Obrazowanie uwalniania neuroprzekaźników za pomocą komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Implantacja CNiFER do kory myszy

1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie przed operacją. Przygotuj półsterylne pole do operacji, przecierając je 70% etanolem i kładąc czystą pieluchę laboratoryjną.
2. Przygotować pipetę iniekcyjną CNiFER, pociągając szklaną kapilarnę (średnica wewnętrzna 0,53 mm) na pionowym ściągaczu elektrod. Użyj pary kleszczyków z cienką końcówką nr 5, aby złamać końcówkę elektrody do średnicy ~40 μm.
   Uwaga: Najlepiej osiągnąć to pod mikroskopem stereoskopowym z siatką.
3. Znieczulić dorosłą (60-90 dzień po urodzeniu) mysz C57BL/6 izofluranem: 4% (v/v) w celu indukcji i 1,5 do 2,0% (v/v) w celu leczenia podtrzymującego. Użyj szczypania ogona lub palca u nogi, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona.
   Uwaga: Okresowo ponownie szczypaj i oceniaj drganie wąsów podczas operacji, aby ponownie ocenić głębokość znieczulenia.
4. Zakryj oczy maścią okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu. Zamontuj mysz w stereotaktycznej ramce z nausznikami. Utrzymuj temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C za pomocą poduszki grzewczej regulowanej sondą doodbytniczą.
5. Ogol obszar o wymiarach około 5 mm na 12 mm za pomocą golarki elektrycznej dla zwierząt. Zastosuj betadynę, a następnie 70% (v/v) izopropanol. Użyj ostrza skalpela, aby przeciąć i usunąć skórę z powierzchni czaszki. Użyj ostrza skalpela, aby usunąć okostną z powierzchni czaszki. Odsłoń i oczyść powierzchnię czaszki, zgodnie z opisem dla chirurgii stereotaktycznej.
6. Opuść pustą szklaną pipetę do bregmy i zapisz współrzędne przednio-tylne (A/P) i środkowo-boczne (M/L). Odwołując się do atlasu mózgu myszy, oblicz położenie miejsca wstrzyknięcia. Przesunąć pipetę do miejsca docelowego i oznaczyć czaszkę do późniejszego tworzenia okienka.
   Uwaga: Miejsce wstrzyknięcia i okienko zależą od badanego obszaru i rozmieszczenia wypustek uwalniających neuroprzekaźniki lub peptydy w korze mózgowej. Na przykład, w niedawnej publikacji, współrzędne stereotaktyczne +1,0 do +2,0 mm A/P i +1,0 do +2,0 mm M/L zostały wykorzystane do wstrzyknięcia komórek CNiFER do kory czołowej w celu obrazowania in vivo uwalniania dopaminy podczas warunkowania klasycznego.
7. Uformuj okienko o cienkiej czaszce o wymiarach 2 mm x 3 mm.
   Uwaga: Kość w okienku powinna mieć grubość 15-20 μm. Małe białe plamki na kości nie powinny być widoczne, gdy powierzchnia czaszki jest zwilżona, jeśli kość jest wystarczająco cieńsza.
8. Umieść gąbkę nasączoną sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF) na oknie, aby utrzymać ją wilgotną podczas przygotowywania komórek do wstrzyknięcia.
9. Zbierz klon CNiFER, który był hodowany w kolbie T75 do ~80% konfluencji. Odessać pożywkę i przemyć komórki sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Uwaga: Trypsyna jest pomijana w tych krokach.
10. Usunąć PBS i użyć 10 ml ACSF w celu usunięcia komórek z dna kolby. Dziel komórki, aby zdysocjować grudki komórek. Odwirować i ponownie zawiesić osad w 100 μl ACSF. Wirować przez 30 sekund przy 1,400 x g i usunąć supernatant, pozostawiając osad pokryty ACSF. Ten krok pozostawia skupisko komórek w zawiesinie.
11. Napełnij pipetę iniekcyjną przygotowaną w kroku 1.2 olejem mineralnym, załaduj pipetę do nanowtryskiwacza i przesuń tłok, aby wyrzucić małą kulkę oleju. Umieść 5 μl zawiesiny komórek CNiFER na pasku plastikowej folii parafinowej w pobliżu preparatu myszy. Pobrać komórki CNiFER lub kontrolne CNiFER do wyciągniętej pipety.
12. Przesuń pipetę do docelowych współrzędnych X i Y, tj. A/P i M/L zanotowanych w kroku 1.5. Opuść pipetę, przebijając przerzedzoną czaszkę i kontynuuj do ~200-400 μm poniżej powierzchni czaszki, aby zdeponować komórki CNiFER w warstwach 2/3 kory.
13. Wstrzyknąć ~4,6 nl komórek CNiFER w najgłębsze miejsce za pomocą nanoiniektora, zauważyć ruch na granicy faz oleju i komórki, a następnie odczekać 5 minut, aż komórki się rozdzą. Pobrać pipetę ~100 μm i wstrzyknąć kolejne ~4,6 nl komórek CNiFER, odczekać 5 min. Następnie powoli i delikatnie wyjmować pipetę, aby zapobiec cofaniu się CNiFER. Powtórzyć wstrzyknięcia w jedno lub więcej sąsiednich miejsc.
14. Powtórzyć kroki iniekcji 1,8-1,12 z kontrolnymi komórkami HEK293 (tj. klonem HEK293 / TN-XXL / Gqi5 bez receptora sprzężonego z białkiem G [GPCR]). Oddzielić miejsca iniekcji CNiFER i komórek kontrolnych o ~200 μm.
15. Po zakończeniu implantacji komórek przepłucz okienko cienkiej czaszki za pomocą ACSF i poczekaj, aż czaszka wyschnie. Nałóż kroplę kleju cyjanoakrylowego (patrz Materiały) na okno i szybko umieść wstępnie przyciętą sterylną szklankę nakrywkową na kleju. Delikatnie dociśnij szkło nakrywkowe do czaszki przez kilka sekund. Pozostaw klej do wyschnięcia na 2 minuty.
16. Uszczelnij krawędzie szkła nakrywkowego cementem dentystycznym i uformuj zagłębienie wokół okna, aby zatrzymać wodę do zanurzenia.
17. Aby unieruchomić głowę myszy podczas obrazowania, przymocuj specjalnie zbudowaną belkę na głowę z niewielką kroplą kleju cyjanoakrylowego za oknem. Poczekaj, aż klej dokładnie wyschnie, a następnie dodaj dodatkowy cement dentystyczny, aby jeszcze bardziej wzmocnić specjalnie zbudowaną belkę pod głowę.
18. Przykryj resztę powierzchni czaszki, z wyjątkiem okna, warstwą cementu dentystycznego. Upewnij się, że krawędzie skóry są pokryte cementem i pozostaw do wyschnięcia na 20 minut.
19. Po zabiegu należy przerwać podawanie izofluranu i pozostawić mysz na poduszce grzewczej w klatce, aż w pełni wyzdrowieje po znieczuleniu. Wstrzyknąć 5% (w/v) glukozy do soli fizjologicznej (podskórnie [s.c.]) w celu nawodnienia i 0,05 do 0,1 mg/kg buprenorfiny (dootrzewnowej [i.p.], natychmiastowe uwalnianie) w celu znieczulenia pooperacyjnego.
    Uwaga: Aby zminimalizować potencjalną reakcję immunologiczną na ludzkie CNiFERs, należy wstrzykiwać myszy codziennie 20 μl/100 g cyklosporyny (i.p.), zaczynając dzień przed wstrzyknięciem CNiFERs.
20. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej na jedzenie i wodę.

2. Obrazowanie in vivo klonów CNiFER

Uwaga: Obrazowanie na żywo przeprowadza się na myszach przy użyciu mikroskopu dwufotonowego i aparatu mocowanego na głowie. Podczas sesji obrazowania nie jest potrzebne znieczulenie. Podczas obrazowania zwierząt w stanie czuwania ogranicz zagłówek do zaledwie kilku godzin na raz, aby zmniejszyć poziom stresu. Umieść zwierzę w klatce domowej między sesjami obrazowania w celu pobrania jedzenia i wody. Potencjalny stres jest minimalizowany poprzez przyciemnienie świateł w pomieszczeniu i otaczającej części myszy w obudowie.

1. Następnego dnia po zabiegu zamontuj mysz na platformie obrazowania, przykręcając metalowy pałąk na głowę wszczepiony w czaszkę do ramy mocującej głowę.
   Uwaga: Podczas obrazowania wybudzonych myszy sesja obrazowania nie powinna trwać dłużej niż kilka godzin ze względu na potencjalny stres wywołany przez zagłówek.
2. Umieść platformę obrazowania z myszą z ograniczoną głową w mikroskopie obrazowania dwufotonowego wyposażonym w obiektywy zanurzeniowe 10X (0,30 NA) i 40X (0,80 NA).
3. Wkładka filtracyjna sześcian do obrazowania rezonansu fluorescencyjnego (FRET) (Enhanced Cyan Fluorescent Protein [eCFP] and Citrine), która ma zwierciadło dichroiczne przy 505 nm i filtry pasmowo-przepustowe o długości od 460 nm do 500 nm do pomiaru eCFP i od 520 nm do 560 nm do pomiaru cytrynu.
4. Dodaj ACSF do studzienki zawierającej okienko z rozrzedzoną czaszką i opuść obiektyw zanurzenia w wodzie do ACSF. Użyj okularu w połączeniu z lampą rtęciową i kostką filtrującą zielone białko fluorescencyjne (GFP), aby zlokalizować powierzchnię kory i układu krwionośnego poniżej okna.
   Uwaga: Wzór układu krwionośnego pomaga zlokalizować i zobrazować ten sam obszar przez wiele dni obrazowania. Przełącz się na obiektyw 40X zanurzenia w wodzie, aby zlokalizować CNiFER, ręcznie skupiając się na powierzchni kory nad komórkami za pomocą kostki filtra GFP i lampy rtęciowej.
5. Konfiguracja do obrazowania dwufotonowego. Wybierz odpowiednią ścieżkę światła do obrazowania dwufotonowego. W przypadku typowego systemu komercyjnego należy użyć oprogramowania, aby przełączyć się w tryb obrazowania dwufotonowego i przekierować światło do lamp fotopowielacza (PMT) w detektorach bez deskanowania. Włącz femtosekundowy laser impulsowy w bliskiej podczerwieni, wybierz długość fali 820 nm i ustawienie mocy 5-15%.
   Uwaga: 5% mocy zwykle zapewnia ~25 mW na próbce.
6. Ustaw napięcie PMT1 i PMT2 zbliżone do wartości maksymalnej, zwykle 700-1,000 V w zależności od PMT. Ustaw wzmocnienie na 1 dla każdego kanału i wyzeruj pozycję z dla celu.
7. Opuść obiektyw o ~100 do 200 μm od powierzchni kory mózgowej i rozpocznij skanowanie x-y. Dostosuj moc lasera, wzmocnienie i napięcie PMT dla każdego kanału, tj. eCFP i cytrynu, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu fluorescencji CNiFER.
8. Użyj funkcji powiększania w oprogramowaniu, aby ograniczyć obraz do regionu zawierającego komórki CNiFER, a także region tła. Szybkość skanowania nie może być mniejsza niż jedna klatka co 2 sekundy (0,5 Hz) przy 4 μs na piksel. Dostosuj uśrednianie linii, aby uzyskać odpowiedni stosunek sygnału do szumu, np. Uśrednianie Kalmana 2-liniowe.
9. Narysuj obszar zainteresowania (ROI) wokół komórek CNiFER, otaczając około 3 do 4 komórek na płaszczyznę. Skonfiguruj analizę średniej intensywności zwrotu z inwestycji w czasie rzeczywistym. Rozpocznij akwizycję w celu monitorowania fluorescencji CNiFER w czasie.
10. Zbieraj fluorescencję z CNiFER przed i w trakcie manipulacji eksperymentalnych, np. stymulacji elektrycznej, stymulacji rodopsyny kanałowej-2 (ChR2), zachowania, zgodnie z ustaleniami użytkownika.
11. Po zakończeniu eksperymentu obrazowego przywróć mysz do jej klatki domowej. Powtarzaj obrazowanie przez kilka dni, zgodnie z potrzebami. Podczas ponownego obrazowania komórki odwołują się do wcześniej uzyskanego obrazu naczyń krwionośnych w małym powiększeniu, aby zorientować się z powrotem w tym samym polu obrazowania (krok 2.4).
    Uwaga: Wszczepione CNiFER można obrazować przez co najmniej 7 dni.