Obrazowanie uwalniania neuroprzekaźników za pomocą komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych

Streszczenie

Źródło: Lacin, E., et al. Budowa komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER) do optycznej detekcji neuroprzekaźników in vivo. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film przedstawia technikę obrazowania uwalniania neuroprzekaźników in vivo przy użyciu komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER), wyspecjalizowanych komórek reporterowych wstępnie wstrzykniętych do kory myszy. Umieszczona pod mikroskopem dwufotonowym mysz umożliwia wizualizację sygnalizacji wapniowej indukowanej przez neuroprzekaźniki poprzez emisję fluorescencji. Metoda wykorzystuje wiązanie neuroprzekaźników z receptorami sprzężonymi z białkiem G na CNiFER, wyzwalając uwalnianie wapnia i fluorescencję w celu wykrycia aktywności neuroprzekaźników w czasie rzeczywistym.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Implantacja CNiFER do kory myszy

1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie przed operacją. Przygotuj półsterylne pole do operacji, przecierając je 70% etanolem i kładąc czystą pieluchę laboratoryjną.
2. Przygotować pipetę iniekcyjną CNiFER, pociągając szklaną kapilarnę (średnica wewnętrzna 0,53 mm) na pionowym ściągaczu elektrod. Użyj pary kleszczyków z cienką końcówką nr 5, aby złamać końcówkę elektrody do średnicy ~40 μm.
   Uwaga: Najlepiej osiągnąć to pod mikroskopem stereoskopowym z siatką.
3. Znieczulić dorosłą (60-90 dzień po urodzeniu) mysz C57BL/6 izofluranem: 4% (v/v) w celu indukcji i 1,5 do 2,0% (v/v) w celu leczenia podtrzymującego. Użyj szczypania ogona lub palca u nogi, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona.
   Uwaga: Okresowo ponownie szczypaj i oceniaj drganie wąsów podczas operacji, aby ponownie ocenić głębokość znieczulenia.
4. Zakryj oczy maścią okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu. Zamontuj mysz w stereotaktycznej ramce z nausznikami. Utrzymuj temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C za pomocą poduszki grzewczej regulowanej sondą doodbytniczą.
5. Ogol obszar o wymiarach około 5 mm na 12 mm za pomocą golarki elektrycznej dla zwierząt. Zastosuj betadynę, a następnie 70% (v/v) izopropanol. Użyj ostrza skalpela, aby przeciąć i usunąć skórę z powierzchni czaszki. Użyj ostrza skalpela, aby usunąć okostną z powierzchni czaszki. Odsłoń i oczyść powierzchnię czaszki, zgodnie z opisem dla chirurgii stereotaktycznej.
6. Opuść pustą szklaną pipetę do bregmy i zapisz współrzędne przednio-tylne (A/P) i środkowo-boczne (M/L). Odwołując się do atlasu mózgu myszy, oblicz położenie miejsca wstrzyknięcia. Przesunąć pipetę do miejsca docelowego i oznaczyć czaszkę do późniejszego tworzenia okienka.
   Uwaga: Miejsce wstrzyknięcia i okienko zależą od badanego obszaru i rozmieszczenia wypustek uwalniających neuroprzekaźniki lub peptydy w korze mózgowej. Na przykład, w niedawnej publikacji, współrzędne stereotaktyczne +1,0 do +2,0 mm A/P i +1,0 do +2,0 mm M/L zostały wykorzystane do wstrzyknięcia komórek CNiFER do kory czołowej w celu obrazowania in vivo uwalniania dopaminy podczas warunkowania klasycznego.
7. Uformuj okienko o cienkiej czaszce o wymiarach 2 mm x 3 mm.
   Uwaga: Kość w okienku powinna mieć grubość 15-20 μm. Małe białe plamki na kości nie powinny być widoczne, gdy powierzchnia czaszki jest zwilżona, jeśli kość jest wystarczająco cieńsza.
8. Umieść gąbkę nasączoną sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF) na oknie, aby utrzymać ją wilgotną podczas przygotowywania komórek do wstrzyknięcia.
9. Zbierz klon CNiFER, który był hodowany w kolbie T75 do ~80% konfluencji. Odessać pożywkę i przemyć komórki sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Uwaga: Trypsyna jest pomijana w tych krokach.
10. Usunąć PBS i użyć 10 ml ACSF w celu usunięcia komórek z dna kolby. Dziel komórki, aby zdysocjować grudki komórek. Odwirować i ponownie zawiesić osad w 100 μl ACSF. Wirować przez 30 sekund przy 1,400 x g i usunąć supernatant, pozostawiając osad pokryty ACSF. Ten krok pozostawia skupisko komórek w zawiesinie.
11. Napełnij pipetę iniekcyjną przygotowaną w kroku 1.2 olejem mineralnym, załaduj pipetę do nanowtryskiwacza i przesuń tłok, aby wyrzucić małą kulkę oleju. Umieść 5 μl zawiesiny komórek CNiFER na pasku plastikowej folii parafinowej w pobliżu preparatu myszy. Pobrać komórki CNiFER lub kontrolne CNiFER do wyciągniętej pipety.
12. Przesuń pipetę do docelowych współrzędnych X i Y, tj. A/P i M/L zanotowanych w kroku 1.5. Opuść pipetę, przebijając przerzedzoną czaszkę i kontynuuj do ~200-400 μm poniżej powierzchni czaszki, aby zdeponować komórki CNiFER w warstwach 2/3 kory.
13. Wstrzyknąć ~4,6 nl komórek CNiFER w najgłębsze miejsce za pomocą nanoiniektora, zauważyć ruch na granicy faz oleju i komórki, a następnie odczekać 5 minut, aż komórki się rozdzą. Pobrać pipetę ~100 μm i wstrzyknąć kolejne ~4,6 nl komórek CNiFER, odczekać 5 min. Następnie powoli i delikatnie wyjmować pipetę, aby zapobiec cofaniu się CNiFER. Powtórzyć wstrzyknięcia w jedno lub więcej sąsiednich miejsc.
14. Powtórzyć kroki iniekcji 1,8-1,12 z kontrolnymi komórkami HEK293 (tj. klonem HEK293 / TN-XXL / Gqi5 bez receptora sprzężonego z białkiem G [GPCR]). Oddzielić miejsca iniekcji CNiFER i komórek kontrolnych o ~200 μm.
15. Po zakończeniu implantacji komórek przepłucz okienko cienkiej czaszki za pomocą ACSF i poczekaj, aż czaszka wyschnie. Nałóż kroplę kleju cyjanoakrylowego (patrz Materiały) na okno i szybko umieść wstępnie przyciętą sterylną szklankę nakrywkową na kleju. Delikatnie dociśnij szkło nakrywkowe do czaszki przez kilka sekund. Pozostaw klej do wyschnięcia na 2 minuty.
16. Uszczelnij krawędzie szkła nakrywkowego cementem dentystycznym i uformuj zagłębienie wokół okna, aby zatrzymać wodę do zanurzenia.
17. Aby unieruchomić głowę myszy podczas obrazowania, przymocuj specjalnie zbudowaną belkę na głowę z niewielką kroplą kleju cyjanoakrylowego za oknem. Poczekaj, aż klej dokładnie wyschnie, a następnie dodaj dodatkowy cement dentystyczny, aby jeszcze bardziej wzmocnić specjalnie zbudowaną belkę pod głowę.
18. Przykryj resztę powierzchni czaszki, z wyjątkiem okna, warstwą cementu dentystycznego. Upewnij się, że krawędzie skóry są pokryte cementem i pozostaw do wyschnięcia na 20 minut.
19. Po zabiegu należy przerwać podawanie izofluranu i pozostawić mysz na poduszce grzewczej w klatce, aż w pełni wyzdrowieje po znieczuleniu. Wstrzyknąć 5% (w/v) glukozy do soli fizjologicznej (podskórnie [s.c.]) w celu nawodnienia i 0,05 do 0,1 mg/kg buprenorfiny (dootrzewnowej [i.p.], natychmiastowe uwalnianie) w celu znieczulenia pooperacyjnego.
    Uwaga: Aby zminimalizować potencjalną reakcję immunologiczną na ludzkie CNiFERs, należy wstrzykiwać myszy codziennie 20 μl/100 g cyklosporyny (i.p.), zaczynając dzień przed wstrzyknięciem CNiFERs.
20. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej na jedzenie i wodę.

2. Obrazowanie in vivo klonów CNiFER

Uwaga: Obrazowanie na żywo przeprowadza się na myszach przy użyciu mikroskopu dwufotonowego i aparatu mocowanego na głowie. Podczas sesji obrazowania nie jest potrzebne znieczulenie. Podczas obrazowania zwierząt w stanie czuwania ogranicz zagłówek do zaledwie kilku godzin na raz, aby zmniejszyć poziom stresu. Umieść zwierzę w klatce domowej między sesjami obrazowania w celu pobrania jedzenia i wody. Potencjalny stres jest minimalizowany poprzez przyciemnienie świateł w pomieszczeniu i otaczającej części myszy w obudowie.

1. Następnego dnia po zabiegu zamontuj mysz na platformie obrazowania, przykręcając metalowy pałąk na głowę wszczepiony w czaszkę do ramy mocującej głowę.
   Uwaga: Podczas obrazowania wybudzonych myszy sesja obrazowania nie powinna trwać dłużej niż kilka godzin ze względu na potencjalny stres wywołany przez zagłówek.
2. Umieść platformę obrazowania z myszą z ograniczoną głową w mikroskopie obrazowania dwufotonowego wyposażonym w obiektywy zanurzeniowe 10X (0,30 NA) i 40X (0,80 NA).
3. Wkładka filtracyjna sześcian do obrazowania rezonansu fluorescencyjnego (FRET) (Enhanced Cyan Fluorescent Protein [eCFP] and Citrine), która ma zwierciadło dichroiczne przy 505 nm i filtry pasmowo-przepustowe o długości od 460 nm do 500 nm do pomiaru eCFP i od 520 nm do 560 nm do pomiaru cytrynu.
4. Dodaj ACSF do studzienki zawierającej okienko z rozrzedzoną czaszką i opuść obiektyw zanurzenia w wodzie do ACSF. Użyj okularu w połączeniu z lampą rtęciową i kostką filtrującą zielone białko fluorescencyjne (GFP), aby zlokalizować powierzchnię kory i układu krwionośnego poniżej okna.
   Uwaga: Wzór układu krwionośnego pomaga zlokalizować i zobrazować ten sam obszar przez wiele dni obrazowania. Przełącz się na obiektyw 40X zanurzenia w wodzie, aby zlokalizować CNiFER, ręcznie skupiając się na powierzchni kory nad komórkami za pomocą kostki filtra GFP i lampy rtęciowej.
5. Konfiguracja do obrazowania dwufotonowego. Wybierz odpowiednią ścieżkę światła do obrazowania dwufotonowego. W przypadku typowego systemu komercyjnego należy użyć oprogramowania, aby przełączyć się w tryb obrazowania dwufotonowego i przekierować światło do lamp fotopowielacza (PMT) w detektorach bez deskanowania. Włącz femtosekundowy laser impulsowy w bliskiej podczerwieni, wybierz długość fali 820 nm i ustawienie mocy 5-15%.
   Uwaga: 5% mocy zwykle zapewnia ~25 mW na próbce.
6. Ustaw napięcie PMT1 i PMT2 zbliżone do wartości maksymalnej, zwykle 700-1,000 V w zależności od PMT. Ustaw wzmocnienie na 1 dla każdego kanału i wyzeruj pozycję z dla celu.
7. Opuść obiektyw o ~100 do 200 μm od powierzchni kory mózgowej i rozpocznij skanowanie x-y. Dostosuj moc lasera, wzmocnienie i napięcie PMT dla każdego kanału, tj. eCFP i cytrynu, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu fluorescencji CNiFER.
8. Użyj funkcji powiększania w oprogramowaniu, aby ograniczyć obraz do regionu zawierającego komórki CNiFER, a także region tła. Szybkość skanowania nie może być mniejsza niż jedna klatka co 2 sekundy (0,5 Hz) przy 4 μs na piksel. Dostosuj uśrednianie linii, aby uzyskać odpowiedni stosunek sygnału do szumu, np. Uśrednianie Kalmana 2-liniowe.
9. Narysuj obszar zainteresowania (ROI) wokół komórek CNiFER, otaczając około 3 do 4 komórek na płaszczyznę. Skonfiguruj analizę średniej intensywności zwrotu z inwestycji w czasie rzeczywistym. Rozpocznij akwizycję w celu monitorowania fluorescencji CNiFER w czasie.
10. Zbieraj fluorescencję z CNiFER przed i w trakcie manipulacji eksperymentalnych, np. stymulacji elektrycznej, stymulacji rodopsyny kanałowej-2 (ChR2), zachowania, zgodnie z ustaleniami użytkownika.
11. Po zakończeniu eksperymentu obrazowego przywróć mysz do jej klatki domowej. Powtarzaj obrazowanie przez kilka dni, zgodnie z potrzebami. Podczas ponownego obrazowania komórki odwołują się do wcześniej uzyskanego obrazu naczyń krwionośnych w małym powiększeniu, aby zorientować się z powrotem w tym samym polu obrazowania (krok 2.4).
    Uwaga: Wszczepione CNiFER można obrazować przez co najmniej 7 dni.

Materiały