Zogniskowane ultradźwięki o wysokiej intensywności do blokowania potencjałów czynnościowych nerwów w modelu szczura z cukrzycą

Streszczenie

Źródło: Lee, Y. F., et al. Ultradźwiękowe narzędzie do blokowania przewodnictwa nerwowego w modelach szczurów z cukrzycą. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje zastosowanie skoncentrowanych ultradźwięków o wysokiej intensywności (HIFU) do blokowania potencjałów czynnościowych od nerwu kulszowego do mięśnia brzuchatego łydki w modelu szczura z cukrzycą. Po dostarczeniu wiązki HIFU do nerwu, spadek sygnału mięśniowego potwierdza potencjał HIFU jako nieinwazyjnej terapii łagodzącej ból w neuropatii cukrzycowej.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Blokada przewodnictwa nerwowego in vivo za pomocą przetwornika ultradźwiękowego o wysokiej intensywności (HIFU)

UWAGA: Eksperyment in vivo rozpoczyna się w 5 tygodniu po wstrzyknięciu 50 mg/kg streptozotocyny (STZ).

1. Wykonuj procedury na zwierzętach przed zablokowaniem złożonych potencjałów czynnościowych mięśni (CMAP) za pomocą sonikacji HIFU.
   1. Przed zabiegiem wysterylizuj narzędzia chirurgiczne (skalpel, nożyczki, kleszcze i szklany haczyk) w autoklawie.
   2. Znieczulenie szczurów należy podać dootrzewnowo mieszaniną tiletaminy/zolazepamu (40 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) lub wdychając 1,75% izofluranu za pomocą parownika izofluranu. Umieść szczury na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ich ciała.
   3. Ustaw szczury do operacji w pozycji brzusznej. Nałóż maść na oczy. Wyprostuj nogę szczura i uszczypnij podeszwową powierzchnię stopy paznokciami, aby ustalić głębokość znieczulenia. Jeśli szczury wykazują reakcje odstawienia, zastosuj dodatkowe znieczulenie.
   4. Usuń włosy z uda i dolnej części pleców szczurów za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia. Nałóż płynny jod z czystą gazą na miejsce operacji i okrężnie przesuwaj gazę na zewnątrz od pola operacyjnego. Użyj wacika nasączonego alkoholem, aby wytrzeć płynny jod tymi samymi okrężnymi ruchami. Eksperyment ten przeprowadza się na lewym i prawym polu operacyjnym. Powtórz zabieg w drugim miejscu operacyjnym podczas wykonywania kolejnego kroku zabiegu.
   5. Użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych lub skalpela, aby wykonać nacięcie skóry na grzbiecie uda. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby ostrożnie oddzielić tkankę pod skórą i zabezpieczyć skórę haczykami do skóry. Kość udową można zobaczyć w mięśniach.
   6. Użyj nożyczek, aby ostrożnie oddzielić mięśnie równoległe do kości udowej, aż widoczne będą włókna nerwu kulszowego w połowie uda, które są osadzone w mięśniach. Ostrożnie użyj szklanego haczyka, aby oddzielić nerw kulszowy w połowie uda od otaczających tkanek łącznych i mięśni.
2. Umieść nerw kulszowy w strefie ogniskowej HIFU za pomocą specjalnie wykonanego stabilizatora nerwu (ryc. 1 i ryc. 2).
   UWAGA: Wykonany na zamówienie stabilizator nerwu składa się z 3 elementów (ryc. 2). Wszystkie elementy wykonane są z przezroczystego polimetakrylanu metylu (PMMA). Gwint zewnętrzny górnej konstrukcji komponentu I ma wysokość 2,5 mm i M10XP0,7 (Rysunek 3A). Studzienka centralna to otwór o średnicy 4,0 mm przechodzący przez komponent I. Dolny otwór studni jest uszczelniony arkuszem taśmy. Średnica szczeliny wynosi 1,2 mm, a odległość między płaszczyzną środkową szczeliny a górną powierzchnią elementu I wynosi 3,1 mm. Komponent II składa się z korpusu głównego, czterech nóg i dolnej struktury (rysunek 3B). Gwint wewnętrzny dolnej konstrukcji ma wysokość 2,5 mm i M10XP0,7 pasuje do gwintu zewnętrznego komponentu I. Średnica centralnego otworu jest taka sama jak centralna studzienka elementu I. Wymiary korpusu głównego to 32 mm średnicy i 5,4 mm grubości. Cztery nogi są symetrycznie rozstawione. Dwie identyczne krótkie nogi są przeznaczone do wyrównania, a dwie identyczne długie nogi służą do zaczepiania o komponent III. Średnica zewnętrzna i wysokość elementu III wynoszą 41 mm i 9,2 mm. Gwint wewnętrzny to M36XP1.0, a otwór przelotowy ma średnicę 27,5 mm (Rysunek 3C). Stożek jest wydrążonym stożkiem z górnym otworem o średnicy 84 mm i dolnym otworem o średnicy 27,5 mm. Wysokość wynosi 57,5 mm (Rysunek 4A).
   1. Przed eksperymentem namocz wykonany na zamówienie akrylowy stabilizator nerwów w roztworze wybielacza na 30 - 60 minut, a następnie namocz go w sterylnej wodzie.
   2. Za pomocą szklanego haczyka ostrożnie podnieś nerw i umieść go w szczelinie elementu I.
   3. Przykręcić komponent II do składnika I. Napełnić centralną studzienkę składnika I roztworem Ringera do propagacji ultradźwiękowej i zachowania nerwów.
   4. Przykręcić element III do stożka obudowy HIFU. Zadokuj komponent III z komponentem II przez cztery nogi komponentu II.
      UWAGA: Geometryczny środek trzech komponentów i przetwornika jest wyrównany. Odległość między nerwem a przetwornikiem jest równa ogniskowej, co zapewnia, że nerw znajduje się w strefie ogniskowej HIFU.
3. Włóż jedną parę igieł do akupunktury w początek nerwu kulszowego, a drugą parę w mięsień brzuchaty łydki. Podłącz każdą parę igieł do systemu akwizycji elektrofizjologicznej za pomocą elektrycznego koncentrycznego (Rysunek 1).
   UWAGA: Na jednym końcu znajdują się dwa zaciski krokodylkowe do oddzielnego przypięcia dwóch igieł, a na drugim końcu znajduje się bagnetowe złącze Neill-Concelman (BNC) do połączenia systemu. Pary igieł do akupunktury działają jako elektrody stymulujące na nerwie kulszowym, a elektrody rejestrujące na mięśniu brzuchatym łydki.
   1. Ustaw częstotliwość próbkowania i szerokość pasma systemu akwizycji elektrofizjologii odpowiednio na 50 kHz i 70 Hz-3 kHz. Zastosuj bodziec supramaksymalny o szerokości impulsu 0,1 ms do elektrod stymulujących u początku nerwu kulszowego.
   2. Rejestruj CMAP z elektrod rejestrujących i wzmacniaj CMAP za pomocą wbudowanego wzmacniacza w systemie akwizycji elektrofizjologii.
      UWAGA: Użyj wbudowanego wzmacniacza w systemie akwizycji elektrofizjologii, aby wzmocnić sygnały nerwowe i zarejestrować CMAP z elektrod rejestrujących za pomocą systemu akwizycji elektrofizjologii.
4. Użyj komercyjnego przetwornika HIFU 2.68 MHz, aby stłumić CMAP u szczurów z cukrzycą neuropatyczną.
   UWAGA: Specyfikacja przetwornika jest opisana w następujący sposób: jednoelementowa misa sferyczna o średnicy otworu 6 cm i ogniskowej 5 cm oraz elipsoidalna strefa ogniskowa o głębokości 4 mm i szerokości 0,8 mm w polu swobodnym.
   1. Zanurz stożek sferyczny, przetwornik HIFU i pokrywę stożka w zbiorniku wypełnionym odgazowaną wodą. Umieść przetwornik HIFU w stożku sferycznym i przymocuj pokrywę stożka do górnego otworu stożka sferycznego za pomocą sześciu z kulistym (Rysunek 4B). Po naturalnym usunięciu pęcherzyków w stożku sferycznym ze względu na niską gęstość pęcherzyków w porównaniu z wodą, należy uszczelnić przedni otwór stożka przezroczystą taśmą o grubości 0,03 mm. Przykręć element III do kulistego stożka.
   2. Wyjmij przetwornik HIFU ze sferycznym stożkiem i komponentem III ze zbiornika odgazowanej wody.
      UWAGA: Woda z odwróconej osmozy (RO) użyta w badaniu to woda oczyszczona w procesie odwróconej osmozy. Woda RO jest gotowana w celu usunięcia gazu. Po schłodzeniu odgazowaną wodę uzyskuje się w indywidualnie szczelnym zbiorniku.
5. Ostrożnie umieść składnik I w przestrzeni między nerwem a mięśniem i umieść nerw w szczelinie składnika I. Wykonaj kroki 1.2.3 i 1.2.4, aby upewnić się, że nerw znajduje się w strefie ogniskowej HIFU (ryc. 2A).
6. Połącz generator funkcyjny i wzmacniacz mocy o częstotliwości radiowej. Podłącz wzmacniacz mocy do przetwornika HIFU, aby wygenerować wiązkę HIFU. Ręcznie ustawić napięcie wyjściowe generatora funkcyjnego do przetwornika HIFU za pośrednictwem wzmacniacza mocy. Ręcznie wyłącz generator funkcyjny po upływie czasu ekspozycji HIFU. Obserwuj czas za pomocą timera.
   UWAGA: Intensywność i energia wiązki HIFU użytej w tym badaniu wynoszą odpowiednio 2,810 W/^cm2 i 84 J/^mm2.
7. Jednocześnie dostarcz bodziec za pomocą systemu akwizycji elektrofizjologii (krok 1.3) i wiązkę HIFU za pośrednictwem systemu HIFU (krok 1.6) do nerwu kulszowego, jednocześnie rejestrując CMAP. Stopniowo zwiększaj ekspozycję HIFU na nerw kulszowy od 3 s, 5 s do 8 s, aż do momentu zaobserwowania zmniejszenia lub zahamowania amplitudy CMAP.
   1. Nagrywaj CMAP raz na sekundę podczas dostarczania wiązki HIFU. Po zaobserwowaniu zmiany amplitudy CMAP należy wyłączyć system HIFU i ręcznie kliknąć ikonę nagrywania w oprogramowaniu do akwizycji elektrofizjologicznej, aby rejestrować CMAP co 2 minuty we wczesnych 10 minutach, co 5 minut w kolejnych 30 minutach i co 10 minut w ostatniej fazie, aż czas nagrywania osiągnie 2 godziny.
8. Oddzielne elementy II i III stabilizatora nerwu (ryc. 2) w celu usunięcia przetwornika HIFU z miejsca nacięcia. Oddziel elementy II i I, aby uwolnić zabezpieczony nerw kulszowy. Zszyj miejsce operacyjne szczura z cukrzycą za pomocą 4-0 chromowych szwów katgutowych po zarejestrowaniu CMAP. Nałóż płynny jod na miejsce operacji, aby zapobiec infekcji.
   1. Umieść klatki na poduszce grzewczej i pozwól szczurom dojść do siebie w klatkach przed powrotem do zakładu dla zwierząt. Podawaj szczurom ibuprofen w wodzie pitnej przez 3 dni lub wstrzyknięcie dootrzewnowe buprenorfiny (0,05 - 0,1 mg/kg).
9. Wprowadzić elektrody stymulujące i rejestrujące w miejscu początkowym nerwu kulszowego i mięśni brzuchatych łydki znieczulonych szczurów z cukrzycą neuropatyczną, jak opisano w krokach 1.1.2 i 1.3 w dniach 7, 14 i 28 po początkowej sonikacji HIFU.

Wyniki

Rysunek 1: Eksperymentalna konfiguracja bloku przewodnictwa nerwowego in vivo z ultradźwiękami o wysokiej intensywności (HIFU). (A) Wykonany na zamówienie akrylowy kulisty stożek, który jest wypełniony wodą odgaz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Streptozotocyna	Sigma	85882
System akwizycji Biopac MP36	Biopac Systems, Inc.
Przetwornik HIFU	Sonic Concepts	H108
Generator funkcyjny	Agilent	33250A
Wzmacniacz mocy	Elektronika i innowacje	1040L
Szczury	Biolasco tajwan	Sprague-Dawley
Puralube maść weterynaryjna	Dechra
Waporyzator Isoflurane	Parkland Scientific	V3000PS
Isoflurane	Attane (Attane)