Artykuł metodologiczny

Zaciski hiperinsulinemiczno-euglikemiczne u świadomych, nieunieruchomionych myszy

98K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3188

⸱

16 listopada 2011

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Diabetes and Obesity Research Center, Sanford-Burnham Medical Research Institute at Lake Nona, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Department of Pediatrics and Cellular and Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny, lub clamp insulinowy, jest złotym standardem w ocenie działania insuliny in vivo. Opisano metodę przeprowadzania clampów insulinowych u myszy. Obejmuje ona metodę cewnikowania tętniczego, która pozwala na wykonywanie eksperymentów na świadomych, nieskrępowanych myszach przy minimalnym stresie.

Streszczenie

Cukrzyca typu 2 charakteryzuje się zaburzeniem działania insuliny. Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny, czyli clamp insulinowy, jest powszechnie uważany za „złoty standard” metody oceny działania insuliny in vivo. Podczas clampu insulinowego hiperinsulinemię osiąga się poprzez stały wlew insuliny. Euglikemię utrzymuje się za pomocą jednoczesnego wlewu glukozy ze zmienną prędkością. Ta zmienna prędkość wlewu glukozy (GIR) jest określana poprzez pomiar glukozy we krwi w krótkich odstępach czasu w trakcie całego eksperymentu i odpowiednią regulację GIR. GIR jest wskaźnikiem ogólnoustrojowego działania insuliny, ponieważ myszy z nasilonym działaniem insuliny wymagają wyższego GIR. Clamp insulinowy może obejmować podawanie izotopowego 2[14C]deoksyglukozy w celu oceny specyficznego dla tkanek wychwytu glukozy oraz [3-3H]glukozy w celu oceny zdolności insuliny do tłumienia szybkości pojawiania się endogennej glukozy (endoRa), będącej markerem wątrobowej produkcji glukozy, oraz do stymulowania szybkości ogólnoustrojowego zanikania glukozy (Rd).

Miniaturyzacja zacisku insulinowego (insulin clamp) do zastosowania w genetycznych modelach mysich chorób metabolicznych doprowadziła do znaczących postępów w badaniach nad cukrzycą. Metody przeprowadzania zacisków insulinowych różnią się w zależności od laboratorium. Należy zauważyć, że sposób wykonania zacisku insulinowego może istotnie wpływać na uzyskane wyniki. Opublikowaliśmy kompleksową ocenę różnych podejść do przeprowadzania zacisków insulinowych u przytomnych myszy1, a także ocenę odpowiedzi metabolicznej czterech powszechnie stosowanych inbredalnych szczepów myszy z wykorzystaniem różnych technik zacisku2. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół przeprowadzania zacisków insulinowych u przytomnych, nieunieruchomionych myszy, opracowany przez Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu/mmpc). Obejmuje on opis metody implantacji cewników wykorzystywanych podczas zacisku insulinowego. Protokół stosowany przez Vanderbilt MMPC wykorzystuje unikalny system dwucewnikowy3. Jeden cewnik jest wprowadzany do żyły szyjnej w celu przeprowadzania infuzji. Drugi cewnik jest wprowadzany do tętnicy szyjnej, co umożliwia pobieranie krwi bez konieczności unieruchamiania lub manipulowania myszą. Technika ta stanowi znaczącą przewagę nad najczęstszą metodą pobierania próbek krwi podczas zacisków insulinowych, polegającą na pobieraniu krwi z odciętego końca ogona. W przeciwieństwie do tej drugiej metody, pobieranie krwi z cewnika tętniczego nie wywołuje stresu u myszy1. Opisujemy również metody wykorzystania infuzji znaczników izotopowych do oceny tkankowo specyficznego działania insuliny. Dostarczamy także wytyczne dotyczące właściwej prezentacji wyników uzyskanych z zacisków insulinowych.

Protokół

1. Przygotowanie cewników oraz anteny dla myszy do dostępu do pobierania próbek (MASAtm)

  1. Przygotować cewnik tętniczy, wkładając 1,3 cm fragment PE-10 (średnica wewnętrzna 0,01 cala) do 6 cm fragmentu rurki silastykowej (średnica wewnętrzna 0,012 cala), zgodnie z Rysunkiem 1A. Ścięcie końcówkę PE-10 skalpelem tak, aby długość od końca silastyku do czubka ścięcia wynosiła 0,9 cm.
  2. Przygotować cewnik żylny, przesuwając 1 mm fragment rurki silastykowej (średnica wewnętrzna 0,020 cala) na odległość 1,1 cm od ściętego końca 6 cm fragmentu rurki silastykowej (średnica wewnętrzna 0,012 cala), zgodnie z Rysunkiem 1B. 1 mm fragment silastyku służy jako ogranicznik.
  3. W celu przygotowania MASAtm, włożyć dwa 1,3 cm fragmenty stalowych łączników ze stali nierdzewnej o rozmiarze 25G do dwóch 3 cm fragmentów PE-20 (średnica wewnętrzna 0,015 cala).
  4. Zabezpieczyć połączenie PE-20/łączniki, nasuwając 5 mm fragment rurki silastykowej (średnica wewnętrzna 0,040 cala) na obszar styku stalowych rurek i PE-20.
  5. Zgiąć stalowe rurki pod kątem ˜120° i rozsunąć każdą rurkę o ˜ 45°.
  6. Umieścić gotowy zestaw w ilości medycznego kleju silikonowego w taki sposób, aby rurka PE-20 była pionowo, a końce stalowych rurek wystawały poza klej (Rysunek 1C). Pozostawić do utwardzenia na 24 h.

2. Cewnikowanie chirurgiczne

  1. Przed operacją wysterylizować cewniki 70% ethanollem, wypełnić je solą fizjologiczną z heparyną (20 U heparyny/ml soli) i włożyć stalowe zatyczki.
  2. Zznieczone mysz, najlepiej stosując metodę zapewniającą ciągłe podawanie środka znieczulającego (np. izofluran drogą wziewną).
  3. Stosując technikę sterylną, usunąć sierść z miejsc nacięć za pomocą trymowania i/lub kremu depilacyjnego, a następnie zdezynfekować skórę alkoholem i przemyć betadyną. W celu wprowadzenia cewnika usunąć sierść z obszaru rozciągającego się od dolnej szczęki do górnej krawędzi klatki piersiowej oraz między obojczykami. Aby wyprowadzić cewniki za głowę, usunąć sierść w obszarze między podstawą czaszki a regionem międzyłopatkowym i zdezynfekować skórę alkoholem oraz przemyć betadyną.
  4. Położyć mysz na plecach na podgrzewanej powierzchni pod polem widzenia mikroskopu chirurgicznego. Unieruchomić ogon i kończyny za pomocą taśmy chirurgicznej. Unieruchomić głowę w stożku nosowym podającym znieczulenie.
  5. Wyonać niewielkie pionowe nacięcie w linii środkowej 5 mm cephalad od mostka. Używając pęsety, przeprowadzić tępą dyssekcję tkanek, aby odsłonić lewy mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy. Odsunąć ten mięsień, aby odsłonić lewą tętnicę szyjną. Delikatnie oddzielić tkankę łączną od tętnicy. Na tym etapie ważne jest wyizolowanie nerwu błędnego od tętnicy, aby nie uszkodzić ani tętnicy, ani nerwu.
  6. Wyizolować tętnicę i podwiązać jej koniec cephalny jedwabnym szwem. Luźno zawiązać kolejny fragment szwu na końcu caudalnym odsłoniętego naczynia.
  7. Zacisnąć naczynie mikro-zaciskiem serrefine na końcu caudalnym i przeciąć tuż poniżej podwiązanego końca nożyczkami sprężynowymi. Ostrożnie wprowadzić cewnik aż do zacisku. Ostrożnie zwolnić mikro-zacisk serrefine i przesunąć cewnik do połączenia silastic-PE.
  8. Mocno zawiązać oba podwiązania do cewnika i potwierdzić drożność cewnika, podłączając jego wolny koniec do strzykawki do pobierania próbek.
  9. Wykonać kolejne nacięcie 5 mm na prawo od linii środkowej i około 2 mm caudalnie od pierwszego nacięcia. Używając pęsety, przeprowadzić tępą dyssekcję tkanek, aby odsłonić i wyizolować prawą żyłę szyjną.
  10. Ostrożnie podwiązać koniec cephalny jedwabnym szwem i luźno zawiązać kolejny fragment szwu na końcu caudalnym.
  11. Przeciąć tuż poniżej podwiązania cephalnego nożyczkami sprężynowymi i wprowadzić cewnik aż do koralika ograniczającego. Zawiązać szew za koralikiem i potwierdzić drożność cewnika.
  12. Odwrócić mysz i wykonać niewielkie nacięcie między łopatkami.
  13. Przewieźć igłę o rozmiarze 14G pod skórą od nacięcia dla cewnika tętniczego (na przodzie myszy) do nacięcia międzyłopatkowego na grzbiecie. Przeciągnąć cewnik tętniczy przez igłę, aby wyprowadzić go na grzbiecie myszy. Powtórzyć tę procedurę dla cewnika żyły szyjnej, prowadząc igłę 14G pod skórą po prawej stronie myszy od miejsca nacięcia z przodu do nacięcia międzyłopatkowego na grzbiecie.
  14. Zacisnąć cewnik tętniczy mikro-zaciskiem serrefine w miejscu nacięcia między łopatkami. Przeciąć cewnik ok. 1 cm powyżej tego zacisku. Umieścić MASAtm tak, aby stalowe konektory były skierowane w stronę głowy myszy. Połączyć cewnik tętniczy ze stalowym konektorem skierowanym w lewą stronę myszy. Należy upewnić się, że cewnik nie ma dziur ani zagięć. Powtórzyć czynność dla cewnika żylnego, łącząc go ze stalowym konektorem skierowanym w prawą stronę myszy.
  15. Wprowadzić MASAtm do nacięcia między łopatkami. Przewód PE-20 odpowiadający cewnikowi żyły szyjnej powinien znajdować się po prawej stronie myszy, a przewód PE-20 odpowiadający cewnikowi tętniczemu po lewej.
  16. Zamknąć nacięcia brzuszne i grzbietowe szwem nylonowym. W przypadku zamknięcia grzbietowego szew można przeprowadzić przez utwardzony silikon MASAtm, aby unieruchomić urządzenie. Potwierdzić drożność cewników, używając roztworu płuczącego zawierającego sól fizjologiczną z heparyną i antybiotyk w celu zminimalizowania ryzyka infekcji. Umieścić mysz w ogrzewanej, czystej klatce do natychmiastowej rekonwalescencji. Rysunek 2 przedstawia gotowy efekt.
  17. Pozostawić mysz na rekonwalescencję przez co najmniej 5 dni. Monitorować masę ciała i stan ogólny zdrowia. Stosować odpowiedni schemat analgezji pooperacyjnej zatwierdzony przez instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Animal Care and Use Committee).

3. Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny

  1. Poddać mysz postowi przez 5-6h. Jako punkt odniesienia czas t = 0 min określa koniec postu oraz początek wlewu insuliny i glukozy (tj. okres zaciskania/clampu).
  2. Układ i harmonogram typowego eksperymentu przedstawiono na Rysunku 3. Do linii wlewu i pobierania próbek należy użyć drenów Micro-Renathane lub równoważnych. Nad myszą zawiesić dwukanałowy obrotowy łącznik (swivel), który pełni rolę centrum komunikacyjnego między myszą a strzykawkami do wlewów/pobierania próbek. Podczas eksperymentu mysz pozostaje w klatce domowej lub podobnym pojemniku i jest przymocowana do łącznika.
  3. Przed podłączeniem myszy wypełnić linię pobierania krwi tętniczej solą fizjologiczną z heparyną (10 U heparyny/ml soli fizjologicznej) i umieścić konnektor ze stali nierdzewnej na dolnym końcu linii. Pozostawić strzykawkę z solą fizjologiczną z heparyną (strzykawka płucząca) podłączoną do górnej części linii pobierania. Będzie ona służyć do pobierania próbek krwi.
  4. Wypełnić linię wlewu żylnego solą fizjologiczną bez heparyny, zaczynając od portu wlewowego łącznika (Segment A na Rysunku 3A) aż do dolnego końca linii. Zamknąć górny koniec linii i umieścić konnektor ze stali nierdzewnej (lub konnektor w kształcie Y, jeśli planowane jest podanie dawki bolusa) na dolnym końcu linii. W przypadku podawania izotopowego znacznika glukozy (np. [3-3H]glukozy), przymocować strzykawkę 1 ml z znacznikiem do strzykawki wlewowej. Wypełnić linię wlewu żylnego znacznikiem zamiast soli fizjologicznej (Rysunek 3B).
  5. W trzeciej godzinie postu zważyć mysz i podłączyć dren PE-20 z cewnika żyły szyjnej oraz cewników tętniczych odpowiednio do linii wlewu i linii pobierania próbek.
  6. W przypadku podawania znacznika [3-3H]glukozy, rozpocząć wlew znacznika z dawką nasycającą w czasie t = -90 min (Rysunek 3C). Typowa dawka nasycająca wynosi 1 μCi. Przygotować roztwór [3-3H]glukozy o stężeniu 0,05 μCi/μl w soli fizjologicznej bez heparyny. Napełnić strzykawkę 1 ml roztworem i umieścić ją w pompie infuzyjnej. Podać dawkę nasycającą, wlewając 20 μl/min przez 1 min. Następnie kontynuować wlew ciągły z prędkością 0,05 μCi/min (1 μl/min) przez 90-minutowy okres równoważenia.
  7. Przygotować wlewy z insuliny i glukozy. Insulinę przygotowuje się w soli fizjologicznej bez heparyny z dodatkiem 3% osocza jako nośnika (można również zastosować odpowiednie stężenie BSA). Wlewy z glukozy są dostępne komercyjnie w różnych stężeniach (5, 20 i 50%).
  8. Przygotować wlew z erytrocytów płukanych solą fizjologiczną, pobierając krew pełną od myszy dawcy, najlepiej z tej samej linii szczepu co mysz eksperymentalna. Zazwyczaj potrzeba 1 ml krwi pełnej na jedną mysz badawczą. Odwirować krew w celu oddzielenia erytrocytów. Płukać erytrocyty solą fizjologiczną z heparyną (10 U/ml) i odwirować, aby usunąć sól fizjologiczną. Określić objętość erytrocytów i resuspendować je w równej objętości soli fizjologicznej z heparyną (10 U/ml).
  9. Nabrać każdy wlew do strzykawki 1 ml i przymocować każdą strzykawkę do osobnej pompy infuzyjnej. Podłączyć każdą strzykawkę do konnektora 4-drożnego (Rysunek 3).
  10. W czasie t = -15 min pobrać próbkę krwi, powoli zasysając 50-10 μl krwi do strzykawki płuczącej. Zamknąć linię pobierania krwi tętniczej i wyjąć strzykawkę płuczącą. Za pomocą glukometru ręcznego zmierzyć poziom glukozy we krwi, zdejmując zacisk z linii pobierania i pozwalając krwi napłynąć na pasek glukometru.
  11. Po wykonaniu pomiaru glukozy zamknąć linię pobierania krwi tętniczej i wprowadzić strzykawkę z tępą igłą (strzykawka pobierająca) do linii pobierania. Zdjąć zacisk i pobrać objętość krwi (patrz Uwaga) do strzykawki pobierającej. Zamknąć linię pobierania krwi tętniczej i wyjąć strzykawkę pobierającą. Ponownie wprowadzić strzykawkę płuczącą do linii pobierania. Pociągnąć tłok w celu usunięcia pęcherzyków powietrza i ponownie wprowadzić 50-10 μl krwi, która została pierwotnie pobrana.

Uwaga: Objętość pobranej krwi zależy od wykonywanej analizy. Na przykład analiza stężenia [3-3H]glukozy wymaga 10 μl osocza, dlatego pobiera się 50 μl krwi. Pozwala to uzyskać 20-30 μl osocza, co jest wystarczające do analizy, z zapasem dodatkowego osocza w razie potrzeby. Pomiary hormonów i innych metabolitów (np. insuliny, wolnych kwasów tłuszczowych) wymagają pobrania dodatkowej ilości krwi.

  1. Przenieś krew z strzykawki do pobierania do mikroprobówki powlekanej EDTA. Odwiruj i pobierz osocze. Przechowuj osocze na lodzie do zakończenia badania lub natychmiast zamroź w temperaturze -20°C.
  2. Powtórz kroki od 3.10 do 3.12 w czasie t = -5 min. Pobierz dodatkową próbkę krwi (50 μl) do pomiaru bazowego poziomu insuliny w osoczu. Zmierz bazowy hematokryt, pobierając krew do kapilary traktowanej heparyną lub EDTA. Pomiary uzyskane z próbek osocza w t = -15 i -5 min reprezentują wartości bazowe (tj. na czczo).
  3. Po pobraniu próbki w t = -5 min, napełnij linie infuzyjne dla glukozy, insuliny i erytrocytów przemytych solą fizjologiczną aż do konektora 4-drożnego. Podłącz konektor 4-drożny do drenu przymocowanego do obrotowego portu infuzyjnego (lub do drenu podłączonego do konektora Y w przypadku infuzji [3-3H]glukozy), jak pokazano na Rysunku 3.
  4. Rozpocznij najpierw infuzję erytrocytów przemytych solą fizjologiczną. Ustaw szybkość infuzji tak, aby zastąpić całkowitą objętość krwi pobieranej w trakcie badania (np. jeśli w ciągu 120 min badania pobrano łącznie 500 μl krwi, ustaw szybkość infuzji na 4,2 μl/min). W przeciwieństwie do pozostałych infuzatów, roztwór erytrocytów ma kolor czerwony. Infuzja tego roztworu jako pierwszego pozwala na zidentyfikowanie i usunięcie ewentualnych oporów lub zatorów w liniach infuzyjnych.
  5. Gdy infuzat erytrocytarny dotrze do myszy, rozpocznij infuzje insuliny i glukozy. Jest to moment t = 0 min. Insulinę podaje się ze stałą, wcześniej określoną szybkością. Szybkość infuzji insuliny na poziomie 4 mU•kg-1•min-1 zazwyczaj hamuje endogenną produkcję glukozy o 80-10% i stymuluje znikanie glukozy 2-3 krotnie. Początkowa szybkość infuzji glukozy (GIR) jest szacowana na podstawie bazowego poziomu glukozy we krwi oraz wcześniejszego doświadczenia.
  6. W przypadku infuzji [3-3H]glukozy można zdecydować o zwiększeniu szybkości infuzji znacznika, aby dopasować ją do szacowanego wzrostu obrotu glukozy (zazwyczaj wzrost 2-3 krotnie).
  7. Biorąc pod uwagę wysoką szybkość obrotu glukozy u myszy, próbki krwi do pomiaru stężenia glukozy w trakcie eksperymentu należy pobierać z linii tętniczej nie rzadziej niż co 10 min. Dostosuj GIR, aby osiągnąć i utrzymać docelową euglikemię (Rysunek 3C). Cel ten może się różnić w zależności od modelu lub celów badania. Dobrym docelowym stężeniem glukozy jest 150 mg•dL-1, ponieważ jest to typowy poziom glukozy po 6h głodzenia u myszy C57Bl/6J karmionej standardową paszą.
  8. Celem jest szybkie osiągnięcie euglikemii, idealnie w ciągu pierwszych 40-50 min, oraz stabilizacja poziomu glukozy i GIR do początku okresu stanu stacjonarnego (t = 80 min).
  9. W przypadku infuzji [3-3H]glukozy pobierz dodatkowe próbki krwi w t = 80, 90, 10, 10 i 120 min w celu pomiaru aktywności swoistej [3-3H]glukozy w osoczu.
  10. Pobierz dodatkowe próbki krwi w t = 10 i 120 min do pomiaru poziomu insuliny w osoczu oraz wszelkich innych hormonów lub metabolitów. W t = 10 min pobierz krew do kapilary traktowanej heparyną lub EDTA w celu pomiaru hematokrytu podczas zacisku (clamp hematocrit).
  11. Po pobraniu próbki w t = 120 min można podać 2[14C]deoksyglukozę w celu pomiaru tkankowego poboru glukozy. Podaj dawkę bolusa 12 μCi do linii bolusa połączonej z linią pobierania z żyły szyjnej (Rysunek 3B).
  12. Pobierz próbki krwi (50 μl) z tętniczej linii pobierania w t = 2, 15, 25 i 35 min po podaniu bolusa w celu pomiaru poziomu 2[14C]deoksyglukozy w osoczu.
  13. Po ostatniej próbce znieczul mysz poprzez infuzję pentobarbitalu podaną bezpośrednio do linii tętniczej. Szybko wypreparuj tkanki wymagane do oceny poboru glukozy (np. mięśnie szkieletowe różnych typów, tkanka tłuszczowa, serce, mózg) oraz wszelkie inne tkanki (np. wątroba, śledziona, nerki). Zamroź tkanki błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowuj w -80°C do czasu analizy. Glukozę tkankową analizuje się poprzez pomiar akumulacji fosforylowanej 2[14C]deoksyglukozy w zamrożonych tkankach oraz znikania 2[14C]deoksyglukozy z osocza.

4. Reprezentatywne wyniki

Przykład wyników uzyskanych w eksperymencie z zaciskaniem insulinowym (insulin clamp) przedstawiono na Rysunku 4. Przykład ten ukazuje zdolność diety wysokotłuszczowej do wywołania insulinooporności u myszy. Wszystkie prezentacje wyników zaciskania insulinowego muszą zawierać następujące elementy, aby były interpretowalne: przebieg czasowy poziomów glukozy we krwi, przebieg czasowy GIR oraz poziomy insuliny w osoczu (bazowe i podczas zaciskania). Jak pokazano tutaj, poziomy glukozy na czczo (Rysunek 4A) oraz insuliny (Rysunek 4C>) są wyższe u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową, co wskazuje na insulinooporność. Przedstawienie przebiegu czasowego poziomów glukozy w trakcie całego badania zaciskania (Rysunek 4A) pozwala czytelnikowi ocenić, jak dobrze utrzymano euglikemię, co świadczy o jakości przeprowadzonego zaciskania. Podobnie przebieg czasowy GIR (Rysunek 4B) pozwala określić, jak szybko osiągnięto stan stacjonarny. Prezentowanie tych danych jako przebiegów czasowych jest znacznie bardziej informacyjne niż konwencjonalna praktyka w literaturze dotyczącej zaciskania insulinowego u myszy, polegająca na przedstawieniu 2-godzinnego eksperymentu jako pojedynczego punktu danych reprezentującego wartości średnie z nieokreślonego okresu „zaciskania” (4-13). W niniejszym przykładzie poziomy glukozy były zbliżone między grupą kontrolną a grupą karmioną dietą wysokotłuszczową, jednak GIR był znacznie niższy w grupie karmionej dietą wysokotłuszczową (Rysunek 4B). Wskazuje to na upośledzenie działania insuliny w całym organizmie. Poziomy insuliny podczas zaciskania były również wyższe w grupie karmionej dietą wysokotłuszczową (Rysunek 4C), co dodatkowo potwierdza obecność fenotypu insulinoopornego u tych myszy. Zastosowanie infuzji znaczników izotopowych pozwala na ocenę działania insuliny w konkretnych tkankach. Glukozy [3-3H] używa się do szacowania szybkości pojawiania się glukozy endogennej (endoRa), która jest wskaźnikiem wątrobowej produkcji glukozy (HGP) oraz szybkości znikania glukozy z całego organizmu (Rd). Podczas gdy insulina całkowicie hamuje HGP u myszy kontrolnych, proces ten jest upośledzony u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową (Rysunek 4D). Podobnie zdolność insuliny do stymulowania Rd u myszy kontrolnych jest zaburzona u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową (Rysunek 4E). 2[14C]deoksygLukozę stosuje się do oceny indeksu metabolicznego glukozy (Rg), będącego miarą tkankowo swoistego poboru glukozy. Jak widać w tym przykładzie, stymulowany insuliną pobór glukozy do mięśni szkieletowych jest upośledzony u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową (Rysunek 4F).

Schemat montażu cewnika przedstawiający konfiguracje rurek z Silasticu i PE, pomiary oraz kąty.
Rycina 1: Przygotowanie cewników tętniczych (A) i żylnych (B) oraz MASA (C)tmCewniki tętnicze przygotowuje się poprzez wprowadzenie 1,3-centymetrowego odcinka PE-10 na około 3 mm do 6-centymetrowego odcinka silastiku o średnicy wewnętrznej 0,012". Końcówkę PE-10 ściąga się pod skosem w taki sposób, aby odległość od skosu do silastiku wynosiła 0,9 cm. Cewniki żylne wykonuje się poprzez nasunięcie małego fragmentu silastiku o średnicy wewnętrznej 0,020" na odległość 1,1 cm od ściętego końca 6-centymetrowego odcinka silastiku o średnicy wewnętrznej 0,012". Fragment silastiku o średnicy wewnętrznej 0,020" pełni rolę ogranicznika zabezpieczającego cewnik w żyle szyjnej. Do montażu MASAtmkażdy z dwóch 1,3 cm konektorów o rozmiarze 25G zostaje włożony do każdego z dwóch 3 cm odcinków PE-20. Są one połączone za pomocą małego fragmentu silastyku o średnicy wewnętrznej 0,040". Konektory są zgięte w 120° pod kątem i oddzielone w 45° kąt. Cały zespół zostaje zanurzony w medycznym kleju silikonowym.

Schemat kaniulacji myszy; widoki z boku/z góry; rurki stalowe/PE-20; układy tętnicze/żylne.
Rycina 2: Kaniulowana mysz. Kaniule zostają chirurgicznie wszczepione do lewej tętnicy szyjnej oraz prawej żyły szyjnej. Wolne końce kaniul są wyprowadzone na zewnątrz za głową i podłączone do MASAtm. MASAtm zostaje wprowadzony podskórnie między łopatki. Pozwala to na dostęp naczyniowy podczas eksperymentów z zaciskaniem insulinowym (insulin clamp) bez konieczności unieruchamiania, manipulowania lub znieczulania myszy.

Schemat eksperymentu z zaciskiem insulinowym (insulin clamp) z pompami infuzyjnymi dla glukozy, insuliny, erytrocytów oraz wykresem danych.
Rysunek 3: Przedstawienie układu i harmonogramu eksperymentu zaciskowej insulinowej. Mysz jest przymocowana do dwukanałowego obrotowego złącza (swivel), które służy jako węzeł dla strzykawek do infuzji i pobierania próbek. Typowe układy dla eksperymentów bez użycia infuzji znaczników (A) oraz z użyciem zarówno [3-3H]glukoza i 2[14C]deoksyglukozy (B) przedstawiono na rysunku. Przedstawiono również harmonogram procedur przygotowania i przeprowadzenia zacisku insulinowego (C). Podczas zacisku pobrano próbki krwi (Metoda chromatograficzna; rozdział czerwonego barwnika; schemat; technika analizy chemicznej; układ chromatograficzny.) pobierane są co 10 min w celu pomiaru glikemii. GIR jest odpowiednio dostosowywany, aby utrzymać euglikemię. Próbki do pomiaru wyjściowego stężenia glukozy we krwi, insuliny w osoczu oraz [3-3pobierane są w t = -15 i -5 min. Próbki osocza do oznaczania glukozy [3-3poziomy glukozy są mierzone w czasach t = 80, 90, 10, 10 i 120 min, a w przypadku zacisku insulinowego w czasach t = 100 i 120 min. 2[14[C]deoksyglukozę podaje się po pobraniu próbki w czasie t = 120 min, a krew pobiera się odpowiednio w 2, 15, 25 i 35 min później. Tkanki pobiera się po pobraniu próbki w czasie t = 35 min.

Równowaga statyczna, wyniki eksperymentu z clampem glukozo-insulinowym; wykresy analizy glukozy, insuliny, Rd oraz Rg.
Rycina 4: Wyniki eksperymentu z użyciem zacisku insulinowego, porównującego myszy na diecie kontrolnej (Chow) z myszami na diecie wysokotłuszczowej (HFD). Przedstawiono przebieg czasowy stężenia glukozy w tętnicach (A) i wskaźnika GIR (B), poziom insuliny wyjściowy oraz podczas zacisku (C), EndoRa (D), Rd (E) oraz Rg w mięśniach szkieletowych (mięsień brzuchaty i mięsień obszerny boczny) (F). Wszystkie wyniki wskazują na wpływ podawania diety wysokotłuszczowej na indukcję insulinooporności.

Dyskusja

Zaciśnięcie hiperinsulinemiczno-euglikemiczne, czyli clamp insulinowy, jest powszechnie uważane za „złoty standard” w ocenie działania insuliny in vivo. Technikę tę stosowano u wielu gatunków, w tym u ludzi, psów, szczurów i myszy. Ze względu na rosnącą liczbę transgenicznych modeli mysich w badaniach nad zaburzeniami metabolicznymi, miniaturyzacja tej metody do zastosowania u myszy przyczyniła się do znaczącego postępu w badaniach nad metabolizmem.

Choć koncepcje stojące za zaciskiem insulinowym (insulin clamp) są proste, w praktyce stosuje się różne podejścia do przeprowadzania eksperymentów z wykorzystaniem tej metody. Nie jest to kwestia drugorzędna, ponieważ sposób przeprowadzenia eksperymentu wpływa na uzyskane wyniki1. Przedstawiamy tutaj protokół stosowany w Vanderbilt MMPC. Kluczową różnicą między naszym protokołem a innymi jest wykorzystanie cewnika tętniczego do pobierania próbek krwi. Stanowi to kontrast do powszechniej stosowanego podejścia, polegającego na pobieraniu krwi poprzez odcięcie końcówki ogona4, 7, 11, 12, 14-17. Zaletą pobierania próbek z cewnika tętniczego jest możliwość przeprowadzenia eksperymentu na myszy świadomej i nieunieruchomionej. Pobieranie krwi z ogona często wymaga unieruchomienia zwierzęcia i zwiększa wskaźniki stresu przy pobieraniu dużych objętości krwi1. Hormony stresu stymulują endogenną produkcję glukozy i upośledzają jej utylizację18, 19, co może stwarzać pozory fenotypu insulinoopornego. Pobieranie krwi z odciętego ogona może wymagać specjalnej zgody Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) ze względu na stresogenny charakter tej procedury. Procedura kaniulacji tętnicy została opracowana, aby uniknąć stresu związanego z odcinaniem ogona u myszy.

Kluczowym aspektem przeprowadzania zacisków insulinowych (insulin clamps) jest zdolność do utrzymania euglikemii. Nie istnieją algorytmy, które mogłyby prawidłowo przewidzieć, w jaki sposób należy dostosować GIR na podstawie pomiarów glukozy we krwi. Podobnie jak w przypadku zabiegu chirurgicznego, personel przeprowadzający eksperymenty z zaciskiem insulinowym nabierze biegłości w utrzymywaniu stabilnej euglikemii jedynie poprzez doświadczenie. Należy zauważyć, że ze względu na wyższy wskaźnik metaboliczny, dane uzyskane w badaniach na myszach będą z natury obarczone większym szumem. Powoduje to, że kompletna prezentacja danych, w tym przebiegi czasowe glukozy i GIR oraz wartości bezwzględne insuliny w osoczu, endoRa, Rd i Rg, jest kluczowa dla możliwości interpretacji wyników przez każdego czytelnika. Wysokie tempo przepływu glukozy u myszy (około 5 razy wyższe niż u ludzi) uzasadnia wysoką częstotliwość pobierania próbek glukozy. Chociaż objętość krwi myszy jest ograniczona, minimalna częstotliwość pobierania próbek raz na 10 minut jest niezbędna, aby mieć pewność, że osiągnięto odpowiedni poziom zacisku.

Jak pokazano na Rysunku 4, poziomy insuliny podczas zacisku (clamp) mogą się różnić między grupami. Czynniki takie jak interwencje dietetyczne, manipulacje transgeniczne lub różnice w szczepach tła mogą wpływać na poziom insuliny na czczo, co z kolei może oddziaływać na poziomy insuliny podczas zacisku. Interpretacja wyników w przypadku różnic w poziomach insuliny podczas zacisku może być problematyczna. Można temu zaradzić eksperymentalnie, przeprowadzając badania pilotażowe w celu wybrania takich prędkości wlewu insuliny, które zapewnią równoważne poziomy insuliny podczas zacisku pomiędzy grupami. Alternatywnie można zastosować somatostatynę do zahamowania wydzielania hormonów trzustkowych, a następnie zastąpić insulinę i glukagon w eksperymentalnie kontrolowanych dawkach. To drugie podejście jest częściej stosowane w zaciskach insulinowych u szczurów niż u myszy. Jeśli nie zastosowano tych metod eksperymentalnych, wartość GIR w stanie stacjonarnym można znormalizować do poziomu insuliny podczas zacisku lub z danych z zacisku można wyprowadzić wskaźnik wrażliwości na insulinę (SI) jako SI=GIR/(G•ΔI), gdzie G to stężenie glukozy w stanie stacjonarnym, a ΔI to różnica między stężeniem insuliny na czczo a stężeniem podczas zacisku. Założeniem w obu tych podejściach jest to, że osiągnięty poziom insuliny podczas zacisku mieści się w zakresie, w którym wrażliwość na insulinę jest liniowo powiązana z poziomem insuliny dla badanej grupy. To ostatnie założenie może nie mieć zastosowania przy porównywaniu grup z insulinoopornością i grup wrażliwych na insulinę. Idealnie należałoby wygenerować krzywą odpowiedzi na dawkę insuliny, aby dobrać odpowiedni wlew insuliny. Jednak ze względu na konieczność przeprowadzenia dodatkowych eksperymentów, rzadko się to robi.

Wszechstronność zapewniana przez cewnikowanie tętnicze znajduje zastosowanie w podejściach eksperymentalnych wykraczających poza zaciski euglikemiczne. Na przykład zaciski hiperglikemiczne, w których glukozę wlewa się z różną prędkością w celu utrzymania hiperglikemii w stosunku do poziomu glukozy na czczo, mogą być wykorzystywane do oceny endogennej funkcji trzustki in vivo2, 20, 21. Pomiar pierwszej fazy sekrecji insuliny podczas tego testu wymaga częstego pobierania próbek krwi (tj. co 2-5 min), co nie jest możliwe przy pobieraniu próbek z końcówki ogona. Co więcej, podwyższony poziom katecholamin wynikający z pobierania krwi z ogona może upośledzić sekrecję insuliny i nasilić sekrecję glukagonu22. Protokół zacisku insulinowego można również zmodyfikować tak, aby umożliwić spadek poziomu glukozy do względnej hipoglikemii w celu oceny odpowiedzi przeciwregulacyjnej2, 23, 24. Cewnikowanie tętnicze może być również stosowane do oceny dynamiki metabolizmu glukozy podczas wysiłku fizycznego25-30. Jest to znacznie korzystniejsze niż konwencjonalne podejścia prowadzone w pojedynczych punktach czasowych przed i po wysiłku lub w izolowanych mięśniach ex vivo. Zaprezentowane tutaj techniki mogą być wykorzystywane do oceny nie tylko glukozy, ale także metabolizmu kwasów tłuszczowych31.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez grant 5-U24-DK059637-10 przyznany Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center.

Bibliografia

  1. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
  2. Berglund, E. D., Li, C. Y., Poffenberger, G., Ayala, J. E., Fueger, P. T., Willis, S. E., Jewell, M. M., Powers, A. C., Wasserman, D. H. Glucose metabolism in vivo in four commonly used inbred mouse strains. Diabetes. 57, 1790-1799 (2008).
  3. Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism. J. Biol. Chem. 272, 22570-22575 (1997).
  4. Kim, H. J., Higashimori, T., Park, S. Y., Choi, H., Dong, J., Kim, Y. J., Noh, H. L., Cho, Y. R., Cline, G., Kim, Y. B., Kim, J. K. Differential effects of interleukin-6 and -10 on skeletal muscle and liver insulin action in vivo. Diabetes. 53, 1060-1067 (2004).
  5. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Chen, Y., Yu, C., Moore, I. K., Pypaert, M., Lutz, E. P., Kako, Y., Velez-Carrasco, W., Goldberg, I. J., Breslow, J. L., Shulman, G. I. Tissue-specific overexpression of lipoprotein lipase causes tissue-specific insulin resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 7522-7527 (2001).
  6. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Gavrilova, O., Chao, L., Higashimori, T., Choi, H., Kim, H. J., Yu, C., Chen, Y., Qu, X., Haluzik, M., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Differential effects of rosiglitazone on skeletal muscle and liver insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. Diabetes. 52, 1311-1318 (2003).
  7. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Sunshine, M. J., Albrecht, B., Higashimori, T., Kim, D. W., Liu, Z. X., Soos, T. J., Cline, G. W., O'Brien, W. R., Littman, D. R., Shulman, G. I. PKC-theta knockout mice are protected from fat-induced insulin resistance. J. Clin. Invest. 114, 823-827 (2004).
  8. Kim, J. K., Gavrilova, O., Chen, Y., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Mechanism of insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. J. Biol. Chem. 275, 8456-8460 (2000).
  9. Kim, J. K., Gimeno, R. E., Higashimori, T., Kim, H. J., Choi, H., Punreddy, S., Mozell, R. L., Tan, G., Stricker-Krongrad, A., Hirsch, Inactivation of fatty acid transport protein 1 prevents fat-induced insulin resistance in skeletal muscle. J. Clin. Invest. 113, 756-763 (2004).
  10. Kim, J. K., Kim, H. J., Park, S. Y., Cederberg, A., Westergren, R., Nilsson, D., Higashimori, T., Cho, Y. R., Liu, Z. X., Dong, J., Cline, G. W., Enerback, S., Shulman, G. I. Adipocyte-specific overexpression of FOXC2 prevents diet-induced increases in intramuscular fatty acyl CoA and insulin resistance. Diabetes. 54, 1657-1663 (2005).
  11. Kim, J. K., Kim, Y. J., Fillmore, J. J., Chen, Y., Moore, I., Lee, J., Yuan, M., Li, Z. W., Karin, M., Perret, P., Shoelson, S. E., Shulman, G. I. Prevention of fat-induced insulin resistance by salicylate. J. Clin. Invest. 108, 437-446 (2001).
  12. Kim, J. K., Michael, P. revis, Peroni, S. F., Mauvais-Jarvis, O. D., Neschen, F., Kahn, S., Kahn, B. B., R, C., Shulman, G. I. Redistribution of substrates to adipose tissue promotes obesity in mice with selective insulin resistance in muscle. J. Clin. Invest. 105, 1791-1797 (2000).
  13. Kim, J. K., Zisman, A., Fillmore, J. J., Peroni, O. D., Kotani, K., Perret, P., Zong, H., Dong, J., Kahn, C. R., Kahn, B. B., Shulman, G. I. Glucose toxicity and the development of diabetes in mice with muscle-specific inactivation of GLUT4. J. Clin. Invest. 108, 153-160 (2001).
  14. Haluzik, M., Gavrilova, O., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha deficiency does not alter insulin sensitivity in mice maintained on regular or high-fat diet: hyperinsulinemic-euglycemic clamp studies. Endocrinology. 145, 1662-1667 (2004).
  15. Haluzik, M., Yakar, S., Gavrilova, O., Setser, J., Boisclair, Y., LeRoith, D. Insulin resistance in the liver-specific IGF-1 gene-deleted mouse is abrogated by deletion of the acid-labile subunit of the IGF-binding protein-3 complex: relative roles of growth hormone and IGF-1 in insulin resistance. Diabetes. 52, 2483-2489 (2003).
  16. Haluzik, M. M., Lacinova, Z., Dolinkova, M., Haluzikova, D., Housa, D., Horinek, A., Vernerova, Z., Kumstyrova, T., Haluzik, M. Improvement of insulin sensitivity after peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment is accompanied by paradoxical increase of circulating resistin levels. Endocrinology. 147, 4517-4524 (2006).
  17. Kim, H., Haluzik, M., Asghar, Z., Yau, D., Joseph, J. W., Fernandez, A. M., Reitman, M. L., Yakar, S., Stannard, B., Heron-Milhavet, L., Wheeler, M. B., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment in a transgenic model of type 2 diabetes reverses the lipotoxic state and improves glucose homeostasis. Diabetes. 52, 1770-1778 (2003).
  18. Deibert, D. C., DeFronzo, R. A. Epinephrine-induced insulin resistance in man. J. Clin. Invest. 65, 717-721 (1980).
  19. Rizza, R. A., Cryer, P. E., Haymond, M. W., Gerich, J. E. Adrenergic mechanisms for the effects of epinephrine on glucose production and clearance in man. J. Clin. Invest. 65, 682-689 (1980).
  20. Nunemaker, C. S., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Sweet, I. R., Teague, J. C., Satin, L. S. Insulin secretion in the conscious mouse is biphasic and pulsatile. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 523-529 (2006).
  21. Nunemaker, C. S., Zhang, M., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Powers, A. C., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. S. Individual mice can be distinguished by the period of their islet calcium oscillations: is there an intrinsic islet period that is imprinted in vivo. Diabetes. 54, 3517-3522 (2005).
  22. Halter, J. B., Beard, J. C., Jr, P. orte, D, Islet function and stress hyperglycemia: plasma glucose and epinephrine interaction. Am. J. Physiol. 247, 47-52 (1984).
  23. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 678-684 (2006).
  24. Jacobson, L., Ansari, T., Potts, J., McGuinness, O. P. Glucocorticoid-deficient corticotropin-releasing hormone knockout mice maintain glucose requirements but not autonomic responses during repeated hypoglycemia. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291, 15-22 (2006).
  25. Ayala, J. E., Bracy, D. P., James, F. D., Julien, B. M., Wasserman, D. H., Drucker, D. J. The glucagon-like peptide-1 receptor regulates endogenous glucose production and muscle glucose uptake independent of its incretin action. Endocrinology. 150, 1155-1164 (2009).
  26. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Granner, D. K., Wasserman, D. H. Hexokinase II overexpression improves exercise-stimulated but not insulin-stimulated muscle glucose uptake in high-fat-fed C57BL/6J mice. Diabetes. 53, 306-314 (2004).
  27. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Wasserman, D. H. Distributed control of glucose uptake by working muscles of conscious mice: roles of transport and phosphorylation. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 286, 77-84 (2004).
  28. Fueger, P. T., Heikkinen, S., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Laakso, M., Wasserman, D. H. Hexokinase II partial knockout impairs exercise-stimulated glucose uptake in oxidative muscles of mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, 958-963 (2003).
  29. Fueger, P. T., Hess, H. S., Posey, K. A., Bracy, D. P., Pencek, R. R., Charron, M. J., Wasserman, D. H. Control of exercise-stimulated muscle glucose uptake by GLUT4 is dependent on glucose phosphorylation capacity in the conscious mouse. J. Biol. Chem. , (2004).
  30. Fueger, P. T., Li, C. Y., Ayala, J. E., Shearer, J., Bracy, D. P., Charron, M. J., Rottman, J. N., Wasserman, D. H. Glucose kinetics and exercise tolerance in mice lacking the GLUT4 glucose transporter. J. Physiol. 582, 801-812 (2007).
  31. Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate. Lipids. 43, 703-711 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zacisk hiperinsulinemiczno euglikemicznyocena dzia ania insulinyog lnoustrojowa wra liwo na insulintkankowo specyficzne poch anianie glukozypobieranie pr bek z cewnika t tniczegoszybko wlewu glukozywlew znacznika izotopowegow trobowa produkcja glukozyprotok implantacji cewnika

Powiązane artykuły