Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Podsumowanie

Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-actin pozwala na charakterystykę dynamicznych zmian w strukturach cytoszkieletu. W przeciwieństwie do technik wykorzystujących utrwalone preparaty, metoda ta umożliwia szczegółową ocenę zmian czasowych w cytoszkielecie aktynowym w tych samych komórkach przed, w trakcie i po różnych bodźcach fizycznych, farmakologicznych lub zapalnych.

Streszczenie

Śródbłonek mikro naczyniowy pełni ważną rolę jako selektywnie przepuszczalna bariera dla płynów i substancji rozpuszczonych. Połączenia przylegające między komórkami śródbłonka regulują przepuszczalność śródbłonka, a wiele badań wskazało na istotny wkład cytoszkieletu aktynowego w utrzymanie integralności tych połączeń^1-5. Uważa się, że korowy pierścień aktynowy jest ważny dla utrzymania stabilnych połączeń^{1, 2, 4, 5}. Z kolei włókna stresowe aktyny mają generować napięcie dośrodkowe wewnątrz komórek śródbłonka, co osłabia połączenia^2-5. Wiele z tych teorii oparto na badaniach, w których komórki śródbłonka poddawano działaniu mediatorów stanu zapalnego znanych z tego, że zwiększają one przepuszczalność śródbłonka, a następnie utrwalano komórki i znakowano F-aktynę w celu obserwacji mikroskopowej. Badania te zapewniają jednak bardzo ograniczone zrozumienie roli cytoszkieletu aktynowego, ponieważ obrazy utrwalonych komórek stanowią jedynie przekroje czasowe, nie dostarczając informacji o dynamice struktur aktynowych⁵.

Obrazowanie żywych komórek pozwala na uwzględnienie dynamicznej natury cytoszkieletu aktynowego w badaniach nad mechanizmami determinującymi szczelność bariery śródbłonka. Główną zaletą tej metody jest możliwość oceny wpływu różnych bodźców zapalnych na struktury aktynowe w komórkach śródbłonka w tym samym zestawie żywych komórek przed i po zastosowaniu preparatu, co eliminuje potencjalne błędy systematyczne, które mogą wystąpić podczas obserwacji utrwalonych preparatów. Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) są transfektowane plazmidem GFP-β-actin i hodowane do uzyskania konfluencji na szkiełkach podstawkowych. Obrazy time-lapse GFP-aktyny w konfluencyjnych komórkach HUVEC są rejestrowane przed i po dodaniu mediatorów zapalnych, które wywołują zależne od czasu zmiany w szczelności bariery śródbłonka. Badania te umożliwiają wizualną obserwację sekwencji zmian w cytoszkieletu aktynowym, które przyczyniają się do przerwania i późniejszej odbudowy bariery śródbłonka.

Nasze wyniki konsekwentnie wykazują lokalne tworzenie się i obrót bogatych w aktynę lamellipodiów w komórkach śródbłonka. Można również zaobserwować tworzenie i ruch aktynowych włókien stresowych. Analizę częstotliwości powstawania i obrotu lokalnych lamellipodiów przed i po zastosowaniu stymulacji zapalnej można udokumentować za pomocą analizy kymografów. Badania te dostarczają istotnych informacji na temat dynamicznej natury cytoszkieletu aktynowego w komórkach śródbłonka, co może zostać wykorzystane do odkrycia nieznanych wcześniej mechanizmów molekularnych, ważnych dla zachowania integralności bariery śródbłonkowej.

Protokół

1. Transfekcja HUVEC GFP-aktyną

1. Do transfekcji HUVEC można wykorzystać różne metody. Nasze laboratorium stosuje system Nucleofector (Lonza, Bazylea, Szwajcaria) opisany poniżej. Ogólnie należy pracować szybko, aby zwiększyć żywotność komórek i wydajność transfekcji. Każda transfekcja wymaga 5 x 10⁵ komórek HUVEC, które zostaną wysiane na dwa szklane zakrywki (Corning nr 1, 22 x 50 mm). System Nucleofector łączy elektroporację z odczynnikami chemicznymi w celu transfekcji plazmidowego DNA i zazwyczaj pozwala osiągnąć wydajność ekspresji >50%. Alternatywną metodą jest stosowanie chemicznych odczynników do transfekcji. Jedna z grup z sukcesem przeprowadziła transfekcję komórek śródbłonka bydlęcego GFP-aktyną przy użyciu odczynnika GenePORTER⁶. Protokół Nucleofector, którego używamy, opisano poniżej.
2. W zależności od rodzaju komory można stosować sterylizowane naczynia hodowlane lub zwykłe zakrywki. Szklane zakrywki należy sterylizować w komorze z laminarnym przepływem powietrza, umieszczając je na 2 min w płytce hodowlanej 10 cm zawierającej około 5 ml 70% etanolu. Należy je wyjąć sterylną pęsetą i pozostawić do wyschnięcia, opierając je o ściankę oddzielnej płytki hodowlanej.
3. Po wyschnięciu każdą zakrywkę należy umieścić w oddzielnej płytce hodowlanej 10 cm. Na środek zakrywki należy nanieść pipetą kroplę 300 μL ciepłego roztworu żelatyny (1,5% w 0,9% NaCl), pozostawić na 5 min, a następnie odessać nadmiar. Utrzymanie tej powłoki matrycy w centrum, bez dotykania krawędzi, zapewni gęste wysianie komórek i szybkie osiągnięcie konfluencji.
4. Na każdą transfekcję należy przygotować jedną probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL z 500 μL pożywki EGM2MV (Lonza) i odstawić ją do inkubatora w temperaturze 37°C i 5% CO₂.
5. Komórki HUVEC należy odczepić przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA i zebrać do probówki stożkowej 15 mL. Należy policzyć komórki. Do każdej transfekcji wymagane jest 5 x 10⁵ komórek. Należy dostosować objętość zawiesiny komórkowej tak, aby uzyskać pellet zawierający 5 x 10⁵ komórek pomnożone przez liczbę planowanych transfekcji.
6. Zawiesinę komórkową należy wirować w wirówce klinicznej przy 5000 rpm przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Należy odessać supernatant, przechylając probówkę, aby usunąć jak największą ilość pożywki.
7. Pellet należy resuspendować w Basic Nucleofector Solution z zestawu HUVEC lub Primary Endothelial Cell Nucleofector Kit (Lonza). Należy użyć 100 μL na 5 x 10⁵ komórek. Ze względu na toksyczność tego roztworu, ważne jest, aby szybko pracować w czasie, gdy komórki znajdują się w tej zawiesinie.
8. Do próbki do transfekcji należy dodać plazmid wektora GFP-β-aktyny (0,2-2 μg na 100 μL zawiesiny do Nucleofectora). Stosuje się 0,2-2 μg plazmidowego DNA GFP-aktyny na 5 x 10⁵ komórek na każdą transfekcję.
9. Należy przenieść 100 μL zawiesiny komórkowej do kuwety Nucleofector. Kuwetę należy przykryć i kilkukrotnie stuknąć, aby upewnić się, że zawiesina komórkowa dotarła do dna.
10. Kuwetę należy umieścić w gnieździe urządzenia Nucleofector II i uruchomić wybrany program elektroporacji. Dla HUVEC stosujemy program A-034.
11. Kuwetę należy przenieść z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Należy wyjąć z inkubatora (37°C) jedną z probówek zawierających 500 μL EGM2MV. Używając jednej z pipet transferowych dostarczonych w zestawie Nucleofector, należy delikatnie dodać ciepłe 500 μL pożywki do zawiesiny komórkowej w kuwecie. Całą zawartość kuwety należy przenieść z powrotem do probówki do mikrowirówki i umieścić w inkubatorze na 15 min, aby umożliwić regenerację komórek.
12. W razie potrzeby należy powtórzyć kroki 9-11 dla kolejnych komórek do transfekcji.
13. Jedną probówkę do mikrowirówki zawierającą 600 μL zawiesiny przetransfekowanych HUVEC można wysiać na dwie zakrywki. W komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając mikropipety 1000 μL, należy delikatnie raz pipetować zawiesinę w górę i w dół w celu wymieszania, a następnie nanieść 300 μL zawiesiny bezpośrednio na zakrywkę pokrytą żelatyną. Nie wolno dopuścić do kontaktu zawiesiny z krawędzią zakrywki. Próbki należy inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez 1-4 h, aby umożliwić przyleganie komórek.
14. Po 1-4 h należy sprawdzić przetransfekowane komórki, aby potwierdzić ich przytwierdzenie do zakrywki. Następnie należy dodać 10 mL pożywki EGM2MV i ponownie umieścić płytkę w inkubatorze 37°C/5% CO₂. Ekspresję GFP-aktyny można zazwyczaj zaobserwować w ciągu 4-8 godzin. Eksperymenty są zazwyczaj przeprowadzane w ciągu 24-48 h.

2. Przygotowanie komory do obrazowania żywych komórek oraz grzałki stołu

1. W większości naszych badań wykorzystywaliśmy otwartą komorę diamentową firmy Warner Instruments (RC22) umieszczoną w podgrzewaczu stołu PH-1, zasilaną systemem grawitacyjnego przepływu. Dostępnych jest jednak wiele opcji dla modułów do obrazowania żywych komórek, w tym komory mieszczące naczynia hodowlane z szklanym dnem, komory otwarte i zamknięte, a także różne kombinacje mikroinkubatorów/podgrzewaczy obiektywów oraz duże systemy inkubacyjne. Ostateczny wybór komory zależy od czynników takich jak konieczność dostępu do kąpieli w celu dodania czynnika testowego lub leku, to czy medium będzie statyczne czy w przepływie oraz czas trwania eksperymentu. Ponadto czynniki takie jak niestabilność temperatury mogą powodować dryf ostrości, co można zminimalizować dzięki systemom kontrolnym utrzymującym stabilną temperaturę kąpieli i obiektywu.
2. Odmierz odpowiednią ilość medium do eksperymentu. Odmierzamy 50 ml fizjologicznego roztworu soli z albuminą (APSS; Tabela 1) na każdą godzinę trwania eksperymentu.
3. Do dostarczania medium do komory można użyć pompy lub systemu przepływu grawitacyjnego. W naszym systemie dodajemy APSS do prostego systemu grawitacyjnego zbudowanego z linii do przepływu dożylnego, podłączonej do grzałki przepływowej (model SH-27A firmy Warner Instruments). Stosujemy przepływ na poziomie około 40 mL/h.
4. W przypadku użycia otwartej komory kąpieli, takiej jak nasza, nałóż smar próżniowy na zewnętrzną krawędź dolnej części komory diamentowej za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem. Następnie wyjmij z inkubatora jedno szkiełko nakrywkowe z naniesionymi komórkami i ostrożnie podnieś je pęsetą. Delikatnie dotknij tylnej strony szkiełka chusteczką Kimwipe, aby wchłonąć nadmiar medium, dbając o to, by strona z komórkami pozostała wilgotna. Kładąc komórki stroną górną, nałóż komorę diamentową na szkiełko nakrywkowe, aby utworzyć komorę.
5. Szybko umieść komorę w podgrzewaczu stołu i ręcznie dokręć zaciski nad komorą. Głównym problemem na tym etapie jest możliwość wyschnięcia komórek. Dlatego ważne jest, aby pracować szybko, a po zakończeniu natychmiast pipetować _˜1 mL medium do komory, aby zapobiec wyschnięciu komórek.
6. Nasza komora umożliwia stały przepływ medium nad komórkami. Bezpośrednio przed włączeniem przepływu należy podłączyć wąż próżniowy do uchwytu w komorze, aby umożliwić odpływ nadmiaru medium hodowlanego (APSS). Na tym etapie należy również włączyć grzałkę przepływową oraz grzałkę kąpieli (do 37 °C). Nasz system posiada również sondę termistora do monitorowania temperatury, którą należy umieścić na krawędzi kąpieli.
7. Ostrożnie przemyj dolną stronę szkiełka nakrywkowego chusteczką Kimwipe nasączoną 70% EtOH, aby usunąć pozostałości medium EGM2MV i osady soli. Przetrzyj ponownie suchą chusteczką Kimwipe lub papierem do soczewek.
8. Po przygotowaniu komory, uruchomieniu przepływu i ustabilizowaniu temperatury na poziomie 37 °C, odczekaj co najmniej 30 minut, aby komórki mogły się przystosować i ustabilizować przed rozpoczęciem eksperymentu.
9. W czasie oczekiwania włącz wszystkie komponenty mikroskopu do obrazowania żywych komórek (lampy, kontroler koła filtrów, kamerę, komputer).

3. Pozyskiwanie danych za pomocą mikroskopu do obrazowania żywych komórek

1. • Dostępnych jest wiele systemów mikroskopii żywych komórek. Nasz system to Nikon Eclipse TE-2000U z następującymi komponentami:
   • lampa ksenonowa Sutter Instruments Lambda LS 300 W
   • koło filtrów wzbudzenia Sutter Instruments Lambda 10-3 z funkcją SmartShutter i filtrem S492 (do zastosowań UV i RFP dostępne są również filtry wzbudzenia D350 i S572)
   • emitter dichroiczny 2002bs (Nikon 61002m)
   • obiektyw CI Plan Fluor 10X DLL, NA 0.30 (Nikon MRH10100)
   • obiektyw Plan Fluor ELWD 40X DM, NA 0.60 (Nikon MRH08420)
   • obiektyw Plan Apo VC 100X Oil, NA 1.40 (Nikon MRD01901)
   • kamera Photometrics CoolSNAP HQ2, matryca obrazująca 1392 x 1040, piksele 6.45 x 6.45 μm
     (Roper Scientific)
   • Posiadamy również dwa pakiety oprogramowania do akwizycji obrazów: Nikon Elements-AR 3.0 oraz Metamorph 6.1.
2. Po obejrzeniu komórek i znalezieniu odpowiedniego obszaru do badań, zablokuj pokrętło grubego ustawienia ostrości i sprawdź ustawienia akwizycji w oprogramowaniu, aby:
   1. koło filtrów było ustawione na filtr S492 (oznaczony w naszej konfiguracji jako „FITC”)
   2. w oprogramowaniu do akwizycji obiektyw był ustawiony zgodnie z pożądanym powiększeniem (nasz mikroskop nie jest zmotoryzowany, ale to ustawienie określa stosunek μm/piksel). Upewnij się również, że soczewka optivar w mikroskopie jest ustawiona na powiększenie 1.0X. Ustawienie optivaru na 1.5X może zwiększyć powiększenie, jednak kosztem utraty intensywności sygnału.
      Stosowane powiększenie zależy od celów badania. Aby uzyskać najlepsze szczegóły, obiektyw 100X z wysoką aperturą numeryczną zapewni najlepszą rozdzielczość przestrzenną i transmisję sygnału. Nasz mikroskop jest również wyposażony w obiektyw 40X z dużą odległością roboczą, przeznaczony do innych zastosowań wymagających dodatkowej przestrzeni. Obiektyw ten może być jednak przydatny, gdy chcemy obserwować kilka komórek jednocześnie i sprawdza się przy oglądaniu struktur wielkości organelli, choć odbywa się to kosztem utraty rozdzielczości przestrzennej i intensywności sygnału. W przypadku każdego badania, w którym punktem końcowym jest intensywność sygnału, lub w bardziej zaawansowanych technikach obrazowania, takich jak mikroskopia plamkowa fluorescencyjna, zaleca się stosowanie obiektywu 100X.
   3. czas ekspozycji kamery był ustawiony w zakresie 0.5-2 s. Zależy to od intensywności GFP-aktyny w komórkach. Zazwyczaj stosujemy najkrótszy możliwy czas ekspozycji, aby uniknąć fotobielenia GFP-aktyny oraz potencjalnej toksyczności dla komórek.
   4. Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość, binning powinien być ustawiony na 1 x 1, a Gain na 1. W niektórych przypadkach ustawialiśmy binning na 2 x 2 w celu skrócenia czasu ekspozycji, jednak zmniejsza to precyzję pomiarów obiektów ruchomych w badaniu time-lapse.
   5. skonfigurowano ustawienia time-lapse:
      1. Wybierz folder do zapisywania przechwyconych obrazów i wpisz nazwę pliku.
      2. Ustaw liczbę obrazów oraz czas interwału dla eksperymentu. Zazwyczaj stosujemy interwał od 15 s do 1 min między obrazami i czas trwania do 2 h.
      3. Upewnij się, że aktywna migawka jest ustawiona tak, aby była zamknięta pomiędzy akwizycjami.
3. Przed rozpoczęciem akwizycji obrazów time-lapse wyłącz światła w pomieszczeniu i wykonaj pojedyncze zdjęcie, aby sprawdzić ustawienia.
4. Wykonaj również obraz w świetle przechodzącym. Upewnij się, że kondensator jest ustawiony na odpowiedni filtr fazowy lub DIC. Włącz lampę halogenową i wykonaj obraz. Wyłącz lampę halogenową.
5. Powróć do ustawień „FITC” dla obrazowania time-lapse i wykonaj obraz testowy.
6. Przystąp do rejestracji serii time-lapse.
   Podczas eksperymentu ważne jest monitorowanie obrazów w miarę ich pozyskiwania. W niektórych przypadkach niewielkie zmiany temperatury w komorze mogą spowodować dryf ostrości. Można tego uniknąć, optymalizując linie doprowadzające gaz i próżniowe, tak aby przepływ nad komórkami był stabilny. Pomocne może być również ograniczenie ruchu w pomieszczeniu z mikroskopem oraz przekierowanie przeciągów z sufitowych nawiewów powietrza w stronę przeciwną do mikroskopu. Alternatywą, która sprawdziła się w naszym doświadczeniu, jest zastosowanie komór inkubacyjnych 37 °C/5% CO₂ obejmujących cały stolik i obiektyw. Zapewniają one możliwość monitorowania komórek przez noc lub dłużej, ale dostęp do komórek jest ograniczony.
   W razie potrzeby przerwij akwizycję time-lapse i ponownie ustaw ostrość obrazu. Wykonaj ponowne ustawienie ostrości jak najszybciej, aby nie zmienić interwału czasowego między obrazami.
7. Typowy protokół składa się z 20-30 minut rejestracji obrazów bazowych przed dodaniem substancji testowej, a następnie z 0.5 do 4 godzin dodatkowej akwizycji obrazów. Długość eksperymentu może być ograniczona przez fotobielenie GFP w czasie, dlatego ważne jest wybranie jak najkrótszego czasu ekspozycji. W przypadku chęci przeprowadzenia dłuższego badania można również zmienić interwał między obrazami time-lapse na 30-60 s.

4. Analiza danych

1. Do analizy zestawów obrazów można wykorzystać kilka pakietów oprogramowania, takich jak NIS Elements, Metamorph, Slidebook itp. Zazwyczaj przeprowadzamy analizę obrazów za pomocą NIH ImageJ, co umożliwia analizę na dowolnym komputerze w naszym laboratorium lub w domu. Wersje, których używamy, to:
   MBF ImageJ (http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ )
   FIJI (http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji).
2. ImageJ może być wykorzystywany do analizy wielu procesów dynamicznych, w tym:
   • Częstotliwości protrusions lamellipodia
   • Dystansu, czasu i prędkości protrusions
   • Ruchu włókien aktynowych w czasie
   Program Nikon Elements zapisuje obrazy time-lapse jako plik „ND”. Aby otworzyć taki plik w ImageJ, należy go przekonwertować na serię TIF za pomocą funkcji „export ND document”. Stosy obrazów z programu Metamorph można otwierać w ImageJ bez modyfikacji. Jedną z opcji, którą wybieramy podczas otwierania serii TIF w ImageJ, jest konwersja do 8-bitowej skali szarości. Ułatwia to oglądanie, ponieważ korekty jasności i kontrastu będą stosowane do całej serii, a nie tylko do pojedynczego wyświetlanego obrazu.
3. W programie ImageJ, po otwarciu zestawu obrazów, w lewym górnym rogu okna wyświetli się numer przekroju/całkowita liczba przekrojów, a także nazwa pliku, liczba pikseli, typ i rozmiar pliku. Pasek przewijania Z na dole odpowiada czasowi. Dodatkowo, najechanie kursorem na obraz wyświetli współrzędne pikseli x, y i z na dole paska narzędzi ImageJ.
4. Protrusions lamellipodia można badać, określając liczbę nowych protrusions w czasie. Można to zrobić dla całego obwodu komórki lub wybranego obszaru. Ten rodzaj analizy można przeprowadzić również w niekonfluentnych, nieztransfekowanych komórkach przy użyciu mikroskopii w kontraście fazowym lub DIC. Jednak zastosowanie komórek wykazujących ekspresję GFP-aktyny pozwala na analizę konfluentnych monowarstw, szczególnie gdy komórki zawierające i niezawierające GFP-aktyny znajdują się obok siebie.
5. Dystans, trwałość (czas) i prędkość protrusions lamellipodia można ocenić za pomocą analizy kymografu (skanowania liniowego). Należy narysować linię prostopadłą do krawędzi komórki (jest to najłatwiejsze, gdy w pobliżu nie ma innej komórki lub gdy sąsiednia komórka nie wykazuje ekspresji GFP-aktyny). W programie ImageJ naciśnięcie klawisza „/” wygeneruje kymograf, w którym oś x reprezentuje dystans, a oś y czas (od 15 s do 1 min na piksel, zgodnie z powyższymi wytycznymi dotyczącymi interwałów czasowych). Nad wysuniętymi lamellipodia można narysować linie i zmierzyć wymiary ramki (naciskając klawisz M w ImageJ). Następnie można obliczyć dystans, czas i prędkość.
6. Ruch włókien stresowych można również mierzyć za pomocą analizy kymograficznej w podobny sposób.

5. Reprezentatywne wyniki:

Stosując nasz protokół transfekcji, zazwyczaj obserwujemy ekspresję GFP-aktyny w co najmniej 50% przetransfekowanych HUVEC, a często udaje się znaleźć obszary na szkiełku podstawnym, gdzie >90% HUVEC w danym regionie wykazuje ekspresję GFP-aktyny. Przykład eksperymentu z obrazowaniem żywych komórek dla subkonfluencyjnych HUVEC wykazujących ekspresję GFP-aktyny przedstawiono w Filmie 1. W tym konkretnym eksperymencie obraz był pozyskiwany raz na minutę. Jak widać na filmie, GFP-aktyna w komórkach HUVEC jest widoczna w całej cytoplazmie, a także w strukturach włóknistych i lokalnych lamellipodiach wystających wzdłuż krawędzi komórki. Z filmu wynika również, że ekspresja GFP-aktyny nie jest jednolita pomiędzy komórkami. Komórki wybrane do badań zazwyczaj posiadają wystarczającą ilość GFP-aktyny, aby zwizualizować różne struktury zawierające aktynę włóknistą. Komórki wykazujące bardzo wysoki poziom ekspresji GFP-aktyny mogą być problematyczne w badaniach, ponieważ w takich komórkach zazwyczaj trudno jest odróżnić struktury F-aktyny od wysokiej zawartości obecnej G-aktyny.

Film 2 przedstawia przykład zachowania konfluentnych komórek HUVEC wykazujących ekspresję GFP-aktyny. Podobnie jak w przypadku subkonfluentnych komórek HUVEC, widoczne było aktywne tworzenie i obrót lamellipodiów wzdłuż obwodów komórek. Jednakże lamellipodia te często prowadziły do powstawania fałdów błonowych (ruffles), co wskazywało na mniej wydajną protruzję⁷. Jest to prawdopodobnie spowodowane obecnością sąsiednich komórek blokujących pobliskie podłoże. W filmach 1 i 2 widoczne są również korowe włókna aktynowe oraz pasma naprężenia. Chociaż obserwowane komórki pozostawały stacjonarne, pasma naprężenia są podobne do poprzecznych włókien łukowych w komórkach migrujących, tworząc się w pobliżu krawędzi komórki i przemieszczając się bocznie w stronę centrum komórki, gdzie ulegają rozłożeniu^{8, 9}. Dodatkową cechą dynamiczną zaobserwowaną w tych komórkach było tworzenie struktur pierścieni aktynowych rozszerzających się koncentrycznie, wcześniej nazwanych chmurami aktynowymi¹⁰.

Przykład kwantyfikacji odległości, trwałości oraz prędkości wypustek komórkowych z tych zestawów obrazów time-lapse przy użyciu analizy kymograficznej przedstawiono na Rysunku 1. Na Rysunku 1A narysowano linię o szerokości jednego piksela, przebiegającą mniej więcej prostopadle do krawędzi komórki, w celu wygenerowania kymografu (Rysunek 1B). W tym kymografie obszar zdefiniowany przez linię został umieszczony pionowo, a obrazy z całego procesu time-lapse ułożono poziomo. Patrząc od lewej do prawej na kymografie, wypustki są reprezentowane jako ruchy w górę krawędzi komórki. Na Rysunku 1C na krawędzi jednej z tych wypustek nałożono linię, a powiązane z nią dane pikselowe zostały zebrane i przedstawione w oknie Wyników (Results) na dole panelu. Analiza ta umożliwia kwantyfikację dynamiki wypustek i może być również wykorzystana do oszacowania częstotliwości powstawania wypustek (liczba wypustek/czas) w tym regionie komórki.

Przykład analizy ruchu włókien stresowych przedstawiono na rysunku 2. Większość obserwowanych przez nas włókien stresowych powstawała w pobliżu obwodu komórki i przemieszczała się w stronę centrum komórki, gdzie ostatecznie ulegały rozpadowi. Można to również określić ilościowo za pomocą analizy kymograficznej. Rysuje się linię prostopadłą do krawędzi komórki oraz do włókien stresowych (Rysunek 2A), a następnie generuje kymograf (Rysunek 2B). Włókna stresowe pojawiają się na kymografie jako ciągłe linie w obszarze cytoplazmy, często przemieszczając się w dół i w prawo (w stronę centrum komórki). Czasami włókna są trudne do dostrzeżenia na oryginalnym kymografie; w takich przypadkach stosujemy filtr maski wyostrzającej (unsharp mask), aby poprawić ostrość obrazu (Rysunek 2C). Na włóknach stresowych rysuje się linie, a dane pikselowe są zbierane za pomocą funkcji pomiaru (measure) (Rysunek 2D). Alternatywnym sposobem zbierania tych danych jest narysowanie linii od początku do końca zidentyfikowanego włókna stresowego, aby uzyskać średni nachylenie dla czasu trwania obserwacji włókna (Rysunek 2E). Analiza ta pozwala na ilościowe określenie bocznego ruchu włókien stresowych, a także może być wykorzystana do policzenia liczby włókien stresowych zaobserwowanych w tym regionie komórki.

Rysunek 1. Analiza kymograficzna brzegu komórki w celu wyznaczenia odległości, czasu trwania (persistencji) i prędkości wysuwania lokalnych lamellipodiów. A. Linia o szerokości jednego piksela jest rysowana niemal prostopadle do brzegu komórki. Obszar ten jest wyodrębniany z każdego obrazu z serii time-lapse, aby utworzyć montaż tego regionu w czasie. B. Na powstałym kymografie oś x reprezentuje czas (przesuwający się od lewej do prawej), a oś y reprezentuje odległość. Na tym kymografie można ocenić ruch brzegu komórki w czasie; lamellipodia są identyfikowane jako obszary, w których przesuwający się w prawo brzeg komórki przemieszcza się w górę. C. Na brzegu komórki, w miejscu zidentyfikowanego wysunięcia lamellipodium, rysowana jest linia. Następnie pobierane są wymiary prostokąta ograniczającego narysowaną linię (pokazane w nałożonym oknie). Szerokość jest wykorzystywana do obliczenia czasu trwania lub persistencji wysunięcia. Wysokość służy do obliczenia odległości wysunięcia. Prędkość wysunięcia oblicza się, dzieląc wysokość przez szerokość. W tym przykładzie odległość w górę wynosiła 96 pikseli x 0,16125 μm/pixel = 15,5 μm, a czas wynosił 11 pikseli x 1 min./pixel = 11 min. Prędkość obliczono jako 15,5 μm/11 min. = 1,4 μm/min.

Rysunek 2. Analiza kymograficzna ruchu aktynowych włókien stresowych. A. W celu wygenerowania kymografu narysowano linię o szerokości jednego piksela prostopadle do krawędzi komórki. B. Jak pokazano na Rys. 1, na otrzymanym kymografie oś x reprezentuje czas, a oś y odległość. Włókna stresowe są widoczne jako ciągłe linie wewnątrz komórki, często biegnące w dół i w prawo (strzałki). C. Aby lepiej zwizualizować włókna stresowe, można zastosować filtr maski niesostrej. W tym przykładzie zastosowano promień 3 pikseli i wagę maski 0,60. D. Następnie nad zidentyfikowanym włóknem stresowym rysowane są linie o szerokości jednego piksela i zbierane są dane. Na tym panelu narysowano trzy linie, a następnie wybrano opcję „delete”, aby stworzyć trwałe oznaczenie (biała linia) ich lokalizacji po każdym pomiarze. E. Alternatywnie, jeśli wymagana jest średnia odległość, czas i prędkość włókna stresowego, można narysować linię od punktu początkowego do końcowego (żółta linia) i pobrać dla niej dane (wyróżnione w oknie Results). W tym przykładzie pomiary dla tego włókna stresowego wykonano dla 37 klatek x 1 klatka/min. = 37 min. Odległość pokonana w tym okresie wyniosła 75 klatek x 0,16125 μm/pixel = 12,1 μm. Wynikowa prędkość boczna włókna stresowego wyniosła 12,1 μm/37min = +0,33 μm/min. Pozytywną wartość prędkości przypisano włóknom poruszającym się w stronę centrum komórki, a negatywną tym, które poruszają się w stronę peryferii.

Film 1. Obrazy time-lapse żywych komórek HUVEC wykazujących ekspresję GFP-actin. Odstęp między obrazami wynosi 1 min. Lokalne lamellipodia wysuwały się wzdłuż całego obwodu komórek. Dodatkowo, poprzeczne łukowate włókna stresowe przemieszczały się bocznie w stronę centrum komórek. Po dodaniu trombiny (1 U/ml) do kąpieli komórki lekko się skurczyły, a zewnętrzne wypustki lamellipodiów zatrzymały się na około 10 min. Po skurczeniu się komórek powróciły procesy tworzenia i wymiany lamellipodiów. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Film 2. Konfluencyjne komórki HUVEC wykazujące ekspresję GFP-aktyny przed i po traktowaniu trombiną. Upływ czasu jest pokazany w prawym dolnym rogu w formacie minuty:sekundy. Odstęp między obrazami wynosi 30 s. Trombinę (1 U/ml) dodano po 45 min okresie bazowym. Opisane zdarzenia obejmują lokalne tworzenie się i obrót lamellipodiów (grotowe strzałki przy krawędziach komórek, 0:59 - 37:29), chmury aktynowe (strzałki, 1:59 - 21:29) oraz szczelinę w złączu trójkomórkowym, która poszerza się po dodaniu trombiny (strzałka, 62:30 - 70:00). W kilku komórkach widoczne są również poprzeczne łukowate włókna stresowe. Komórki wykazywały aktywną formację i obrót lokalnych lamellipodiów wzdłuż swoich obwodów, z których wiele prowadziło do powstawania fałd błoniastych. Trombina spowodowała przerwanie procesu tworzenia się i obrotu lamellipodiów oraz krótkotrwałe pojawienie się niewielkich szczelin między komórkami. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dyskusja

Obrazowanie GFP-aktyny w żywych komórkach śródbłonka umożliwia szczegółową analizę dynamiki cytoszkieletu aktynowego w odpowiedzi na bodźce zapalne. Metoda ta może być również przydatna w rozwijaniu wcześniejszych odkryć wykazujących przebudowę cytoszkieletu w odpowiedzi na siły fizyczne, takie jak naprężenie ścinające¹¹. Ponadto metoda ta pozwala na szczególną ocenę wpływu dynamiki cytoszkieletu aktynowego na różne aktywności komórek śródbłonka, w tym migrację, mitozę, tworzenie i dojrzewanie połączeń międzykomórkowych oraz utrzymanie funkcji barierowej.

Na przedstawionych danych można zaobserwować zachowanie cytoszkieletu aktynowego komórek śródbłonka przed i po traktowaniu trombyną. Wzdłuż krawędzi komórek śródbłonka zaobserwowano formowanie i regresję lokalnych lamellipodiów w czasie, zarówno w niezrastających się, jak i w zrastających się monowarstwach komórkowych. Traktowanie trombyną przejściowo przerwało procesy formowania i wymiany lamellipodiów. Trombyna spowodowała również niewielki skurcz komórek, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, według których trombyna indukuje tworzenie stresowych włókien aktynowych oraz zwiększa rozwój napięcia dośrodkowego w komórkach śródbłonka^12-14. Dzięki badaniom obrazowym żywych komórek, takim jak niniejsze, można obecnie określić pochodzenie włókien stresowych. W komórkach HUVEC większość włókien stresowych bierze początek na obwodzie komórki i przypomina poprzeczne włókna łukowate w komórkach migrujących^{8, 9}. Inną zaletą tej metody w porównaniu z wykorzystaniem komórek utrwalonych jest możliwość ilościowego określenia liczby włókien stresowych w poszczególnych komórkach przed i po traktowaniu trombyną, co eliminuje błąd selekcji między grupami eksperymentalnymi.

W ramach niniejszego protokołu oceniamy dynamiczny ruch krawędzi komórki oraz włókien stresowych aktyny. Aby zrozumieć dynamikę monomerów aktyny w komórkach śródbłonka, można zastosować bardziej zaawansowane techniki, takie jak fluorescencyjne odzyskiwanie po fotowybielaniu (FRAP) lub mikroskopia plamkowa fluorescencyjna (FSM)^{15, 16}. Ponadto, ponieważ śródbłonek naczyń mikrokrwionośnych może stanowić lepszy model funkcji bariery mikronaczyniowej, logicznym kierunkiem przyszłych badań jest optymalizacja protokołów transfekcji w celu efektywnej ekspresji GFP-aktyny w komórkach śródbłonka naczyń mikrokrwionośnych.

Podsumowując, obrazowanie żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny stanowi potężne narzędzie do określenia, w jaki sposób cytoszkielet aktynowy komórek śródbłonka reaguje na różne rodzaje bodźców. Badania z wykorzystaniem ściśle konfluencyjnych monowarstw śródbłonka pomogą określić rolę dynamicznych struktur, takich jak bogate w aktynę lamellipodia i poprzeczne łukowate włókna stresu, w funkcji bariery śródbłonka. Ponadto obrazowanie żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny lub innych białek fuzyjnych umożliwiających wizualizację innych struktur wewnątrzkomórkowych dostarczy szczegółowych informacji czasowo-przestrzennych niezbędnych do zrozumienia mechanizmów sygnalizacyjnych i strukturalnych, które determinują integralność bariery.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1. Roztwór roboczy 5x Ringera
Chlorek sodu	EMD Millipore	SX0420-3	35 g
Chlorek potasu	JT Baker	3040	1,75 g
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C-3881	1,47 g
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	M-9397	1,44 g
Sterylna woda filtrowana	N/A	N/A	do objętości 1 L
Przefiltrować sterylnie do autoklawowanych butelek i przechowywać w 4°C
2. Bufor MOPS
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183	125,6 g
Sterylna woda filtrowana	N/A	N/A	do objętości 1 L
Przefiltrować sterylnie do autoklawowanych butelek i przechowywać w 4°C
3. Fizjologiczny roztwór soli z albuminą (APSS)
Roztwór roboczy Ringera (5x)	N/A	N/A	200 mL
Bufor MOPS	N/A	N/A	5 mL
Fosforan sodu	Sigma-Aldrich	S-9638	0,168 g
Pirowinian sodu	Sigma-Aldrich	P5280	0,22 g
Sól sodowa EDTA	Sigma-Aldrich	ED2SS	0,0074 g
Glukoza	Sigma-Aldrich	G7528	0,901 g
Albumina wołowa	USB Corp., Affymetrix	10856	10 g
Sterylna woda filtrowana	N/A	N/A	do objętości 1 L
Dostosować pH do 7,4 w 37°C, następnie przefiltrować sterylnie do autoklawowanych butelek i przechowywać w 4°C.
4. 0,9% roztwór soli fizjologicznej
Chlorek sodu	EMD Millipore	SX0420-3	9 g
Sterylna woda filtrowana	N/A	N/A	do objętości 1 L
Przefiltrować sterylnie do autoklawowanych butelek i przechowywać w 4°C
5. 1,5% roztwór żelatyny
Żelatyna ze skóry wieprzowej	Sigma-Aldrich	G2500	15 g
0,9% roztwór soli fizjologicznej	N/A	N/A	do objętości 1 L
Podgrzać roztwór do 37°C, aby całkowicie rozpuścić żelatynę. Gdy roztwór jest jeszcze ciepły, przefiltrować go sterylnie do autoklawowanych butelek i przechowywać w 4°C