Artykuł metodologiczny

Wyłuszczenie oka myszy do zdalnego fenotypowania o wysokiej przepustowości

DOI:

10.3791/3184

⸱

19 listopada 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa, 2Omics Laboratory, University of Iowa, 3School of Dentistry, UCLA, 4Bernard and Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Ophthalmology, College of Physicians and Surgeons, Columbia University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika preparacji ilustruje enukleację oka myszy w celu utrwalenia tkanki w celu przeprowadzenia fenotypowania w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oko myszy jest ważnym modelem genetycznym do translacyjnego badania ludzkiej choroby okulistycznej. Choroby powodujące ślepotę u ludzi, takie jak zwyrodnienie plamki żółtej, zwyrodnienie fotoreceptorów, zaćma, jaskra, siatkówczak i retinopatia cukrzycowa zostały ponownie podsumowane u myszy transgenicznych. 1-5 Większość myszy transgenicznych i nokautowych została wyhodowana przez laboratoria w celu badania chorób nieokulistycznych, ale konserwacja genetyczna między układami narządów sugeruje, że wiele z tych samych genów może również odgrywać rolę w rozwoju i chorobie oczu. W związku z tym myszy te stanowią ważny zasób do odkrywania nowych korelacji genotyp-fenotyp w oku. Ponieważ myszy te są rozproszone po całym świecie, trudno jest je pozyskać, utrzymać i fenotypować w wydajny i opłacalny sposób. W związku z tym większość wysokoprzepustowych okulistycznych badań fenotypowych jest ograniczona do kilku lokalizacji, które wymagają specjalistycznej wiedzy okulistycznej na miejscu w celu zbadania oczu u żywych myszy. 6-9 Alternatywnym podejściem opracowanym przez nasze laboratorium jest metoda zdalnego pozyskiwania tkanek, która może być stosowana w dużych lub małych badaniach oczu transgenicznych myszy. Ustandaryzowane procedury transferu umiejętności chirurgicznych opartych na wideo, fiksacji tkanek i wysyłki pozwalają każdemu laboratorium na pobranie całych oczu od zmutowanych zwierząt i wysłanie ich do fenotypowania molekularnego i morfologicznego. W tym artykule wideo przedstawiamy techniki enukleacji i transferu zarówno niestałych, jak i perfuzyjnych oczu myszy w celu zdalnej analizy fenotypowania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. rozwarstwienie: Wyłuszczenie oka myszy w nieustalonych próbkach

  1. Rozsuń powieki, aby poprawić ekspozycję i dostęp do tylnej powierzchni gałki ocznej.
  2. Umieść zakrzywiony kleszcz opatrunkowy za (pod) kulą ziemską na orbicie (oczodole). Kleszczyk opatrunkowy Mahajan Sharptip to niestandardowy instrument ze spiczastymi końcówkami, aby ułatwić ten krok (patrz tabela materiałów i odczynników).
  3. Zamknij kleszcz i chwyć tkankę łączną oczodołu i nerw wzrokowy za kulą ziemską, uważając, aby nie ścisnąć gałki ziemskiej.
  4. Delikatnie pociągnij kleszcz do góry i oderwij gałkę oczną od orbity. Biała tkanka przypominająca nitkę to nerw wzrokowy.
  5. Umieść oko w PBS. Za pomocą igły o rozmiarze 30 wykonaj pojedynczą ranę kłutą bezpośrednio za rąbkiem, wprowadzając igłę 1-2 mm do gałki ocznej. Dzięki temu utrwalacze, takie jak aldehyd glutarowy, które w inny sposób nie są w stanie przeniknąć do tkanki oka, mogą dostać się bezpośrednio do oka. Stworzenie tej rany kłutej może nie być konieczne, jeśli utrwalacz, taki jak paraformaldehyd lub alkohol, jest w stanie dyfundować do tkanek oka będących przedmiotem zainteresowania.
  6. Umieść całe oko natychmiast w utrwalaczu w celu utrwalenia przez zanurzenie.

2. Ostra sekcja: Wyłuszczenie oka myszy po fiksacji perfuzyjnej

  1. Użyj zakrzywionego kleszcza colibri, aby trzymać powiekę z dala od gałki ziemskiej.
  2. Ustaw zakrzywione nożyczki preparacyjne Westcotta równolegle do kuli ziemskiej, celując w tył orbity.
  3. Przetnij stałą tkankę łączną, która otacza kulę ziemską od strony dolnej, przyśrodkowej, górnej i bocznej.
  4. Umieść zakrzywiony kleszcz za gałką ziemską, chwyć tkankę łączną bez naciskania na gałkę ziemską i pociągnij do przodu, aby wyłuszczyć oko. Ponieważ tkanka łączna oczodołu jest sztywna od fiksacji perfuzyjnej, może być konieczne dodatkowe przecięcie tkanek oczodołu, aby całkowicie uwolnić kulę.

3. Utrwalanie i pakowanie

Wysyłka tkanek musi być zgodna z Twoimi wymaganiami instytucjonalnymi i pocztowymi, w tym odpowiednimi etykietami i opakowaniami. Poniższy protokół jest przykładem wysyłki niezakaźnej próbki biologicznej w temperaturze otoczenia. Wymaga to 3 warstw opakowania, ale nie ma etykiet substancji biologicznej klasy A/B ani ciekłego azotu.

  1. Umieścić oko w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 5 ml z co najmniej 3 ml utrwalaczem lub buforem po utrwaleniu, jeśli utrwalenie jest krótkie. Napisz numer śledzenia na wieczku fiolki i zamknij ją Parafilmem.
  2. Umieść fiolki scyntylacyjne w pojemniku transportowym zatwierdzonym do pobierania próbek biologicznych. Na przykład w naszym instytucie zatwierdzone pojemniki wymagają trzech warstw: szczelnego pojemnika, w którym umieszcza się próbkę, chłonnej warstwy środkowej i ochronnej warstwy zewnętrznej.
  3. Umieść pojemnik w opakowaniu z folią bąbelkową, a następnie w zatwierdzonym laboratoryjnym pojemniku transportowym wraz z odpowiednią dokumentacją.

4. Reprezentatywne wyniki

Badanie histologiczne oczu można przeprowadzić za pomocą różnych metod, w tym barwienia Hematoxylin i Eozyny, wykrywania ekspresji enzymatycznej, transmisyjnej mikroskopii elektronowej i immunohistochemii. Po utrwaleniu przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie, tkankę zatopiono w parafinie i podzielono na mikrotom. W fenotypowaniu wysokoprzepustowym analizujemy odcinki nerwu źrenicowo-wzrokowego, które pobierają próbki ze wszystkich typów tkanek w oku (ryc. 1). Skrawki tkanki badano również pod kątem ekspresji lacZ (ryc. 2), transmisyjnej mikroskopii elektronowej organelli komórkowych (ryc. 3) oraz ekspresji określonych cząsteczek z przeciwciałami (ryc. 4).

W naszej metodzie badania fenotypowego nie było ważne utrzymanie orientacji oka względem strony nosowej (kanta przyśrodkowa) i skroniowej (kanta boczna). Istnieją co najmniej dwie opcje, jeśli konieczna jest orientacja oczu. Po enukleacji zastosowaliśmy lekką kauteryzację do skroniowej rogówki w pozycji godziny trzeciej za pomocą ręcznego urządzenia do kauteryzacji. Zmiana jest widoczna w badaniu histologicznym i nie gubi się podczas przetwarzania jak tusze histologiczne. Minusem jest to, że kauteryzacja uszkadza rogówkę, która może być krytyczną tkanką do badania. Druga opcja wymaga wykwalifikowanego anatoma, który może zidentyfikować przyczepy mięśni zewnątrzgałkowych. Pod mikroskopem stereoskopowym identyfikacja przyczepu mięśnia skośnego dolnego i górnego oznacza dolny i górny oraz aspekt kuli ziemskiej. 3 W przypadku każdej metody orientacji ważne jest, aby śledzić próbkę jako prawe lub lewe oko. Razem umożliwi to dokładną orientację kuli ziemskiej przed przekrojeniem.

Mikrofotografia anatomii oka; sekcje histologiczne; soczewka, siatkówka, rogówka; szczegóły warstwy komórkowej.
Rysunek 1. Obrazy histologiczne oka myszy po zdalnej akwizycji. Oczy myszy wyłuszczono przez ostre rozwarstwienie po utrwaleniu perfuzyjnym z 4% paraformaldehydem. ZA. Przekrój nerwu źreniczno-wzrokowego barwiony Hematoksyliną i Eozyną wykazuje zachowanie wszystkich podstruktur tkankowych. ON, nerw wzrokowy. (zielona skala = 500 mikronów) Ur. Widok normalnej siatkówki w większym powiększeniu pokazuje jej strukturę laminarną: RGC, komórki zwojowe siatkówki; IPL, wewnętrzna warstwa pleksi; INL, wewnętrzna warstwa jądrowa; OPL, zewnętrzna warstwa pleksi; ONL, zewnętrzna warstwa jądrowa (komórka fotoreceptora) (strzałka); IS, wewnętrzne segmenty fotoreceptorów (grot strzały); OS, zewnętrzne segmenty fotoreceptora; RPE, nabłonek barwnikowy siatkówki; C, naczyniówka. (zielona skala = 50 mikronów) C. W porównaniu z normalną siatkówką, ta próbka jest cieńsza z powodu zwyrodnienia fotoreceptorów. ONL, IS i OS są całkowicie nieobecne (strzałka). (zielona skala = 50 mikronów)

Histologia nabłonka rzęskowego; obraz mikroskopowy porównujący warstwy nabłonka, zrębu; szczegóły komórkowe.
Rysunek 2. ekspresja lacZ u myszy transgenicznych. Oczy wyłuszczono rozwarstwieniem i zanurzono w roztworze 1 mg/ml X-gal (5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6, 2 mM MgCl2, 0,02% NP40 i 0,1% deoksycholanu sodu) przez noc w temperaturze 37°C. Oczy utrwalono w 2% formaldehydzie/0,2% aldehydzie glutarowym przez 30 minut i podzielono na mikrotom. Etykiety produktu X-gal (niebieskie): A. Nabłonek rzęskowy, B. nabłonek rogówki i C. warstwa komórek zwojowych siatkówki (RGC) w siatkówce. INL, wewnętrzna warstwa jądrowa; ONL, zewnętrzna warstwa jądrowa.

Struktura siatkówki; Mikrofotografia elektronowa przedstawiająca zewnętrzne segmenty pręcika, komórki RPE, błonę Brucha.
Rysunek 3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Po rozwarstwieniu i utworzeniu rany kłutej, oczy zanurzono w 2,5% paraformaldehydzie / 2,5% aldehydzie glutarowym w 0,1 M buforze fosforanu sodu. Oczy zostały wtórnie utrwalone w 1% tekstroksydzie osmu, stopniowo odwodnione i zatopione w żywicy Spurra. Tkankę podzielono na sekcje o długości fali 90 nm i umieszczono na miedzianych siatkach szczelinowych pokrytych Formvarem i zobrazowano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Na mikrofotografii widoczne są zewnętrzne segmenty fotoreceptora siatkówki neurosensorycznej, melanosomy (M) w nabłonku barwnikowym siatkówki i błona Brucha.

Obraz mikroskopii fluorescencyjnej struktury biofilmu bakteryjnego; Powiększenie w skali 20 mikronów.
Rysunek 4. Immunohistochemiczne znakowanie dysmutazy ponadtlenkowej-3 (zielonej) w ciele szklistym myszy. Oczy wyłuszczono preparacją i poddano utrwaleniu zanurzeniowemu w 4% paraformaldehydzie. Zanurzono je w parafinie i pocięto za pomocą mikrotomu. Wycinki tkanek inkubowano z poliklonalną surowicą króliczą SOD3 rozcieńczoną w stosunku 1:50. Ekspresję SOD3 wykryto przy użyciu koziego przeciwciała drugorzędowego anty-króliczego IgG (H + L)-Alexa Fluor 488. Oznakowanie SOD3 jest pokazane na zielono.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość myszy transgenicznych istnieje w laboratoriach, które nie badają oczu. Nasza technika wideo ilustruje prostą, ustandaryzowaną metodę zdalnego transferu umiejętności chirurgicznych w celu optymalizacji pozyskiwania tkanek z laboratoriów z niewielkim doświadczeniem w pracy z oczami. Ta technika wideo pomaga przezwyciężyć poważną pułapkę w fenotypowaniu o wysokiej przepustowości, która polega na wykorzystaniu ograniczonej liczby specjalistycznych miejsc ze względu na niestandaryzowane metody pobierania i utrwalani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad zapobieganiem ślepocie; Bartly J. Mondino, M.D., Dyrektor Instytutu Okulistycznego im. Julesa Steina, UCLA; oraz Ramiro Ramirez-Solis, Jacqui White i Jeanne Estabel w Instytucie Sangera, Wellcome Trust Genome Campus. Badania te są zgodne z oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystywania zwierząt w badaniach okulistycznych i wizualnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zakrzywione kleszcze opatrunkoweStorz OphthalmicsE1408
Kleszcze opatrunkowe Mahajan SharptipStorz OphthalmicsE1406 (REF SP7-64520)
Zakrzywione nożyczki WestcottStorz OphthalmicsE3321 WH
15° Ostrze mikrochirurgiczne BD BeaverBD Biosciences374881
0,22 Kleszcze do szycia Fine-CastroviejoStorz OphthalmicsE1805
0,12 Kleszcze ColibriStorz Ophthalmics2/132
Igła o rozmiarze 30 BDBiosciences305128
Biohazard MailerFisher Scientific03-523-4
ParafilmFisher Scientific13-374-10
Szklane fiolki scyntylacyjneWheaton4500413033
PBS, pH 7,4Invitrogen70011-044
16% paraformaldehydowamikroskopia elektronowa Sciences15700
2,5% paraformaldehydu / 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanu soduMikroskopia elektronowa Nauki15700 i 16300Zmieszane w laboratorium
50% Mikroskopia elektronowa aldehydu glutarowegoNauki16300
0,25%Mikroskopia elektronowa Formvar Sciences15810
Mikroskopia elektronowasiatką miedzianąM2010-CR
4% Mikroskopia elektronowa tetratlenku osmuNauki19140
Przeciwciało anty-SOD3AbcamAb21974
Kozia anty-królik Alexa Fluor 488InvitrogenA11070
Spurr' s żywica do zatapianiaMikroskopia elektronowa Nauki14300
z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
  2. Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).
  3. Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. In Research Methods For Mutant Mice. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2002).
  4. Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
  5. Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).
  6. Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).
  7. Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).
  8. Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus. Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).
  9. Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology. Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).
  10. Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase. Science. 272, 1026-1029 (1996).
  11. Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness. Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mouse Eye EnucleationTissue FixationRemote PhenotypingSurgical SpecimenOptic NerveConnective TissueScintillation VialParafilm PackagingBubble Wrap BagLiquid Laboratory Shipping

Powiązane artykuły