło o długości fali 48 nm. Maksimum emisji dla PE wynosi 575 nm i jest wykrywane w kanale FL-2.

    Uwaga: Przy użyciu aparatów BD FACS Calibur lub BD FACS Vantage oraz programu Cell Quest do gromadzenia danych, wykorzystujemy widok rozproszenia światła przedniego (Forward Scatter) i bocznego (Side Scatter) w skali logarytmicznej do identyfikacji populacji komórek, przy czym rozproszenie boczne ustawiono na 250. Kanały FL1 i FL2 znajdują się w skali logarytmicznej i są ustawione na 50. Parametry te stanowią punkt wyjścia do analizy nieparenchymalnych komórek wątroby i są dostosowywane w zależności od intensywności barwienia populacji pozytywnych i negatywnych.
  5. Wyizoluj populację komórek CD13+, stosując bramkę dla CD13+, a następnie zbierz komórki do sterylnego, filtrowanego medium hodowlanego.

5. Metody hodowli komórkowej

  1. Odwiruj komórki zebrane metodą FACS przy 20 x g przez 5 minut. Resuspender osad komórkowy w pożywce do komórek oval z gęstością około 50 komórek/ml. W początkowych eksperymentach można zastosować wyższe stężenia, do 50 0 komórek/ml, a następnie zmniejszać je wraz z doskonaleniem techniki oraz poprawą ogólnej żywotności i wydajności komórek.
  2. Wysiej komórki na płytki 96-dołkowe pokryte lamininą BD Biocoat, stosując gęstość 10 komórek/cm2. Umieść w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37°C, przy 5% CO2. Po 24 godzinach dodaj czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) (50 ng/nl) oraz czynnik wzrostu naskórka (EGF) (20 ng/ml).
  3. W przypadku pojedynczych komórek, izoluj je bezpośrednio do 50 μl pożywki do komórek oval w każdym dołku płytki 96-dołkowej pokrytej lamininą. Użyj ustawień FACS dla pojedynczych komórek, aby zapewnić rygorystyczną selekcję tylko jednej komórki pozytywnej. Po 24 godzinach dodaj 50 μl pożywki do komórek oval z HGF i EGF, zgodnie z opisem w kroku 5.2. Po 5-7 dniach wymień całkowicie pożywkę.
  4. Gdy rozrastające się kolonie osiągną ponad 50% konfluencji, co zazwyczaj następuje po 2 tygodniach, w zależności od całkowitej liczby wysianych komórek i ich żywotności, komórki można pasażować w stosunku 1:3, zgodnie z poniższym opisem.
  5. Rozdziel komórki, używając Trypsyny 0,05%-EDTA. Nanieś ilość wystarczającą do pokrycia dna dołka, 50-10 μL/dołek na płytce 96-dołkowej. Inkubuj w temperaturze 37°C przez 3-5 minut.
  6. Dodaj 10 μL pożywki do każdego dołka i przenieś całą ciecz do probówki 5 ml. Dodaj 1 mL pożywki do każdej probówki i odwiruj przy 20 x g przez 5 minut.
  7. Resuspender komórki w pożywce i wysiej na naczynie pokryte lamininą, wykorzystując komórki z 1 dołka do wysiania do 3 nowych dołków (stosunek 1:3).

6. Potwierdzenie statusu bipotencjalnego za pomocą RT-PCR

Procedura ta jest szczegółowo opisana w podręczniku protokołu RNeasy, który jest dostarczany wraz z zestawem RNeasy Kit.

  1. Do kolonii na płytkach 96-dołkowych należy użyć kolumienek RNeasy micro. Odessać pożywkę hodowlaną z każdego dołka. Do każdego dołka dodać bezpośrednio 75 μl Buforu RLT (z zestawu RNeasy). Dno płytki zeskrobać sterylną gumową szpatułką (policemanem). Lizat przenieść pipetą do probówki do mikrocentryfugi i mieszać na wirówce wortexowej przez 1 minutę. Do lizatów dodać 70% etanol i wymieszać za pomocą pipety.
  2. Roztwór przenieść na kolumienkę RNeasy umieszczoną w 2 ml probówce zbierającej (dołączonej do zestawu RNeasy) i wirować w mikrocentryfudze przez 15 sekund przy 10 0 rpm. Odrzucić przefiltrowany roztwór.
  3. Ponownie użyć probówki zbierającej. Do kolumienki RNeasy dodać 350 μL Buforu RW1 (z zestawu RNeasy) i wirować przez 15 sekund przy 10 00 rpm w celu przemycia membrany kolumienki. Odrzucić przemyty roztwór.
  4. Do 70 μL Buforu RDD (oba dołączone do zestawu RNeasy) dodać 10 μL roztworu zapasowego DNazy I. Mieszaninę inkubacyjną 80 μL DNazy I w Buforze RDD dodać na membranę kolumienki RNeasy i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Do kolumienki RNeasy dodać 350 μL Buforu RW1 (z zestawu RNeasy) i wirować przez 15 sekund przy 10 00 rpm w celu przemycia membrany. Odrzucić przemyty roztwór oraz probówkę zbierającą.
  6. Umieścić kolumienkę RNeasy w nowej 2 ml probówce zbierającej (z zestawu RNeasy). Do kolumienki RNeasy dodać 50 μL Buforu RPE (z zestawu RNeasy) i wirować przez 15 sekund przy 10 0 rpm w celu przemycia membrany. Odrzucić przemyty roztwór.
  7. Przygotować 80% etanol, używając wody wolnej od RNaz (z zestawu RNeasy). Do kolumienki RNeasy dodać 50 μL 80% etanolu i wirować przez 2 minuty przy 10 0 rpm. Odrzucić przemyty roztwór.
  8. Umieścić kolumienkę RNeasy w nowej 2 ml probówce zbierającej (z zestawu RNeasy) i wirować z maksymalną prędkością przez 5 minut. Odrzucić wszelki przemyty roztwór oraz probówkę zbierającą.
  9. Umieścić kolumienkę RNeasy w nowej 1,5 ml probówce zbierającej (z zestawu RNeasy). Do środka membrany kolumienki dodać 14 μL wody wolnej od RNaz (z zestawu RNeasy) i wirować przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Zebrać filtrat zawierający oczyszczone RNA i przenieść na lód w przypadku natychmiastowego wytwarzania cDNA lub przechowywać w temperaturze minus 80°C do późniejszego użycia.
  10. Odwrotna transkrypcja z użyciem Omniscript. Rozcieńczyć inhibitor RNazy do końcowego stężenia 10 jednostek/ μL w lodowatym 1x Buforze RT. Mieszać na wirówce wortexowej przez 5 sekund, a następnie krótko wirować przez 5 sekund. Przygotować świeżą mieszaninę master mix na lodzie zgodnie ze stroną 13 protokołu Omniscript. Mieszać na wirówce wortexowej przez 5 sekund, a następnie krótko wirować przez 5 sekund. Zaleca się przygotowanie objętości master mix o 10% większej niż suma wymagana dla wszystkich reakcji.
  11. Do poszczególnych probówek zawierających master mix dodać matrycowe RNA. Mieszać na wirówce wortexowej przez 5 sekund, a następnie krótko wirować przez 5 sekund. Inkubować przez 60 min w temperaturze 37°C.
  12. Amplifikacja PCR genów specyficznych dla hepatocytów (Albumin) i cholangiocytów przy użyciu polimerazy DNA HotStarTaq. Przygotować mieszaninę reakcyjną zgodnie ze stroną 15 instrukcji HotStarTaq. Zaleca się rozcieńczenie zapasów starterów do stężenia 20 pm/μl i użycie 1 μL/probówka reakcyjna dla starterów prawego i lewego. W zależności od liczby komórek początkowo użytych do ekstrakcji RNA, zalecamy na początek podzielenie końcowego cDNA pomiędzy 3 probówki reakcyjne (β-aktyna jako kontrola załadunku, Albumin oraz KRT19).
  13. Projekt starterów PCR przedstawiono w Tabeli 1.
  14. Umieścić probówki reakcyjne w termocyklerze. Dla pierwszych eksperymentów zaleca się następujący program: 95°C przez 15 minut x 1 cykl, następnie 95°C przez 30 sekund, 5°C przez 30 sekund, 72°C przez 30 sekund x 35 cykli, a na koniec 72°C przez 10 minut.
  15. Produkty PCR analizuje się za pomocą żelu agarozowego nasyconego bromkiem etydynowym.

7. Potwierdzenie potencjału nowotworowego komórek macierzystych CD13+

  1. Tę procedurę można przeprowadzić na świeżo izolowanych komórkach z kroku 4 lub na komórkach hodowlanych z kroku 5. Zaleca się przeprowadzenie wstępnych eksperymentów z komórkami hodowlanymi, ponieważ świeżo izolowane komórki charakteryzują się niższą żywotnością i mniejszą wydajnością.
  2. Komórki należy trypsynizować, używając Trypsyny 0,05%-EDTA z kroku 5.5 opisanego powyżej. Po 3–5 minutowej inkubacji w temperaturze 37°C do każdej studzienki należy dodać 10 μL pożywki, a następnie przenieść całą ciecz z każdej studzienki do osobnych probówek o pojemności 5 ml (1 studzienka = 1 probówka). Do każdej probówki należy dodać 1 ml pożywki i wirować przy 20 x g przez 5 minut.
  3. Komórki należy resuspendować w 1 ml schłodzonego do temperatury lodowej PBS. Należy pobrać 10 μl zawiesiny komórkowej w PBS i dodać 10 μl błękitu trypanu. Za pomocą metody wykluczania błękitu trypanu należy oznaczyć liczbę żywych komórek. W przypadku stosowania komórek izolowanych metodą FACS, liczba komórek zostanie określona na podstawie zliczenia podczas izolacji FACS.
  4. Komórki należy wirować przy 20 x g przez 5 minut i resuspendować w PBS do stężenia 1 x 106 żywych komórek/10 μl. Należy dodać 10 μl Matrigelu. Sześciotygodniowe myszy nude z niedoborem odporności zostaną poddane wtryskiwaniu podskórnemu przy użyciu igły o rozmiarze 28 G. Należy wstrzyknąć 1 x 106 komórek w 20 μl na jedno miejsce.
  5. Wzrost guza u myszy monitoruje się codziennie. Po uformowaniu się guzów, zazwyczaj po 3–4 tygodniach inkubacji, objętość guza mierzy się za pomocą suwmiarki (wysokość x długość x szerokość).

8. Reprezentatywne wyniki:

W przypadku normalnej, zdrowej wątroby mysiej oczekiwana wydajność komórkowa komórek macierzystych wątroby CD13+ wynosi od 1 0 do 5 0 na wątrobę. Komórki te występują stosunkowo rzadko w nieaktywnej wątrobie i nie wykazują dobrej zdolności do namnażania w hodowli. Nie zalecamy stosowania analizy pojedynczych komórek w przypadku normalnej wątroby, ponieważ wydajność żywych komórek zdolnych do namnażania jest niezwykle niska.

W przypadku wątrób ze znacznymi uszkodzeniami przewlekłymi, takich jak po diecie DDC 0,1% przez 6 tygodni1 lub w wyniku modyfikacji genetycznej prowadzącej do uszkodzenia przewlekłego, np. u myszy MAT1a-/- lub z tkankowo specyficznym knockoutem Pten-/- w wątrobie,2-4 oczekiwana liczba izolowanych komórek wzrasta, osiągając do 10 0 izolowanych komórek/wątroba (Rycina 2). W przypadku stosowania modeli genetycznych kluczowa jest wiedza na temat częstości występowania guzów spontanicznych, ponieważ procedury izolacji komórek macierzystych wątroby powinny być przeprowadzane u zwierząt wolnych od nowotworów. Na przykład, jeśli w modelu MAT1a-/- guzy spontaniczne pojawiają się w 18. miesiącu życia, zaleca się stosowanie zwierząt nie starszych niż 15-16 miesięcy, przed wystąpieniem jakichkolwiek zgłoszonych guzów spontanicznych.

Izolacja pojedynczych komórek z modeli przewlekłego urazu pozwoli na uzyskanie kilku kolonii (3-9 kolonii na płytkę 96-dołkową), które rozwiną się z pojedynczych komórek po opanowaniu procedury i zapewnieniu żywotności komórek. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym kolonii pochodzących z pojedynczych komórek CD13+, które były namnażane przez 7 dni.

Potwierdzenie statusu bipotencjalnego przeprowadza się za pomocą RT-PCR dla Albuminy oraz Krt19. Kolonie powstałe z namnożonych pojedynczych komórek wykażą ekspresję markerów zarówno hepatocytów (Albumin), jak i cholangiocytów (Krt19). Rycina 4 przedstawia ekspresję bipotencjalną w trzech izolowanych koloniach, przy około 25 komórkach/kolonię w 7. dniu.

Komórki macierzyste CD13+ pochodzące z normalnej wątroby oraz z wątroby z chemicznie wywołanym uszkodzeniem (np. dieta z 0,1% DDC przez 6 tygodni) nie tworzą guzów u myszy nago. Komórki macierzyste CD13+ z konkretnych modeli genetycznych (myszy MAT1a-/- lub z swoistą dla wątroby delecją Pten-/-) będą tworzyć guzy u myszy nago, jeśli zostaną wyizolowane późno w przednowotworowej fazie przewlekłego uszkodzenia. Ten fenotyp tworzenia guzów jest obecnie identyfikowany jako komórka macierzysta nowotworu.2-4Na przykład myszy MAT1a-/- rozwijają spontaniczne guzy wątroby w 18. tygodniu życia. Komórki macierzyste wątroby CD13+ wyizolowane w 15-16. tygodniu, podczas późnej fazy przewlekłego uszkodzenia w przebiegu choroby wątroby, tworzą guzy u myszy nago. Rysunek 5 przedstawia reprezentatywne guzy powstałe po obustronnym wstrzyknięciu 1 x 106 komórek namnożonych in vitro z pojedynczych komórek macierzystych wątroby CD13+.

GenStartery typu ForwardStartery typu Reverse
β-Actin5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3'5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3'
Albumin5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3'5'-GCTGGTTGTCATCTTTGT-3'
Keratin 195'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3'5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3'

Tabela 1: Projekt starterów do RT-PCR

Schemat procesu izolacji komórek wątroby; filtracja magnetyczna, CD13-PE, FACS, ekspansja klonalna.
Rysunek 1: Ogólny schemat metod.

Porównanie wykresów kropkowych cytometrii przepływowej; knockout MAT1a vs kontrola; fluorescencja FL-1.
Rysunek 2: Komórki macierzyste wątroby CD13+ zidentyfikowane w silnie wzbogaconej frakcji nieparenchymalnej pozbawionej CD45. Kontrolna, nieuszkodzona wątroba myszy typu dzikiego wykazuje 0,4% komórek CD13+ w wysoko wzbogaconej frakcji nieparenchymalnej z usuniętymi komórkami CD45. W genetycznym nokaucie MAT1a-/-w której populacja CD13 zwiększa się dziesięciokrotnie lub więcej w tej samej silnie wzbogaconej frakcji, stanowiącej model przewlekłego uszkodzenia wątroby.

Obrazy mikroskopowe w kontraście fazowym przedstawiające fazę wzrostu komórek, ukazujące analizę kształtów i struktury komórkowej.
Rysunek 3: Powiększające się kolonie z pojedynczych klonów CD13+. Obrazy w kontraście fazowym czterech kolonii pochodzących z pojedynczych komórek CD13+, namnożonych na 96-dołkowych płytkach pokrytych lamininą.

Wyniki elektroforezy żelowej wykazujące prążki białkowe dla ekspresji beta-aktyny, albuminy i KRT-19.
Rycina 4: Ekspresja genów o potencjale dwukierunkowym w koloniach klonalnie powiększonych z macierzystych komórek wątroby CD13+. W 7. dniu kolonie liczą około 25 komórek. Ekspresja genów wykazuje obecność markera hepatocytów. Albumina oraz marker cholangiocytów Krt19potwierdzając bipotencjalny status komórek CD13+.

Porównanie wzrostu guza u myszy, strzałki wskazują miejsca podskórnych guzów, eksperyment w badaniach onkologicznych.
Rysunek 5: Komórki macierzyste wątroby CD13+ tworzą guzy u myszy nago.Strzałki wskazują guzy rozrastające się 4 tygodnie po podaniu 1x106 Komórki CD13+ wstrzyknięte z MAT1a-/- model. komórki CD13+ z toksycznie indukowanego przewlekłego uszkodzenia wątroby, takiego jak CCl44 lub dieta z 0,1% DDC nie prowadzą do tworzenia guzów. Tworzenie guzów jest wykorzystywane do identyfikacji potencjału złośliwego lub fenotypu komórek macierzystych nowotworu w obrębie populacji komórek macierzystych.

Dyskusja

W przeciwieństwie do układu krwiotwórczego, w którym macierzyste komórki krwiotwórcze odpowiadają za utrzymanie systemu różnicowania komórkowego zastępującego naturalną fizjologiczną wymianę leukocytów, erytrocytów i płytek krwi, macierzyste komórki wątroby lub dorosłe komórki progenitorowe wątroby nie uczestniczą w normalnej homeostazie wątroby.5,6 Po ostrym uszkodzeniu wątroby lub częściowej hepatektomii hepatocyty, jako zróżnicowany nabłonek wątroby, przechodzą kilka rund proliferacji w celu odtworzenia utraconej masy wątroby.5,6 Proliferację macierzystych komórek wątroby obserwuje się jedynie podczas przewlekłych uszkodzeń.1,5-11 Przypuszcza się, że te dorosłe, organospecyficzne komórki macierzyste różnicują się zarówno w hepatocyty, jak i w cholangiocyty.1,5-8 Co ciekawe, ogromna większość nowotworów wątroby rozwija się na tle przewlekłych uszkodzeń, dlatego wysunięto również hipotezę, że macierzyste komórki wątroby są prekursorami części podzbioru nowotworów wątroby.2-4,12-17

Jednym z głównych wyzwań w badaniach nad komórkami macierzystymi wątroby jest izolacja rzadkich populacji komórek do analizy funkcjonalnej. Przykładowo, ogromna większość komórek w wątrobie to hepatocyty, które są znacznie większe niż cholangiocyty i inne mniejsze komórki nieparenchymalne. Poprzez rozdzielenie całej wątroby na frakcje komórkowe (duże hepatocyty – frakcja parenchymalna oraz mniejsze komórki – frakcja nieparenchymalna), a następnie selekcję komórek negatywnych pod kątem CD45 (komórek niehematopoetycznych), jesteśmy w stanie wzbogacić wyjściową populację komórek macierzystych ponad 600-krotnie.1,18-21Należy zaznaczyć, że w żadnym stopniu nie sugerujemy, iż populacja CD133+ jest w 100% czystą populacją komórek macierzystych, lecz wyraźnie reprezentuje ona heterogenną populację komórek o różnej linii i potencjale repopulacyjnym. Jednym z głównych ograniczeń w tej dziedzinie są definicje komórek macierzystych i komórek progenitorowych. W niniejszej pracy używamy terminu „komórka macierzysta” w szerszym znaczeniu, jednak w ścisłej definicji nieparenchymalne komórki CD133+ reprezentują populację progenitorową dwuliniową. Biorąc pod uwagę obecny stan badań nad komórkami macierzystymi i progenitorowymi wątroby, niniejszy raport stanowi punkt wyjścia dla badaczy zainteresowanych tą dziedziną. W miarę pojawiania się nowych markerów, takich jak EpCAM,22,23 czy czynników transkrypcyjnych, takich jak Sox9,24 mogą one zostać włączone do procedury. Przykładowo, zaobserwowaliśmy dość wysoki stopień pokrywania się komórek EpCAM+ i komórek CD133+.

W niniejszym raporcie szczegółowo opisujemy proces izolacji komórek macierzystych z normalnej wątroby mysiej, a także z modeli przewlekłego uszkodzenia wątroby, w których wykazano zwiększoną proliferację komórek macierzystych wątroby. Metoda ta posiada wyraźne zalety w stosunku do standardowej immunohistochemii zamrożonej lub utrwalonej w formalinie wątroby, ponieważ po izolacji można przeprowadzić badania funkcjonalne z wykorzystaniem żywych komórek.1,3,4 Specyficznym celem tego procesu jest wyizolowanie względnie czystej populacji komórek macierzystych wątroby, które mogą być powielane klonalnie in vitro.

Głównym ograniczeniem tej procedury jest fakt, że większość wyizolowanych komórek nie będzie żywotna po cytometrii przepływowej (patrz sekcja Rozwiązywanie problemów). Jest to wynik czasu potrzebnego na przygotowanie komórek oraz licznych procedur wymaganych do oczyszczenia populacji przed izolacją. Jeśli wątroba zostanie poddana trawieniu w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek do natychmiastowej analizy FACS, różnica w wielkości między hepatocytami a innymi komórkami nieparenchymalnymi uniemożliwi skuteczne utworzenie bramki FACS. W przypadku wykorzystania nieparenchymalnych komórek wątroby bez eliminacji komórek hematopoetycznych istnieje ryzyko, że znaczną liczbę komórek CD133+ mogą stanowić komórki pochodzenia hematopoetycznego, które zanieczyszczą tę frakcję. Ponadto, dzięki przepuszczeniu komórek przez filtr Miltenyi, zbierane są jedynie pojedyncze komórki i bardzo małe skupiska komórek. Zapewnia to, że próbka nie zapcha igły wlotowej FACS.

Alternatywy dla tej procedury obejmują modyfikacje pod kątem dowolnego innego markera powierzchniowego komórek, takiego jak CD49f, EpCAM lub kombinacji markerów, na przykład CD133+EpCAM+. W drugiej opublikowanej pracy wykorzystano gradient gęstości do izolacji komórek macierzystych wątroby z frakcji nieparenchymalnej. Procedura ta wymaga użycia ultrawirówki (8000 ×g), znacząco wydłuża czas trwania procesu i w naszym doświadczeniu istotnie zmniejsza wydajność komórkową przed FACS oraz żywotność po FACS.8

Przyszłe eksperymenty obejmą szerszy zakres analizy ekspresji genów, w tym genów wątroby płodowej, takich jak HNF3, HNF4α i αfp. Dodatkowo, w celu potwierdzenia wyników RT-PCR dla komórek w hodowli, można zastosować analizę Western blot oraz immunocytochemię białek wykazujących ekspresję.

Warto zauważyć, że w niedawnych badaniach zidentyfikowano ekspresję CD133 na komórkach gwiaździstych wątroby.25 Obecnie rutynowo badamy nasze próbki pod kątem markerów komórek gwiaździstych (patrz sekcja Rozwiązywanie problemów) i nie stwierdziliśmy znaczącej kontaminacji w naszych frakcjach. Może to wynikać z zastosowania różnych technik trawienia wątroby i izolacji komórek.2,3,26

Biorąc pod uwagę fakt, że większość komórek nie będzie żywotna bezpośrednio po izolacji metodą FACS, zalecamy wysianie komórek, albo w formie populacji CD133+, albo jako pojedyncze komórki, przed ich zastosowaniem u zwierząt. Hodowla in vitro przez 5-7 dni znacząco poprawi wyniki analizy nowotworów. Ponadto, ze względu na trudność izolacji pojedynczych komórek, należy ją przeprowadzać dopiero wtedy, gdy możliwe stanie się namnażanie kolonii z izolowanych populacji CD133+. Bardziej szczegółowa analiza różnych warunków hodowli oraz białek rusztowaniowych, które można wykorzystać do hodowli macierzystych i progenitorowych komórek wątroby, została opracowana przez Lolę Reid. Praca ta dostarcza alternatywnych warunków i modyfikacji, które badacze mogą włączyć do swojego programu badawczego po opanowaniu podstawowych technik izolacji.27,28 Praca dr Reid dostarcza również bardziej szczegółowej analizy biologii linii komórkowych i dojrzewania pomiędzy macierzystymi komórkami wątroby a zróżnicowanymi progenitorami.

W zakresie analizy guzów in vivo sukcesy odnosiliśmy, wykorzystując świeżo wyizolowane komórki oraz komórki pochodzące z klonalnej ekspansji komórek CD133+ in vitro, stosując przede wszystkim 1x106 komórek. Skupiliśmy się na dwóch szczepach genetycznych z przewlekłym uszkodzeniem wątroby: myszach MAT1a-/- oraz myszach z usunięciem genu Pten-/- specyficznym dla wątroby, a jako gospodarzy dla wzrostu guzów wykorzystaliśmy zarówno myszy naga, jak i myszy typu dzikiego. Z naszego doświadczenia wynika, że macierzyste komórki wątroby CD133+ tworzą guzy tylko wtedy, gdy zostaną wyizolowane z modeli znacznego uszkodzenia wątroby o charakterze przednowotworowym. Należy zauważyć, że guzy powstałe z komórek CD133+ zazwyczaj wykazują cechy zarówno raka hepatokomórkowego, jak i raka dróg żółciowych, co sugeruje pochodzenie tych guzów z komórek macierzystych lub progenitorowych.2-4,29

Działania następcze po udokumentowaniu guzów obejmują standardową analizę patomorfologiczną tkanki nowotworowej (barwienie H&E) oraz barwienie immunohistochemiczne. Ponadto guzy można rozdrobić i poddać trawieniu w celu przeprowadzenia analizy FACS lub ponownej hodowli.2-4,30

Podsumowując, szczegółowo opisaliśmy procedurę izolacji, ekspansji oraz podstawowej charakterystyki komórek macierzystych wątroby CD133+ oraz nowotworowych komórek macierzystych CD133+.

Rozwiązywanie problemów:

Zanieczyszczenie CD45:

W przypadku kroku 3, jeśli występuje kontaminacja komórkami CD45+, którą można ocenić poprzez dodanie przeciwciała CD45-FITC przed analizą FACS i izolacją, należy sprawdzić, czy przeciwciało do mikrokulek CD45 nie straciło ważności oraz czy filtrat był zbierany wyłącznie wtedy, gdy filtr znajdował się w uchwycie magnetycznym. Każdy filtrat zebrany w czasie, gdy filtr nie znajdował się w uchwycie magnetycznym, będzie zawierał komórki CD45+.

Niska liczba komórek:

W przypadku nieuszkodzonej wątroby całkowita liczba wyizolowanych komórek nieparenchymalnych CD133+ może być mniejsza niż 10 000. Komórki te występują rzadko w wątrobie w stanie spoczynku. W modelu przewlekłego uszkodzenia, takim jak dieta z 0,1% DDC, liczba ta znacznie wzrośnie do 100 000 komórek. Jeśli całkowita liczba komórek jest znacznie niższa od tych wartości, należy rozważyć kwestię barwienia przeciwciałami do FACS. Należy sprawdzić, czy przeciwciało CD133 nie utraciło daty ważności, ponieważ słabe barwienie skutkuje niską wydajnością. Zalecamy również przeprowadzenie analizy FACS komórek nieparenchymalnych wątroby w celu określenia względnej wielkości populacji przed przystąpieniem do izolacji metodą FACS.

Niska żywotność komórek po FACS:

Jednym z problemów dotyczących żywotności może być sposób i czas przetwarzania komórek. Idealnie cały proces izolacji komórek, kroki 1-4, powinien być przeprowadzony bez żadnych opóźnień między poszczególnymi etapami i zakończony w tym samym dniu. Każde znaczne opóźnienie między krokami 1-4 znacznie obniży żywotność komórek. Drugim problemem wpływającym na żywotność komórek może być ciśnienie płynu osłonowego stosowane podczas izolacji metodą FACS. Zalecamy stosowanie niższego ciśnienia płynu osłonowego. Wreszcie, po izolacji komórki powinny zostać natychmiast wysiane, ponieważ każde znaczące przechowywanie na lodzie po sortowaniu również obniży ich żywotność.

Heterogeniczność nieparenchymalna komórek CD133+:

Niedawne doniesienia wskazują, że komórki gwiaździste wątroby mogą również wykazywać ekspresję CD133 i posiadać pewną plastyczność.25 Dlatego, oprócz weryfikacji genów dw potencjalności za pomocą Albuminy i Krt19, dodatkowa weryfikacja może obejmować geny związane z komórkami gwiaździstymi, takie jak kwaśne białko włókienstwe gliae w spoczynkowych komórkach gwiaździstych oraz aktyna mięśni gładkich alfa i desmina w aktywowanych komórkach gwiaździstych.3,4,26 Ponadto populacja CD133+ reprezentuje szerszą populację progenitorów. Dodanie drugiego markera, takiego jak EpCAM, może pomóc w dalszej rafinacji tej populacji i ograniczeniu heterogeniczności.

Oświadczenia

Dr Rountree otrzymuje wsparcie badawcze od firmy Bayer Pharmaceutics. Dr Ding, dr Crooks, pani Dang i pani VanKirk nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dr Rountree pragnie podziękować za obecne wsparcie finansowe z sieci Children's Miracle Network, National Institute of Health (granty K08DK080928 oraz R03DK088013) oraz American Cancer Society Research Scholar Award (MGO-11651). Dr Rountree zaznacza, że procedura ta została początkowo opracowana i dopracowana dzięki finansowaniu z programu Pediatric Scientist Development Program (grant NICHD K12-HD00850).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM:F12Invitrogen10565-018z czerwienią fenolową
mikrokule CD45Miltenyi Biotec130-052-301
czynnik wzrostu hepatocytówSigma-AldrichH1404
Epidermalny czynnik wzrostuSigma-AldrichE4127
DNazaSigma-AldrichDN251 gram
Kolagenaza DGrupa Roche1088874
PronazaGrupa Roche0165921
sito o gęstości 70 mikronówFisher Scientific352350
Omniscript RTQiagen20511150 reakcji
HotStarTaqQiagen203203
kolumna LD firmy MiltenyiMiltenyi Biotec130-042-901
przeciwciało FACS CD133-PEeBioscience12-1331-82
Płytki pokryte lamininąBD Biosciences35441096-dołkowa
Trypsyna z 0,05% EDTAInvitrogen25300-354100 ml
Zestaw RNeasy Micro KitQiagen7400450 kolumn dla układu 5x105 komórki lub mniej
Pharm LyseBD Biosciences555899stężenie 10X

Bibliografia

  1. Rountree, C. B. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).
  2. Ding, W. CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis. Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).
  3. Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice. Stem Cells. 27, 290-299 (2009).
  4. Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice. Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).
  5. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J. Cell. Physiol. 213, 286-300 (2007).
  6. Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, 45-53 (2006).
  7. Theise, N. D. Gastrointestinal Stem Cells. III. Emergent themes of liver stem cell biology: niche, quiescence, self-renewal, and plasticity. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 189-193 (2006).
  8. Wang, X. The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 100, 11881-11888 (2003).
  9. Greenbaum, L. E., Wells, R. G. The role of stem cells in liver repair and fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 222-229 (2011).
  10. Choi, S. S., Omenetti, A., Syn, W. K., Diehl, A. M. The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 43, 238-244 (2011).
  11. Khurana, S. Scopolamine treatment and muscarinic receptor subtype-3 gene ablation augment azoxymethane-induced murine liver injury. J. Pharmacol. Exp. Ther. 333, 639-649 (2010).
  12. Sell, S., Leffert, H. L. Liver cancer stem cells. J. Clin. Oncol. 26, 2800-2805 (2008).
  13. Lee, J. S. A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells. Nat. Med. 12, 410-416 (2006).
  14. Sell, S., Dunsford, H. A. Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma. Am. J. Pathol. 134, 1347-1363 (1989).
  15. Amin, R., Mishra, L. Liver stem cells and tgf-Beta in hepatic carcinogenesis. Gastrointest Cancer Res. 2, 27-30 (2008).
  16. Tang, Y. Progenitor/stem cells give rise to liver cancer due to aberrant TGF-beta and IL-6 signaling. Proc Natl Acad Sci. 105, 2445-2450 (2008).
  17. Kitisin, K., Pishvaian, M. J., Johnson, L. B., Mishra, L. Liver stem cells and molecular signaling pathways in hepatocellular carcinoma. Gastrointest Cancer Res. 1, 13-21 (2007).
  18. Rountree, C. B. Bone marrow fails to differentiate into liver epithelium during murine development and regeneration. Hepatology. 45, 1250-1260 (2007).
  19. Shimano, K. Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1. Am J Pathol. 163, 3-9 (2003).
  20. Suzuki, A. Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver. Hepatology. , (2008).
  21. Suzuki, A. Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver. J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).
  22. Yamashita, T. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
  23. Yamashita, T., Budhu, A., Forgues, M., Wang, X. W. Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 67, 10831-10839 (2007).
  24. Furuyama, K. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43, 34-41 (2011).
  25. Kordes, C. CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells. Biochem Biophys Res Commun. 352, 410-417 (2007).
  26. Berg, T. Fibroblast Growth Factor 10 is critical for liver growth during embryogenesis and controls of hepatoblast survival via b-catenin activation. Hepatology. , (2007).
  27. Turner, R. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53, 1035-1045 (2011).
  28. Wang, Y. Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds. Hepatology. 53, 293-305 (2011).
  29. Galicia, V. A. Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2. Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).
  30. Ding, W. Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion. Hepatology. 52, 945-953 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Komórki CD133-dodatniecytometria przepływowaizolacja komórekfrakcja nieparenchymalnadeplecja CD45różnicowanie hepatocytówmarker cholangiocytówtest tworzenia guzów
Izolacja komórek macierzystych wątroby CD133+ do ekspansji klonalnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.