Regulacja wzrostu komórek Schwanna in vitro za pomocą techniki nanosekundowego pulsacyjnego pola elektrycznego

Streszczenie

Źródło: Han, J., et.al. Regulacja wzrostu komórek Schwanna za pomocą nanosekundowego pulsacyjnego pola elektrycznego do regeneracji nerwów obwodowych in vitro. J. Vis. Exp. (2024)

Ten film pokazuje zastosowanie techniki nanosekundowego impulsowego pola elektrycznego (nsPEF) do modulowania wzrostu komórek Schwanna (SC). Szybkie impulsy elektryczne indukują przejściowe nanopory w błonach SC, ułatwiając napływ wapnia, który aktywuje szlaki sygnałowe napędzające proliferację SC, dedyferencjację i wydzielanie czynników neurotroficznych. Te odpowiedzi komórkowe zwiększają wsparcie aksonalne, przeżycie neuronów i potencjalną mielinizację, podkreślając nsPEF jako obiecujące narzędzie do naprawy nerwów.

Protokół

1. Rozmrażanie kriokonserwowanych komórek RSC96

1. Rozmrozić kriowiał zawierający 1 ml zawiesiny komórkowej poprzez szybkie wytrząsanie go w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie dodać do probówki wirówkowej zawierającej 4-6 ml kompletnej pożywki hodowlanej i dobrze wymieszać.
2. Wirować przy 1000 x g przez 3-5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 3 ml kompletnej pożywki hodowlanej.
3. Dodać zawiesinę komórkową do kolby hodowlanej (lub naczynia) zawierającej 6-8 ml kompletnej pożywki hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
4. Następnego dnia obserwuj wzrost i gęstość komórek pod mikroskopem.

2. Przejście komórki:

UWAGA: Jeśli gęstość komórek osiągnie 80% -90%, jest gotowa do przejścia.

1. Wyrzuć pożywkę hodowlaną i przepłucz komórki 1-2 razy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) bez jonów wapnia i magnezu.
2. Dodać 0,25% (w/v) trypsyny-0,53 mM EDTA do kolby hodowlanej (1-2 ml dla kolby T25, 2-3 ml dla kolby T75) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-2 minuty.
3. Obserwuj oderwanie komórek pod mikroskopem. Jeśli większość komórek stanie się okrągła i oderwie, szybko zwróć kolbę do obszaru roboczego, delikatnie postukaj w kolbę i dodaj 3-4 ml pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS, aby zatrzymać trawienie.
4. Wymieszać zawartość, odessać roztwór i odwirować przy 1000 x g przez 5 minut. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki, dodając 1-2 ml świeżej pożywki hodowlanej i delikatnie pipetując.
5. Przenieść zawiesinę komórek do nowej kolby T25 w stosunku 1:2 i dodać 7 ml pożywki hodowlanej.

3. Działanie urządzenia nsPEF

1. Ponownie zawiesić komórki RSC96 w 1 ml pożywki hodowlanej DMEM i przenieść je do naczyń kolorymetrycznych z elektrodami po obu stronach.
2. Włącz wyłącznik zasilania.
3. Dostosuj parametry, obracając pokrętło na instrumencie, aby zmienić natężenie pola elektrycznego. Natężenia ustalone w tym badaniu to 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm i 40 kV/cm.
4. Ostrożnie obracaj elektrody, aż pojawią się iskry, pozwalając ogniwom na otrzymanie 5 impulsów nsPEF zgodnie z ustawionym natężeniem pola przed natychmiastowym oddzieleniem dwóch elektrod.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zasilacz wysokiego napięcia dla nsPEF	Matsusada Precision Inc.	AU-60P1.6-L
Pipeta	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
RSC96 Komórki Schwanna	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	STCC30007G-1
Scanister	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
Specjalny do	systemów mikrofalowych	Times M17 / 78-RG217

nsPEF