Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Podsumowanie

Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-actin pozwala na charakterystykę dynamicznych zmian w strukturach cytoszkieletu. W przeciwieństwie do technik wykorzystujących utrwalone preparaty, metoda ta umożliwia szczegółową ocenę zmian czasowych w cytoszkielecie aktynowym w tych samych komórkach przed, w trakcie i po różnych bodźcach fizycznych, farmakologicznych lub zapalnych.

Streszczenie

Śródbłonek mikro naczyniowy pełni ważną rolę jako selektywnie przepuszczalna bariera dla płynów i substancji rozpuszczonych. Połączenia przylegające między komórkami śródbłonka regulują przepuszczalność śródbłonka, a wiele badań wskazało na istotny wkład cytoszkieletu aktynowego w utrzymanie integralności tych połączeń^1-5. Uważa się, że korowy pierścień aktynowy jest ważny dla utrzymania stabilnych połączeń^{1, 2, 4, 5}. Z kolei włókna stresowe aktyny mają generować napięcie dośrodkowe wewnątrz komórek śródbłonka, co osłabia połączenia^2-5. Wiele z tych teorii oparto na badaniach, w których komórki śródbłonka poddawano działaniu mediatorów stanu zapalnego znanych z tego, że zwiększają one przepuszczalność śródbłonka, a następnie utrwalano komórki i znakowano F-aktynę w celu obserwacji mikroskopowej. Badania te zapewniają jednak bardzo ograniczone zrozumienie roli cytoszkieletu aktynowego, ponieważ obrazy utrwalonych komórek stanowią jedynie przekroje czasowe, nie dostarczając informacji o dynamice struktur aktynowych⁵.

Obrazowanie żywych komórek pozwala na uwzględnienie dynamicznej natury cytoszkieletu aktynowego w badaniach nad mechanizmami determinującymi szczelność bariery śródbłonka. Główną zaletą tej metody jest możliwość oceny wpływu różnych bodźców zapalnych na struktury aktynowe w komórkach śródbłonka w tym samym zestawie żywych komórek przed i po zastosowaniu preparatu, co eliminuje potencjalne błędy systematyczne, które mogą wystąpić podczas obserwacji utrwalonych preparatów. Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) są transfektowane plazmidem GFP-β-actin i hodowane do uzyskania konfluencji na szkiełkach podstawkowych. Obrazy time-lapse GFP-aktyny w konfluencyjnych komórkach HUVEC są rejestrowane przed i po dodaniu mediatorów zapalnych, które wywołują zależne od czasu zmiany w szczelności bariery śródbłonka. Badania te umożliwiają wizualną obserwację sekwencji zmian w cytoszkieletu aktynowym, które przyczyniają się do przerwania i późniejszej odbudowy bariery śródbłonka.

Nasze wyniki konsekwentnie wykazują lokalne tworzenie się i obrót bogatych w aktynę lamellipodiów w komórkach śródbłonka. Można również zaobserwować tworzenie i ruch aktynowych włókien stresowych. Analizę częstotliwości powstawania i obrotu lokalnych lamellipodiów przed i po zastosowaniu stymulacji zapalnej można udokumentować za pomocą analizy kymografów. Badania te dostarczają istotnych informacji na temat dynamicznej natury cytoszkieletu aktynowego w komórkach śródbłonka, co może zostać wykorzystane do odkrycia nieznanych wcześniej mechanizmów molekularnych, ważnych dla zachowania integralności bariery śródbłonkowej.

Protokół

1. Transfekcja komórek HUVEC GFP-aktyną

1. Do transfekcji HUVEC można wykorzystać różne metody. Nasze laboratorium stosuje system Nucleofector (Lonza, Basel Switzerland) opisany poniżej. Zasadniczo należy pracować szybko, aby zwiększyć żywotność komórek i wydajność transfekcji. Każda transfekcja wymaga 5 x 10⁵ HUVEC, które zostaną wysiane na dwa szkiełka podstawowe (Corning No. 1, 22 x 50 mm). System Nucleofector łączy elektroporację i odczynniki chemiczne w celu transfekcji plazmidowego DNA, zazwyczaj osiągając wydajność ekspresji >50%. Alternatywną metodą są chemiczne odczynniki do transfekcji. Jedna z grup z sukcesem przeprowadziła transfekcję komórek śródbłonka bydlęcego GFP-aktyną przy użyciu odczynnika GenePORTER⁶. Protokół Nucleofector, którego używamy, opisano poniżej.
2. W zależności od typu komory można użyć wysterylizowanych naczyń hodowlanych lub zwykłych szkiełek podstawowych. Szkiełka szklane należy sterylizować w komorze z laminarnym przepływem powietrza, umieszczając je na 2 min w płytce hodowlanej 10 cm zawierającej około 5 ml 70% etanolu. Należy je wyjąć sterylną pęsetą i pozostawić do wyschnięcia, opierając o ściankę osobnej płytki hodowlanej.
3. Po wyschnięciu każde szkiełko należy umieścić w osobnej płytce hodowlanej 10 cm. Na środek szkiełka należy nanieść pipetą kroplę 300 μL ciepłego roztworu żelatyny (1,5% w 0,9% NaCl), pozostawić na 5 min, a następnie odessać nadmiar. Utrzymanie tej powłoki macierzy w centrum, bez dotykania krawędzi, zapewni gęste wysianie komórek i szybkie osiągnięcie konfluencji.
4. Na każdą transfekcję należy przygotować jedną probówkę mikrocentryfugową 1,5 mL z 500 μL medium EGM2MV (Lonza) i odstawić ją do inkubatora w temperaturze 37°C i 5% CO₂.
5. Komórki HUVEC należy odkleić za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA i zebrać do probówki stożkowej 15 mL. Należy policzyć komórki. Do każdej transfekcji potrzebnych jest 5 x 10⁵ komórek. Należy dostosować objętość zawiesiny komórkowej tak, aby uzyskać osad zawierający 5 x 10⁵ komórek pomnożone przez liczbę planowanych transfekcji.
6. Zawiesinę komórkową należy wirować w wirówce klinicznej z prędkością 5000 rpm przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Należy odessać nadsącz, przechylając probówkę, aby usunąć jak najwięcej medium.
7. Osad należy resuspender w Basic Nucleofector Solution z zestawu HUVEC lub Primary Endothelial Cell Nucleofector Kit (Lonza). Należy użyć 100 μL na 5 x 10⁵ komórek. Ze względu na toksyczność tego roztworu ważne jest, aby pracować szybko, gdy komórki znajdują się w tej zawiesinie.
8. Do próbki do transfekcji należy dodać plazmid wektora GFP-β-aktyny (0,2-2 μg na 100 μL zawiesiny Nucleofector). Dawka to 0,2-2 μg plazmidowego DNA GFP-aktyny na 5 x 10⁵ komórek na jedną transfekcję.
9. Należy przenieść 100 μL zawiesiny komórkowej do kuwety Nucleofector. Należy przykryć i kilkakrotnie stuknąć kuwetą, aby upewnić się, że zawiesina komórkowa dotarła do dna.
10. Kuwetę należy umieścić w slocie urządzenia Nucleofector II i uruchomić wybrany program elektroporacji. Dla HUVEC stosujemy program A-034.
11. Kuwetę należy przenieść z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Z inkubatora 37 °C należy wyjąć jedną z probówek mikrocentryfugowych zawierającą 500 μL EGM2MV. Używając jednej z pipet transferowych dołączonych do zestawu Nucleofector, należy ostrożnie dodać ciepłe 500 μL medium do zawiesiny komórkowej w kuwecie. Całą zawartość kuwety należy przenieść z powrotem do probówki mikrocentryfugowej i umieścić w inkubatorze na 15 min, aby umożliwić regenerację komórek.
12. W przypadku konieczności transfekcji większej liczby komórek należy powtórzyć kroki 9-11.
13. Jedną probówkę mikrocentryfugową zawierającą 600 μL zawiesiny transfekowanych HUVEC można wysiać na dwa szkiełka podstawowe. W komorze z laminarnym przepływem powietrza, za pomocą mikropipety 1000 μL, należy ostrożnie pipetować zawiesinę raz w górę i w dół w celu wymieszania, a następnie nanieść 300 μL zawiesiny bezpośrednio na szkiełko pokryte żelatyną. Należy dopilnować, aby zawiesina nie dotknęła krawędzi szkiełka. Próbki należy inkubować w 37 °C/5% CO₂ przez 1-4 h, aby umożliwić adhezję komórek.
14. Po 1-4 h należy sprawdzić transfekowane komórki, aby potwierdzić, że przylgnęły do szkiełka. Następnie należy dodać 10 mL medium EGM2MV i przenieść płytkę z powrotem do inkubatora 37°C/5%CO₂. Ekspresję GFP-aktyny można zazwyczaj zaobserwować w ciągu 4-8 godzin. Eksperymenty są zazwyczaj przeprowadzane w ciągu 24-48 h.

2. Przygotowanie komory do obrazowania żywych komórek oraz podgrzewacza stolika

1. W większości naszych badań wykorzystywaliśmy otwartą komorę diamentową Warner Instruments (RC22) umieszczoną w podgrzewaczu stolika PH-1, zasilaną przez system grawitacyjnego przepływu. Dostępnych jest jednak kilka opcji stolików do obrazowania żywych komórek, w tym komory mieszczące naczynia hodowlane z szklanym dnem, komory otwarte i zamknięte, a także różne kombinacje mikroinkubatorów/podgrzewaczy obiektywów oraz duże systemy inkubacyjne. Ostateczny wybór komory zależy od czynników takich jak potrzeba dostępu do kąpieli w celu dodania substancji testowej lub leku, to czy medium będzie statyczne czy w przepływie, oraz długość eksperymentu. Ponadto czynniki takie jak niestabilność temperatury mogą czasami powodować dryft ostrości, co można zminimalizować za pomocą systemów sterowania utrzymujących stabilną temperaturę kąpieli i obiektywu.
2. Odmierz odpowiednią ilość medium do eksperymentu. Odmierzamy 50 ml fizjologicznego roztworu soli z albuminą (APSS; Tabela 1) na każdą godzinę trwania eksperymentu.
3. Do dostarczania medium do komory można użyć pompy lub systemu grawitacyjnego przepływu. W naszym systemie dodajemy APSS do prostego układu grawitacyjnego zbudowanego z linii do infuzji dożylnej, połączonej z grzałką przepływową (Warner Instruments model SH-27A). Stosujemy przepływ na poziomie około 40 mL/h.
4. W przypadku użycia otwartej komory kąpieli, takiej jak nasza, nanieś smar próżniowy na zewnętrzną krawędź dolnej strony komory diamentowej za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem. Następnie wyjmij z inkubatora jedno szkiełko nakrywkowe z naniesionymi komórkami i delikatnie podnieś je pęsetą. Delikatnie dotknij odwrotnej strony szkiełka chusteczką Kimwipe, aby wchłonąć nadmiar medium, utrzymując stronę z komórkami w stanie wilgotnym. Kładąc komórki stroną górną, nałóż komorę diamentową na szkiełko nakrywkowe, aby utworzyć komorę.
5. Szybko umieść komorę w podgrzewaczu stolika i ręcznie dokręć zaciski nad komorą. Głównym problemem na tym etapie jest możliwość wyschnięcia komórek. Dlatego ważne jest, aby pracować szybko i po zakończeniu natychmiast nalać pipetą _˜1 mL medium do komory, aby zapobiec wysychaniu komórek.
6. Nasza komora umożliwia stały przepływ medium nad komórkami. Tuż przed włączeniem przepływu należy podłączyć wąż próżniowy do uchwytu w komorze, aby umożliwić odpływ nadmiaru medium hodowlanego (APSS). W tym momencie należy również włączyć grzałkę przepływową i podgrzewacz kąpieli (do 37 °C). Nasz system posiada również sondę termistora do monitorowania temperatury, którą należy umieścić na krawędzi kąpieli.
7. Ostrożnie przetrzyj dolną stronę szkiełka nakrywkowego chusteczką Kimwipe nasączoną 70% EtOH, aby usunąć pozostałości medium EGM2MV i osady solne. Przetrzyj ponownie suchą chusteczką Kimwipe lub papierem do soczewek.
8. Po przygotowaniu komory, uruchomieniu przepływu i ustabilizowaniu temperatury na poziomie 37 °C, odczekaj co najmniej 30 minut, aby komórki mogły się zaadaptować i ustabilizować przed rozpoczęciem eksperymentu.
9. W czasie oczekiwania włącz wszystkie komponenty mikroskopu do obrazowania żywych komórek (lampy, sterownik koła filtrów, kamerę, komputer).

3. Pozyskiwanie danych za pomocą mikroskopu do obrazowania żywych komórek

1. • Dostępnych jest wiele systemów mikroskopii żywych komórek. Nasz system to Nikon Eclipse TE-2000U z następującymi komponentami:
   • lampa ksenonowa Sutter Instruments Lambda LS 300 W
   • koło filtrów wzbudzenia Sutter Instruments Lambda 10-3 z funkcją SmartShutter i filtrem S492 (do zastosowań UV i RFP dostępne są również filtry wzbudzenia D350 i S572)
   • emitter dichroiczny 2002bs (Nikon 61002m)
   • obiektyw CI Plan Fluor 10X DLL, NA 0.30 (Nikon MRH10100)
   • obiektyw Plan Fluor ELWD 40X DM, NA 0.60 (Nikon MRH08420)
   • obiektyw olejowy Plan Apo VC 100X, NA 1.40 (Nikon MRD01901)
   • kamera Photometrics CoolSNAP HQ2, matryca obrazująca 1392 x 1040, piksele 6.45 x 6.45 μm
     (Roper Scientific)
   • Posiadamy również dwa pakiety oprogramowania do akwizycji obrazów: Nikon Elements-AR 3.0 oraz Metamorph 6.1.
2. Po obejrzeniu komórek i znalezieniu odpowiedniego obszaru do badania, zablokuj pokrętło grubego ustawienia ostrości i sprawdź ustawienia akwizycji w oprogramowaniu, aby:
   1. koło filtrów było ustawione na filtr S492 (oznaczony w naszej konfiguracji jako „FITC”)
   2. w oprogramowaniu do akwizycji obiektyw był ustawiony zgodnie z pożądanym powiększeniem (nasz mikroskop nie jest zmotoryzowany, ale to ustawienie definiuje stosunek μm/pixel). Upewnij się również, że soczewka optivar w mikroskopie jest ustawiona na powiększenie 1.0X. Ustawienie optivaru na 1.5X może zwiększyć powiększenie, jednak kosztem utraty intensywności sygnału.
      Stosowane powiększenie zależy od celów badania. Aby uzyskać najlepsze szczegóły, obiektyw 100X z wysoką aperturą numeryczną zapewni najlepszą rozdzielczość przestrzenną i transmisję sygnału. Nasz mikroskop jest również wyposażony w obiektyw 40X z długą odległością roboczą, przeznaczony do innych zastosowań wymagających dodatkowego dystansu. Obiektyw ten może być jednak przydatny, gdy chcemy obserwować kilka komórek jednocześnie i sprawdza się przy obrazowaniu struktur wielkości organelli, choć kosztem utraty rozdzielczości przestrzennej i intensywności sygnału. W przypadku każdego badania, w którym punktem końcowym jest intensywność sygnału, lub w przypadku bardziej zaawansowanych technik obrazowania, takich jak mikroskopia fluorescencyjnego obrazu ziarnistego (fluorescence speckle microscopy), zaleca się stosowanie obiektywu 100X.
   3. czas ekspozycji kamery był ustawiony w zakresie 0.5-2 s. Zależy to od intensywności GFP-aktyny w komórkach. Zazwyczaj stosujemy najkrótszy możliwy czas ekspozycji, aby uniknąć blaknięcia GFP-aktyny i potencjalnej toksyczności dla komórek.
   4. dla uzyskania najlepszej rozdzielczości binning był ustawiony na 1 x 1, a Gain na 1. W niektórych przypadkach ustawialiśmy binning na 2 x 2, aby skrócić czas ekspozycji, jednak zmniejsza to precyzję pomiarów, jakie możemy wykonać na ruchomych obiektach w badaniu time-lapse.
   5. skonfigurowano ustawienia time-lapse:
      1. wybrano folder do zapisu przechwyconych obrazów i wpisano nazwę pliku.
      2. ustawiono liczbę obrazów i odstępy czasowe dla eksperymentu. Zazwyczaj stosujemy odstęp od 15 s do 1 min między obrazami i czas trwania do 2 h.
      3. upewniono się, że aktywna migawka jest ustawiona w pozycji zamkniętej pomiędzy akwizycjami.
3. Przed rozpoczęciem akwizycji obrazów time-lapse wyłącz oświetlenie w pomieszczeniu i przechwyć pojedynczy obraz, aby sprawdzić ustawienia.
4. Przechwyć również obraz w polu jasnym. Upewnij się, że kondensor jest ustawiony na właściwy filtr fazowy lub DIC. Włącz lampę halogenową i wykonaj zdjęcie. Wyłącz lampę halogenową.
5. Przywróć ustawienia „FITC” dla obrazowania time-lapse i wykonaj obraz testowy.
6. Przechwyć serię time-lapse.
   Podczas eksperymentu ważne jest monitorowanie obrazów w miarę ich pozyskiwania. W niektórych przypadkach niewielkie zmiany temperatury w komorze mogą spowodować dryft ostrości. Można tego uniknąć poprzez optymalizację linii dopływu i próżni, tak aby przepływ nad komórkami był stabilny. Pomocne może być również ograniczenie ruchu w pomieszczeniu z mikroskopem oraz przekierowanie prądów powietrza z sufitowych nawiewów z dala od urządzenia. Alternatywą, która w naszym doświadczeniu sprawdziła się dobrze, jest zastosowanie komór inkubacyjnych 37 °C/5% CO₂, które obejmują cały stolik i obiektyw. Oferują one zaletę monitorowania komórek przez noc lub dłużej, ale dostęp do komórek jest ograniczony.
   W razie potrzeby wstrzymaj akwizycję time-lapse i ponownie ustaw ostrość obrazu. Wykonaj ponowne ustawianie ostrości tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć zmiany odstępu czasowego między obrazami.
7. Typowy protokół będzie składał się z 20-30 minut obrazowania bazowego przed dodaniem czynnika testowego, a następnie z 0.5 do 4 godzin dodatkowej akwizycji obrazów. Czas trwania eksperymentu może być ograniczony przez fotoblaknięcie GFP w czasie, dlatego ważne jest wybranie jak najkrótszego czasu ekspozycji. W przypadku chęci przeprowadzenia dłuższego badania można również zmienić odstęp między obrazami time-lapse na 30-60 s.

4. Analiza danych

1. Do analizy zestawów obrazów można wykorzystać kilka pakietów oprogramowania, takich jak NIS Elements, Metamorph, Slidebook itp. Zazwyczaj przeprowadzamy analizę obrazów przy użyciu programu NIH ImageJ, co umożliwia analizę na dowolnym komputerze w naszym laboratorium lub w domu. Wersje, których używamy, to:
   MBF ImageJ (http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ )
   FIJI (http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji).
2. Program ImageJ może być wykorzystywany do analizy wielu procesów dynamicznych, w tym:
   • Częstotliwość wysuwania lamellipodiów
   • Odległość, czas i prędkość wypustek
   • Ruch włókien aktynowych w czasie
   Oprogramowanie Nikon Elements zapisuje obrazy z serii time-lapse w formacie pliku „ND”. Aby otworzyć je w programie ImageJ, należy przekonwertować je na serię plików TIF, korzystając z funkcji „export ND document”. Stosy obrazów z programu Metamorph można otwierać w ImageJ bez wprowadzania zmian. Jedną z opcji, którą wybieramy podczas otwierania serii TIF w ImageJ, jest konwersja na 8-bitową skalę szarości. Ułatwia to przeglądanie obrazów, ponieważ korekty jasności i kontrastu będą stosowane do całej serii, a nie tylko do aktualnie wyświetlanego obrazu.
3. W programie ImageJ, po otwarciu zestawu obrazów, w lewym górnym rogu okna wyświetli się numer przekroju oraz całkowita liczba przekrojów, a także nazwa pliku, liczba pikseli, typ pliku i rozmiar. Pasek przewijania Z na dole odpowiada czasowi. Ponadto najechanie kursorem na obraz spowoduje wyświetlenie współrzędnych pikseli x, y i z na dolnym pasku narzędzi ImageJ.
4. Wypustki lamellipodialne można badać poprzez określanie liczby nowych wypustek w czasie. Analizę tę można przeprowadzić dla całego obwodu komórki lub dla wybranego regionu. Tego rodzaju analizę można wykonać również w niekonfluencyjnych, nietransfekowanych komórkach przy użyciu mikroskopii w kontraście fazowym lub DIC. Jednak zastosowanie komórek eksprymujących GFP-aktynę umożliwia analizę konfluencyjnych monowarstw, szczególnie w sytuacjach, gdy komórki zawierające i pozbawione GFP-aktyny znajdują się bezpośrednio obok siebie.
5. Odległość protruzji lamellipodiów, czas trwania (persystencja) oraz prędkość mogą zostać ocenione za pomocą analizy kymografu (skanowania liniowego). Należy narysować linię prostopadłą do krawędzi komórki (jest to najłatwiejsze, gdy w pobliżu nie ma innej komórki lub gdy sąsiednia komórka nie wykazuje ekspresji GFP-aktyny). W programie ImageJ naciśnięcie klawisza „/” wygeneruje kymograf, w którym oś x reprezentuje odległość, a oś y czas (od 15 s do 1 min na piksel, zgodnie z powyższymi wytycznymi dotyczącymi odstępów czasowych). Następnie można narysować linie nad wysuniętym lamellipodium i zmierzyć wymiary powstałego prostokąta (naciskając klawisz M w ImageJ). Na tej podstawie można obliczyć odległość, czas i prędkość.
6. Ruch włókien stresowych można również zmierzyć w podobny sposób za pomocą analizy kymograficznej.

5. Reprezentatywne wyniki:

Stosując nasz protokół transfekcji, zazwyczaj obserwujemy ekspresję GFP-actin w co najmniej 50% transfektowanych komórek HUVEC, a często udaje się znaleźć obszary na szkiełku podstawowym, gdzie >90% komórek HUVEC w danym regionie wykazuje ekspresję GFP-actin. Przykład eksperymentu z obrazowaniem żywych komórek w kulturze subkonfluentej HUVEC wykazujących ekspresję GFP-actin przedstawiono w Filmie 1. W tym konkretnym eksperymencie obraz był pozyskiwany raz na minutę. Jak widać na filmie, GFP-actin w komórkach HUVEC można zaobserwować w całej cytoplazmie, a także w strukturach filamentowatych oraz w lokalnych lamellipodiach wystających wzdłuż krawędzi komórek. Na filmie widoczne jest również, że ekspresja GFP-actin nie jest jednorodna pomiędzy komórkami. Komórki wybrane do badań zazwyczaj posiadają wystarczającą ilość GFP-actin, aby zwizualizować różne struktury zawierające aktynę filamentową. Komórki wykazujące bardzo wysokie poziomy GFP-actin mogą być problematyczne w badaniach, ponieważ w takich komórkach zazwyczaj trudno jest odróżnić struktury F-aktyny od obecnej w dużej ilości G-aktyny.

Film 2 przedstawia przykład zachowania konfluencyjnych komórek HUVEC wykazujących ekspresję GFP-aktyny. Podobnie jak w przypadku subkonfluencyjnych komórek HUVEC, widoczne było aktywne tworzenie i obrót lamellipodiów wzdłuż obwodów komórek. Jednakże lamellipodia te często prowadziły do powstawania fałdów błonowych (membrane ruffles), co wskazuje na mniej wydajną protruzję⁷. Jest to prawdopodobnie spowodowane obecnością sąsiednich komórek blokujących pobliskie podłoże. W Filmach 1 i 2 widoczne są również korowe włókna aktynowe oraz włókna stresowe. Chociaż obserwowane komórki pozostawały stacjonarne, włókna stresowe są podobne do włókien łukowatych poprzecznych w komórkach migrujących, które tworzą się w pobliżu brzegu komórki i przemieszczają się bocznie w stronę centrum komórki, gdzie ulegają rozkładowi^{8, 9}. Dodatkową dynamiczną cechą zaobserwowaną w tych komórkach było tworzenie struktur pierścienia aktynowego, które rozszerzały się koncentrycznie, nazwane wcześniej chmurami aktynowymi¹⁰.

Przykład kwantyfikacji dystansu, trwałości oraz prędkości wypustek komórkowych z tych zestawów obrazów time-lapse przy użyciu analizy kymograficznej przedstawiono na Rysunku 1. Na Rysunku 1A, w celu wygenerowania kymografu (Rysunek 1B), narysowano linię o szerokości jednego piksela, mniej więcej prostopadłą do krawędzi komórki. W tym kymografie obszar zdefiniowany przez linię został umieszczony pionowo, a obrazy z całego przebiegu time-lapse ułożono poziomo. Patrząc na kymograf od lewej do prawej, wypustki są reprezentowane jako ruchy w górę krawędzi komórki. Na Rysunku 1C na krawędzi jednej z tych wypustek nałożono linię, a powiązane z nią dane pikselowe zostały zebrane i wyświetlone w oknie Results na dole panelu. Analiza ta pozwala na kwantyfikację dynamiki wypustek i może być również wykorzystana do oszacowania częstotliwości ich powstawania (liczba wypustek/czas) w tym regionie komórki.

Przykład analizy ruchu włókien stresowych przedstawiono na Rysunku 2. Większość obserwowanych przez nas włókien stresowych formowała się w pobliżu peryferii komórki i przemieszczała się w stronę centrum komórki, gdzie ostatecznie ulegały rozkładowi. Można to również określić ilościowo za pomocą analizy kymograficznej. Linia jest rysowana prostopadle do krawędzi komórki oraz do włókien stresowych (Rysunek 2A), a następnie generowany jest kymograf (Rysunek 2B). Włókna stresowe pojawiają się na kymografie jako ciągłe linie w obszarze cytoplazmatycznym, często przesuwając się w dół i w prawo (w stronę centrum komórki). Czasami włókna są trudne do zauważenia na oryginalnym kymografie; w takich przypadkach stosujemy filtr maski wyostrzającej (unsharp mask), aby zwiększyć ostrość obrazu (Rysunek 2C). Na włóknach stresowych rysowane są linie, a dane pikselowe są zbierane przy użyciu funkcji pomiaru (measure) (Rysunek 2D). Alternatywnym sposobem zbierania tych danych jest narysowanie linii od początku do końca zidentyfikowanego włókna stresowego, aby uzyskać średnie nachylenie dla okresu obserwacji włókna (Rysunek 2E). Analiza ta umożliwia ilościowe określenie lateralnego ruchu włókien stresowych i może być również wykorzystana do policzenia liczby włókien stresowych zaobserwowanych w tym regionie komórki.

Rysunek 1. Analiza kymograficzna krawędzi komórki w celu wyznaczenia dystansu, trwałości i prędkości wysunięcia lokalnych lamellipodiów. A. Linia o szerokości jednego piksela zostaje narysowana mniej więcej prostopadle do krawędzi komórki. Obszar ten jest wyodrębniany z każdego obrazu z serii time-lapse w celu wygenerowania montażu tego obszaru w czasie. B. Na powstałym kymografie oś x reprezentuje czas (od lewej do prawej), a oś y odległość. Na tym kymografie można ocenić ruch krawędzi komórki w czasie; lamellipodia są identyfikowane jako obszary, w których krawędź komórki, przesuwając się w prawo, przemieszcza się w górę. C. Linia zostaje narysowana na krawędzi komórki w miejscu zidentyfikowanego wysunięcia lamellipodium. Następnie pobierane są wymiary prostokąta ograniczającego narysowaną linię (pokazane w nałożonym oknie). Szerokość jest wykorzystywana do obliczenia czasu lub trwałości wysunięcia. Wysokość służy do obliczenia dystansu wysunięcia. Prędkość wysunięcia oblicza się, dzieląc wysokość przez szerokość. W tym przykładzie odległość w górę wynosiła 96 pixels x 0.16125 μm/pixel = 15.5 μm, a czas 11 pixels x 1 min./pixel = 11 min. Prędkość obliczono jako 15.5 μm/11 min. = 1.4 μm/min.

Rysunek 2. Analiza kymograficzna ruchu aktynowych włókien stresowych. A. Linia o szerokości jednego piksela została narysowana prostopadle do krawędzi komórki w celu wygenerowania kymografu. B. Jak pokazano na Rys. 1, w otrzymanym kymografie oś x reprezentuje czas, a oś y odległość. Włókna stresowe są widoczne jako ciągłe linie w komórce, często biegnące w dół i w prawo (strzałki) C. Aby lepiej zwizualizować włókna stresowe, można zastosować filtr maski wyostrzającej (unsharp mask). W tym przykładzie zastosowano promień 3 pikseli i wagę maski 0,60. D. Następnie narysowano linie o szerokości jednego piksela na zidentyfikowanym włóknie stresowym i zebrano dane. Na tym panelu narysowano trzy linie, a następnie wybrano opcję „delete”, aby utworzyć trwałą adnotację (biała linia) ich położenia po każdym pomiarze. E. Alternatywnie, jeśli wymagane są średnia odległość, czas i prędkość włókna stresowego, można narysować linię od punktu początkowego do końcowego (żółta linia) i pobrać odpowiadające temu dane (podświetlone w oknie wyników – Results). W tym przykładzie pomiary dla tego włókna stresowego wykonano dla 37 klatek x 1 klatka/min. = 37 min. Odległość przebyta w tym czasie wyniosła 75 klatek x 0,16125 μm/pixel = 12,1 μm. Wynikowa prędkość boczna włókna stresowego wyniosła 12,1 μm/37min = +0,33 μm/min. Dodatnią wartość prędkości przypisano włóknom poruszającym się w stronę centrum komórki, a ujemną tym poruszającym się w stronę peryferii.

Film 1. Obrazy time-lapse żywych komórek HUVEC wykazujących ekspresję GFP-aktyny. Interwał między obrazami wynosi 1 min. Lokalne lamellipodia wysuwały się wzdłuż całego obwodu komórek. Dodatkowo, poprzeczne łukowate włókna stresowe przemieszczały się bocznie w stronę centrum komórek. Po dodaniu trombiny (1 U/ml) do kąpieli, komórki lekko się skurczyły, a zewnętrzne wypustki lamellipodiów zatrzymały się na około 10 min. Po skurczeniu się komórek, formowanie i wymiana lamellipodiów zostały wznowione. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Film 2. Konfluentne komórki HUVEC wykazujące ekspresję GFP-aktyny przed i po traktowaniu trombiną. Upływ czasu jest wyświetlany w prawym dolnym rogu w formacie minuty:sekundy. Odstęp między obrazami wynosi 30 s. Trombinę (1 U/ml) dodano po 45 min okresu bazowego. Opisane zdarzenia obejmują lokalne tworzenie się i obrót lamellipodiów (groty strzałek przy krawędziach komórek, 0:59 - 37:29), chmury aktynowe (strzałki, 1:59 - 21:29) oraz szczelinę w połączeniu trójkomórkowym, która rozszerza się po dodaniu trombiny (strzałka, 62:30 - 70:00). W kilku komórkach widoczne są również poprzeczne łukowate włókna stresowe. Komórki wykazywały aktywną formację i obrót lokalnych lamellipodiów wzdłuż swoich obrysów, z czego wiele prowadziło do powstawania fałdów błoniastych. Trombina spowodowała zatrzymanie tworzenia się i obrotu lamellipodiów oraz krótkotrwałe pojawienie się niewielkich szczelin między komórkami. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dyskusja

Obrazowanie GFP-aktyny w żywych komórkach śródbłonka umożliwia szczegółową analizę dynamiki cytoszkieletu aktynowego w odpowiedzi na bodźce zapalne. Metoda ta może być również przydatna w rozwijaniu wcześniejszych odkryć wykazujących przebudowę cytoszkieletu w odpowiedzi na siły fizyczne, takie jak naprężenie ścinające¹¹. Ponadto metoda ta pozwala na szczególną ocenę wpływu dynamiki cytoszkieletu aktynowego na różne aktywności komórek śródbłonka, w tym migrację, mitozę, tworzenie i dojrzewanie połączeń międzykomórkowych oraz utrzymanie funkcji barierowej.

Na przedstawionych danych można zaobserwować zachowanie cytoszkieletu aktynowego komórek śródbłonka przed i po traktowaniu trombyną. Wzdłuż krawędzi komórek śródbłonka zaobserwowano formowanie i regresję lokalnych lamellipodiów w czasie, zarówno w niezrastających się, jak i w zrastających się monowarstwach komórkowych. Traktowanie trombyną przejściowo przerwało procesy formowania i wymiany lamellipodiów. Trombyna spowodowała również niewielki skurcz komórek, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, według których trombyna indukuje tworzenie stresowych włókien aktynowych oraz zwiększa rozwój napięcia dośrodkowego w komórkach śródbłonka^12-14. Dzięki badaniom obrazowym żywych komórek, takim jak niniejsze, można obecnie określić pochodzenie włókien stresowych. W komórkach HUVEC większość włókien stresowych bierze początek na obwodzie komórki i przypomina poprzeczne włókna łukowate w komórkach migrujących^{8, 9}. Inną zaletą tej metody w porównaniu z wykorzystaniem komórek utrwalonych jest możliwość ilościowego określenia liczby włókien stresowych w poszczególnych komórkach przed i po traktowaniu trombyną, co eliminuje błąd selekcji między grupami eksperymentalnymi.

W ramach niniejszego protokołu oceniamy dynamiczny ruch krawędzi komórki oraz włókien stresowych aktyny. Aby zrozumieć dynamikę monomerów aktyny w komórkach śródbłonka, można zastosować bardziej zaawansowane techniki, takie jak fluorescencyjne odzyskiwanie po fotowybielaniu (FRAP) lub mikroskopia plamkowa fluorescencyjna (FSM)^{15, 16}. Ponadto, ponieważ śródbłonek naczyń mikrokrwionośnych może stanowić lepszy model funkcji bariery mikronaczyniowej, logicznym kierunkiem przyszłych badań jest optymalizacja protokołów transfekcji w celu efektywnej ekspresji GFP-aktyny w komórkach śródbłonka naczyń mikrokrwionośnych.

Podsumowując, obrazowanie żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny stanowi potężne narzędzie do określenia, w jaki sposób cytoszkielet aktynowy komórek śródbłonka reaguje na różne rodzaje bodźców. Badania z wykorzystaniem ściśle konfluencyjnych monowarstw śródbłonka pomogą określić rolę dynamicznych struktur, takich jak bogate w aktynę lamellipodia i poprzeczne łukowate włókna stresu, w funkcji bariery śródbłonka. Ponadto obrazowanie żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny lub innych białek fuzyjnych umożliwiających wizualizację innych struktur wewnątrzkomórkowych dostarczy szczegółowych informacji czasowo-przestrzennych niezbędnych do zrozumienia mechanizmów sygnalizacyjnych i strukturalnych, które determinują integralność bariery.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1. Roztwór roboczy 5x Ringera
Chlorek sodu	EMD Millipore	SX0420-3	35 g
Chlorek potasu	JT Baker	3040	1,75 g
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C-3881	1,47 g
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	M-9397	1,44 g
Sterylna woda filtrowana	N/A	N/A	do objętości 1 L
Przefiltrować sterylnie do autoklawowanych butelek i przechowywać w 4°C
2. Bufor MOPS
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183	125,6 g
Sterylna woda filtrowana	N/A	N/A	do objętości 1 L
Przefiltrować sterylnie do autoklawowanych butelek i przechowywać w 4°C
3. Fizjologiczny roztwór soli z albuminą (APSS)
Roztwór roboczy Ringera (5x)	N/A	N/A	200 mL
Bufor MOPS	N/A	N/A	5 mL
Fosforan sodu	Sigma-Aldrich	S-9638	0,168 g
Pirowinian sodu	Sigma-Aldrich	P5280	0,22 g
Sól sodowa EDTA	Sigma-Aldrich	ED2SS	0,0074 g
Glukoza	Sigma-Aldrich	G7528	0,901 g
Albumina wołowa	USB Corp., Affymetrix	10856	10 g
Sterylna woda filtrowana	N/A	N/A	do objętości 1 L
Dostosować pH do 7,4 w 37°C, następnie przefiltrować sterylnie do autoklawowanych butelek i przechowywać w 4°C.
4. 0,9% roztwór soli fizjologicznej
Chlorek sodu	EMD Millipore	SX0420-3	9 g
Sterylna woda filtrowana	N/A	N/A	do objętości 1 L
Przefiltrować sterylnie do autoklawowanych butelek i przechowywać w 4°C
5. 1,5% roztwór żelatyny
Żelatyna ze skóry wieprzowej	Sigma-Aldrich	G2500	15 g
0,9% roztwór soli fizjologicznej	N/A	N/A	do objętości 1 L
Podgrzać roztwór do 37°C, aby całkowicie rozpuścić żelatynę. Gdy roztwór jest jeszcze ciepły, przefiltrować go sterylnie do autoklawowanych butelek i przechowywać w 4°C