Technika sekcji przedstawia enukleację oka myszy w celu utrwalenia tkanki do fenotypowania w badaniach wysokoprzepustowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Enukleacja oka myszy w celu zdalnego wysokoprzepustowego fenotypowania
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Oko myszy stanowi ważny model genetyczny dla badań translacyjnych nad chorobami okulistycznymi ludzi. Choroby prowadzące do utraty wzroku u ludzi, takie jak zwyrodnienie plamki żółtej, degeneracja fotoreceptorów, zaćma, jaskra, retinoblastoma oraz retinopatia cukrzycowa, zostały odtworzone u myszy transgenicznych.1-5 Większość myszy transgenicznych i knockout została stworzona przez laboratoria w celu badania chorób pozookulistycznych, jednak konserwatyzm genetyczny między układami narządowymi sugeruje, że wiele z tych samych genów może odgrywać rolę również w rozwoju oka i jego schorzeniach. Zatem myszy te stanowią istotny zasób w odkrywaniu nowych korelacji genotyp-fenotyp w oku. Ponieważ myszy te są rozproszone na całym świecie, ich pozyskanie, utrzymanie i fenotypowanie w sposób wydajny i kosztowo efektywny jest utrudnione. W związku z tym większość wysokoprzepustowych przesiewów fenotypowania okulistycznego jest ograniczona do kilku ośrodków, które wymagają obecności ekspertów okulistyki na miejscu w celu badania oczu żywych myszy. 6-9 Alternatywnym podejściem opracowanym przez nasze laboratorium jest metoda zdalnego pozyskiwania tkanek, która może być stosowana w badaniach oczu myszy transgenicznych na dużą lub małą skalę. Zestandaryzowane procedury przekazywania umiejętności chirurgicznych za pomocą wideo, utrwalania tkanek oraz ich transportu pozwalają każdemu laboratorium na pobranie całych oczu zwierząt mutantów i wysłanie ich do fenotypowania molekularnego i morfologicznego. W niniejszym artykule wideo przedstawiamy techniki enukleacji i transportu mysich oczu, zarówno nieutrwalonych, jak i utrwalonych metodą perfuzji, do zdalnych analiz fenotypowych.
Protokół
1. Disekcja tępa: Enukleacja oka myszy w preparatach niefiksowanych
- Rozszerzyć powieki, aby poprawić ekspozycję i dostęp do tylnej powierzchni gałki ocznej.
- Umieścić zakrzywioną pęsetę opatrunkową za (pod) gałką oczną w oczodole. Pęseta opatrunkowa Mahajan Sharptip jest instrumentem specjalistycznym z ostrymi końcówkami, co ułatwia ten etap (patrz tabela materiały i odczynniki).
- Zamknąć pęsetę i chwycić tkankę łączną oczodołu oraz nerw wzrokowy za gałką oczną, uważając, aby nie ścisnąć gałki.
- Delikatnie pociągnąć pęsetę w górę i wyciągnąć gałkę oczną z oczodołu. Biała, nitkowata tkanka to nerw wzrokowy.
- Umieścić oko w PBS. Używając igły G30, wykonać pojedyncze nakłucie bezpośrednio za limbusie, wprowadzając igłę na 1-2 mm do wnętrza gałki ocznej. Pozwala to utrwalaczom, takim jak glutaraldehyd, które w innym przypadku nie byłyby w stanie przeniknąć przez tkankę oka, na bezpośrednie wniknięcie do wnętrza. Wykonanie tego nakłucia może nie być konieczne, jeśli utrwalacz, taki jak paraformaldehyd lub alkohol, jest w stanie dyfundować do badanych tkanek oka.
- Natychmiast umieścić całe oko w utrwalaczu w celu utrwalenia przez imersję.
2. Precyzyjna sekcja: Enukleacja oka myszy po utrwaleniu perfuzyjnym
- Użyj zakrzywionej pęsety Colibrie, aby odsunąć powiekę od gałki ocznej.
- Zorientuj zakrzywione nożyczki do dyssekcji Westcotta równolegle do gałki ocznej, kierując je w stronę tylnej części orbity.
- Przetnij utrwaloną tkankę łączną otaczającą gałkę oczną od strony dolnej, przyśrodkowej, górnej i bocznej.
- Umieść zakrzywioną pęsetę za gałką oczną, chwyć tkankę łączną, nie naciskając na gałkę, i pociągnij do przodu, aby przeprowadzić enukleację oka. Ze względu na to, że tkanka łączna orbity jest sztywna w wyniku utrwalenia perfuzyjnego, może być konieczne dodatkowe przecięcie tkanek oczodołowych, aby całkowicie uwolnić gałkę oczną.
3. Fixacja i pakowanie
Transport utrwalonych tkanek musi odbywać się zgodnie z wymogami instytucjonalnymi oraz przepisami służb pocztowych, w tym z zastosowaniem odpowiednich etykiet i opakowań. Poniższy protokół stanowi przykład wysyłki niezakaźnej próbki biologicznej w temperaturze otoczenia. Wymaga to zastosowania 3 warstw opakowania, lecz nie wymaga etykiet dla substancji biologicznych klasy A/B ani etykiet dotyczących ciekłego azotu.
- Umieść gałkę oczną w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 5 mL zawierającej co najmniej 3 mL utrwalacza lub buforu po utrwalaniu, jeśli proces utrwalania jest krótki. Zapisz numer identyfikacyjny na zakrętce fiolki i zabezpiecz ją Parafilmem.
- Umieść fiolki scyntylacyjne w zatwierdzonym pojemniku do transportu próbek biologicznych. W naszym instytucie zatwierdzone pojemniki wymagają trzech warstw: szczelnego pojemnika, w którym umieszczona jest próbka, absorbującej warstwy środkowej oraz ochronnej warstwy zewnętrznej.
- Umieść pojemnik w opakowaniu z folii bąbelkowej, a następnie w zatwierdzonym laboratoryjnym pojemniku transportowym wraz z odpowiednią dokumentacją.
4. Reprezentatywne wyniki
Badanie histologiczne oczu można przeprowadzić za pomocą różnych metod, w tym barwienia hematoksyliną i eozyną, wykrywania ekspresji enzymatycznej, transmisyjnej mikroskopii elektronowej oraz immunohistochemii. Po utrwalaniu przez imersję w 4% paraformaldehydzie tkankę zatopiono w parafinie i wykonano jej przekroje na mikrotomie. W fenotypowaniu wysokoprzepustowym analizujemy przekroje źrenica-nerw wzrokowy, które obejmują wszystkie typy tkanek w oku (Rysunek 1). Przekroje tkanek poddano również badaniu pod kątem ekspresji lacZ (Rysunek 2), transmisyjnej mikroskopii elektronowej organelli komórkowych (Rysunek 3) oraz ekspresji specyficznych cząsteczek przy użyciu przeciwciał (Rysunek 4).
W naszej metodzie przesiewowej fenotypów orientacja oka względem strony nosowej (kąt wewnętrzny) i skroniowej (kąt zewnętrzny) nie była istotna. W przypadku, gdy orientacja oka jest konieczna, istnieją co najmniej dwie możliwości. Po enukleacji zastosowaliśmy lekką kauteryzację rogówki po stronie skroniowej na godzinie trzeciej przy użyciu ręcznego kauteryzatora. Zmiana ta jest wyraźna w badaniu histologicznym i nie ulega zatarciu podczas przetwarzania, w przeciwieństwie do tuszów histologicznych. Wadą jest to, że kauteryzacja uszkadza rogówkę, która może być krytyczną tkanką do badania. Druga opcja wymaga doświadczonego anatomy, który potrafi zidentyfikować miejsca przyczepu mięśni pozagałkowych. Pod stereomikroskopem identyfikacja przyczepów mięśnia skośnego dolnego i górnego wyznacza odpowiednio dolny i górny aspekt gałki ocznej.3 Przy zastosowaniu dowolnej z tych metod orientacji ważne jest śledzenie preparatu jako oka prawego lub lewego. Łącznie pozwoli to na dokładną orientację gałki ocznej przed sekcjonowaniem.
Rysunek 1. Histologiczne obrazy oka myszy po zdalnej akwizycji. Oczy myszy zostały enukleowane poprzez ostre rozcięcie po fiksacji perfuzyjnej 4% paraformaldehydem. A. Przekrój źrenica-nerw wzrokowy barwiony hematoksyliną i eozyną wykazuje zachowanie wszystkich podstruktur tkankowych. ON, nerw wzrokowy. (zielony pasek skali = 500 mikronów) B. Widok normalnej siatkówki przy większym powiększeniu ukazuje jej strukturę warstwową: RGC, komórki zwojowe siatkówki; IPL, wewnętrzna warstwa splotowata; INL, wewnętrzna warstwa jądrowa; OPL, zewnętrzna warstwa splotowata; ONL, zewnętrzna warstwa jądrowa (komórka fotoreceptora)(strzałka); IS, wewnętrzne segmenty fotoreceptorów (głowica strzałki); OS, zewnętrzne segmenty fotoreceptorów; RPE, nabłonek barwnikowy siatkówki; C, naczyniówka. (zielony pasek skali = 50 mikronów) C. W porównaniu do normalnej siatkówki, ten preparat jest cieńszy z powodu degeneracji fotoreceptorów. Warstwy ONL, IS i OS są całkowicie nieobecne (strzałka). (zielony pasek skali = 50 mikronów)
Rycina 2. Ekspresja lacZ u myszy transgenicznych. Gałki oczne wyłuskano poprzez tępe rozcięcie i zanurzono na noc w 37°C w roztworze X-gal 1 mg/ml (5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6, 2 mM MgCl2, 0,02% NP40 oraz 0,1% dejksocholanu sodu). Gałki oczne utrwalono w 2% formaldehydzie/0,2% glutaraldehydu przez 30 minut i przekrojono przy użyciu mikrotomu. Produkt X-gal (kolor niebieski) znakuje: A. nabłonek rzęsowy, B. nabłonek rogówki oraz C. warstwę komórek zwojowych siatkówki (RGC) w siatkówce. INL – wewnętrzna warstwa jądrowa; ONL – zewnętrzna warstwa jądrowa.
Rysunek 3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE). Po rozcięciu tępym i wykonaniu rany punkcyjnej oczy utrwalono przez imersję w 2,5% Paraformaldehydzie/ 2,5% Glutaraldehydzie w 0,1M buforze fosforanowym sodu. Oczy poddano wtórnej fiksacji w 1% tetrótlenku osmu, stopniowo odwodniono i zatopiono w żywicy Spurra. Tkankę pocięto na skrawki o grubości 90 nm, umieszczono na miedzianych siatkach pokrytych Formvarem i obrazowano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Mikrograf przedstawia zewnętrzne segmenty fotoreceptorów siatkówki neurosensorycznej, melanosomy (M) w obrębie nabłonka pigmentowego siatkówki oraz błonę Brucha.
Rycina 4. Barwienie immunohistochemiczne dysmutazy ponadtlenkowej-3 (zielony) w ciele szklistym myszy. Gałki oczne usunięto metodą tępej dyssekcji, a następnie poddano fiksacji przez imersję w 4% paraformaldehydzie. Następnie zatopiono je w parafinie i wykonano skrawki za pomocą mikrotomu. Przekroje tkanek inkubowano z króliczym poliklonalnym anty serum SOD3 rozcieńczonym 1:50. Ekspresję SOD3 wykryto przy użyciu przeciwciała wtórnego koziego anty-króliczego IgG (H+L) skoniugowanego z Alexa Fluor 488. Barwienie SOD3 przedstawiono w kolorze zielonym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Większość myszy transgenicznych znajduje się w laboratoriach, które nie przeprowadzają badań oczu. Nasza technika wideo przedstawia prostą, zestandaryzowaną metodę zdalnego przekazywania umiejętności chirurgicznych w celu optymalizacji pozyskiwania tkanek z laboratoriów z niewielkim doświadczeniem w badaniu oczu. Przedstawiona technika pomaga pokonać główną przeszkodę w fenotypowaniu wysokoprzepływowym, jaką jest korzystanie z ograniczonej liczby ośrodków eksperckich ze względu na niestandaryzowane metody pobierania i ut...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Research to Prevent Blindness; Bartly J. Mondino M.D., dyrektor Jules Stein Eye Institute, UCLA; oraz Ramiro Ramirez-Solis, Jacqui White i Jeanne Estabel z Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus. Badanie to jest zgodne z oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zakrzywiona pęseta opatrunkowa | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Pęseta opatrunkowa Mahajana z ostrym końcem | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Zakrzywione nożyczki Westcotta | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| Mikrochirurgiczne ostrze BD Beaver 15° | BD Biosciences | 374881 | |
| Pęseta do szycia Castroviejo 0.22 | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| Pęseta Colibri 0.12 | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Igła G30 | BD Biosciences | 305128 | |
| Koperta do przesyłek biohazard | Fisher Scientific | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Szklane fiolki scyntylacyjne | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyd | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyd/ 2.5% Glutaraldehyd w 0.1M buforze fosforanowym sodu | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Zmieszane w laboratorium |
| 50% Glutaraldehyd | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Miedźiowa siatka z nacięciem (Copper Slot Grid) | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Tetroksyd osmu | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Przeciwciało anty-SOD3 | Abcam | Ab21974 | |
| Kozie przeciwciało anty-królicze Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Żywica do zatapiania Spurr’s | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
Bibliografia
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. In Research Methods For Mutant Mice. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2002).
- Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
- Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).
- Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).
- Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).
- Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus. Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).
- Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology. Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).
- Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase. Science. 272, 1026-1029 (1996).
- Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness. Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
