Izolacja i oczyszczanie rekombinowanych glikoprotein oligodendrocytów mieliny

Streszczenie

Źródło: Jain, R. W., et al. Prosta i wydajna produkcja i oczyszczanie glikoproteiny oligodendrocytów mieliny myszy do eksperymentalnych badań nad autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje izolację i oczyszczanie MOGtag, rekombinowanej glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (MOG) stosowanej w eksperymentalnych badaniach autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE). Protokół obejmuje lizę bakteryjną, sonikację, wirowanie i chromatografię powinowactwa do niklu w celu uzyskania oczyszczonego MOGtag. Białko to umożliwia badania autoimmunizacji za pośrednictwem limfocytów B w modelach stwardnienia rozsianego.

Protokół

Rozdział 1. Zbieranie białka MOGtag

UWAGA: Na tym etapie bakterie będą wytwarzać duże ilości białka MOGtag. Aby zebrać MOGtag, bakterie są najpierw poddawane lizie w buforze Triton X-100, a następnie poddawane sonikacji. MOGtag jest następnie uwalniany z ciał inkluzyjnych i denaturowany imidazolem i guanidyną, w wyniku czego powstaje surowy roztwór białkowy zawierający białko MOGtag.

1. Pobrać jedną podwielokrotność o pojemności 1 ml z jednej z nocnych kultur i przenieść ją do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Osadzać komórki w masie 16 000 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant. Oznacz probówkę TO/N (po indukcji), a następnie umieść osad bakteryjny w zamrażarce o temperaturze -20 °C w celu przyszłej analizy strony SDS (rysunek 2).
2. Rozprowadzić kultury równomiernie w butelkach o pojemności 250 ml zgodnych z wirowaniem z dużą prędkością i od tego momentu przechowywać je na lodzie. Osadzać komórki bakteryjne w temperaturze 22 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
3. Odrzucić supernatant. Przechowywać granulki bakteryjne w temperaturze -20 °C lub przejść do kroku 1.4.
4. Przygotować bufor do lizy (0,1 mg/ml lizozymu jaj kurzych, 0,1% Triton-X (v/v) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS)) przez dodanie 60 μl Triton X-100 i 120 μl 50 mg/ml roztworu podstawowego lizozymu jaj kurzych do 60 ml PBS.
5. Ponownie zawiesić i połączyć wszystkie osady bakteryjne z kroku 1.3 w sumie 30 ml buforu do lizy. Przenieść tę objętość do okrągłodennej probówki o pojemności 50 ml z możliwością wirowania z dużą prędkością. Umieść tę rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C na 30 minut. W czasie inkubacji należy dwukrotnie wstrząsnąć probówką, aby ponownie zawiesić komórki.
6. Po inkubacji przenieś probówkę na lód i poddaj roztwór sonikacji o częstotliwości 20 kHz, amplitudzie 70%, włącz impuls na 3 sekundy, wyłącz impuls na 3 sekundy i pięć impulsów na rundę. Poddaj roztwór sonifikacji przez łącznie sześć rund i pozwól roztworowi ostygnąć na lodzie pomiędzy rundami.
7. Odwirować roztwór o stężeniu 24 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad i powtórzyć czynności 1,5-1,7 jeden raz. Przechowywać granulki w temperaturze -20 °C lub przejść do kroku 1.8.
8. Przygotować bufor A (500 mM NaCl (chlorek sodu), 20 mM Tris-HCl (chlorowodorek tris (hydroksymetylo)aminometanu), 5 mM imidazolu, pH 7,9) dodając 0,8766 g NaCl, 0,09456 g Tris-HCl i 0,01021 g imidazolu do zlewki o pojemności 100 ml. Dodawać wodę, aż objętość osiągnie 28 ml, a następnie dostosować pH roztworu do 7,9. Następnie przenieść roztwór do cylindra z podziałką o pojemności 100 ml i dodawać wodę, aż objętość wyniesie 30 ml.
9. Zawiesić osad z etapu 1.7 w 30 ml buforu A i inkubować ten roztwór w temperaturze 4 °C przez 3 godziny. W tym czasie odważyć 17,2 g chlorowodorku guanidyny.
10. Sonikować roztwór na lodzie, używając tych samych ustawień, co w kroku 1.6. Następnie dodaj 17,2 g chlorowodorku guanidyny do roztworu. Inkubuj to na lodzie przez 1 godzinę, aby rozpuścić białko MOGtag.
11. Odwirować roztwór o stężeniu 24 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i przechowywać go w temperaturze 4 °C do czasu oczyszczenia białka.

2. Oczyszczanie białka

UWAGA: W kolejnych krokach białko MOGtag zostanie oczyszczone przez 4 rundy absorpcji na naładowanej żywicy niklowej (przez znacznik His) i elucję.

1. Przygotuj następujące:
   1. Przygotuj bufor B (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazol, 6 M guanidyna-HCl, pH 7,9). Do zlewki o pojemności 500 ml dodać 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 0,0681 g imidazolu i 114,64 g chlorowodorku guanidyny. Następnie dodaj wodę, aż osiągnie 190 ml i dostosuj pH do 7,9. Przenieść roztwór do cylindra miarowego o pojemności 250 ml i dodawać wodę, aż objętość osiągnie 200 ml.
   2. Przygotować bufor elucyjny (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M imidazol, 6 M guanidyno-HCl, pH 7,9). Do zlewki o pojemności 500 ml dodać 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 6,808 g imidazolu i 114,64 g chlorowodorku guanidyny. Dodaj wodę, aż osiągnie 190 ml i dostosuj pH do 7,9. Przenieść roztwór do cylindra miarowego o pojemności 250 ml i dodawać wodę, aż objętość osiągnie 200 ml.
   3. Przygotować bufor paskowy (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), pH 7,9). Dodać 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 40 ml 500 mM EDTA do zlewki o pojemności 500 ml. Dodaj wodę, aż osiągnie 190 ml i dostosuj pH do 7,9. Przenieść roztwór do cylindra miarowego o pojemności 250 ml i dodawać wodę, aż objętość osiągnie 200 ml.
   4. Przygotować bufor wsadowy (0,1 M siarczan niklu). Dodać 5,257 g siarczanu niklu do zlewki o pojemności 500 ml i dodawać wodę, aż osiągnie 190 ml (UWAGA, nie dotykać siarczanu niklu poza wyciągiem, dopóki siarczan niklu nie zostanie rozpuszczony w wodzie). Po rozpuszczeniu siarczanu niklu przenieś roztwór do cylindra z podziałką o pojemności 250 ml i dodaj wodę, aż objętość osiągnie 200 ml.
2. Rozdzielić 10 ml żywicy niklowej między dwie stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml, które są w stanie wytrzymać siły odśrodkowe powyżej 4 500 x g (po 5 ml w każdej probówce).
3. Naładuj i zrównoważ żywicę niklową:
   1. Umyj żywicę, dodając 40 ml wody do każdej probówki zawierającej żywicę. Ułożyć rurki poziomo na kołysce i pozostawić do mieszania przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu odwirować probówki o stężeniu 4 500 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
   2. Usunąć supernatant przez pipetowanie, aby uniknąć uszkodzenia osadu. Dodać 40 ml buforu ładującego do każdej probówki. Przenieść rurki na kołyskę i pozostawić je na mieszanie przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu odwirować probówki o stężeniu 4 500 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
   3. Odrzucić sklarowany osad, a następnie dodać 40 ml buforu B do probówek. Przenieść rurki na kołyskę i pozostawić je na mieszanie przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu odwirować probówki o stężeniu 4 500 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C, a następnie wyrzucić supernatanty.
4. Opcjonalnie: Pobrać 150 μl rozpuszczonego białka zebranego w kroku 1.11 i przenieść je do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Oznacz probówkę jako preinkubacyjną i zamroź ją w temperaturze -20 °C do przyszłej analizy strony SDS (dodecylosiarczan sodu) (Rysunek 2, Surowy MOGtag).
5. Oczyść białko MOGtag:
   1. Przenieś całą objętość rozpuszczonego białka z kroku 1.11 (~40 ml, minus mała próbka usunięta w kroku 2.4) do pierwszej probówki (Rysunek 1, probówka 1) zawierającej żywicę niklową z kroku 2.3, wymieszaj i umieść poziomo na kołysce w temperaturze 4 °C na 1 godzinę.
   2. Odwirować probówkę o ciśnieniu 4 500 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu przenieść supernatant do drugiej probówki (Rysunek 1, probówka 2) z żywicy niklowej i inkubować zgodnie z opisem w poprzednim kroku. W międzyczasie kontynuuj kroki od 3 do 6 poniżej z rurką 1.
   3. Zawiesić żywicę niklową w probówce 1 na 40 ml buforu elucyjnego i umieścić probówkę poziomo na kołysce w temperaturze 4 °C na 5 minut. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 4 500 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Przenieść sklarowany nad osadem zawierający eluowane białko MOGtag do butelki o pojemności 250 ml z napisem "oczyszczone białko MOGtag" i przechowywać w tej butelce w temperaturze 4 °C. Na każdym etapie elucji należy zebrać powstały supernatant w tej butelce.
   5. Dodać 40 ml buforu paskowego do żywicy niklowej i umieścić poziomo na kołysce na 5 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Odwirować probówkę o stężeniu 4 500 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, a następnie ponownie napełnić żywicę niklową, jak podano w kroku 2.3.
   7. Po zakończeniu przejdź do przodu z drugą rurką, jak wymieniono w kroku 2.5. W sumie 4 rundy absorpcji rozpuszczonego białka z kroku 1.11 na naładowaną żywicę niklową i elucja pozwolą odzyskać większość białka, chociaż w razie potrzeby dodatkowe białko można odzyskać w dodatkowych rundach wchłaniania i elucji.
6. Po zakończeniu czterech (lub więcej) rund absorpcji i elucji, należy przechowywać zebrane oczyszczone białko w temperaturze 4 °C przez noc. Żywica niklowa może być przechowywana w 40 ml 20% roztworu etanolu w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie ponownie potrzebna.

Wyniki

Rysunek 1: Przegląd kroków wymaganych do wytworzenia czystego białka MOGtag. Aby wytworzyć białko MOGtag, bakterie wykazujące ekspresję białka MOGtag są hodowane do dużych gęstości, a następnie indukowane do ekspresji MOGtag ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BL21 E.coli- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		Te bakterie są niezbędne do wytworzenia białka MOGtag. Zapasy glicerolu tych bakterii są dostępne na życzenie.
LB młynek do bulionu	Bioshop	LBL407.1
Ampicillin	Bio basic	AB0028	Rozpuścić proszek do 50% etanolu / 50% H₂O w stężeniu 100 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Ponownie rozpuść proszek do H₂O w temperaturze 1 M i przechowuj w temperaturze -20 °C.
Lizozym jaj kurzych	Bioshop	LYS702.10	Rozpuścić w H₂O w stężeniu 50 mg/ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Technologie życia	20012-027	Komercyjna sól fizjologiczna buforowana fosforanami nie jest wymagana, wystarczy każda standardowa sól fizjologiczna buforowana fosforanami wyprodukowana w laboratorium.
Chlorek sodu	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazole	Bioshop	IMD508.100
Guanidyna-HCl	Sigma	G3272	Jakość musi być większa niż 98% czystości.
0,5 M EDTA	bioshop	EDT111.500
Siarczan niklu (II)	Bioshop	NIC700.500
Żywica wiążąca go	EMD Millipore	69670-3	Przechowywać w 20% etanolu 80% H₂O w temperaturze 4 °C
Bezwodny etanol	Alkohole handlowe	P016EAAN	W razie potrzeby rozcieńczyć wodą.
Lodowaty kwas octowy	Bioshop	ACE222.1
Octan sodu trójwodny	Bioshop	SAA305.500
Albumina surowicy bydlęcej standard	bio-rad	500-0206
Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa dwuwodna	Fisher scientific	BP120-500
Glikol polietylenowy 3350	Bioshop	PEG335.1
glikol polietylenowy 8000	Bioshop	PEG800.1
Sonikator	Fisher scientific	FB-120-110
Dodecylosiarczan sodu	Bioshop	SDS001