1. Przygotowanie robaków do obrazowania
- Przygotowanie wacików agarowych
- Przygotuj 3 ml 10% agaru, rozpuszczając agar klasy molekularnej w M9 w szklanej probówce hodowlanej o wymiarach 13 mm x 100 mm i mikrofaluj przez kilka sekund.
UWAGA. Stopiony agar może być przechowywany w bloku grzewczym do 1 godziny lub może być świeży za każdym razem, gdy potrzebne są płatki agarowe. - Umieść szkiełko mikroskopowe między dwoma dodatkowymi szkiełkami, z których każde ma dwie warstwy taśmy laboratoryjnej (patrz rysunek 1A-i).
- Odetnij końcówkę końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl (bez filtra) i użyj jej do naniechania małej kropli agaru na środkowe szkiełko nakrywkowe (Rysunek 1A-i).
- Spłaszcz agar, naciskając kolejny szkiełko na wierzchu agaru (Rysunek 1A-ii).
- Po schłodzeniu pokrój agar na mały krążek, korzystając z otworu szklanej probówki hodowlanej o wymiarach 13 mm x 100 mm (Rysunek 1A-iii), a następnie usuń otaczający agar.
- Przygotowanie roztworu do walcowania robaków
- Rozpuść proszek muscymolu w M9, aby uzyskać zapas o pojemności 30 mM. Rozdzielić na 50 μl porcji i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Rozmrażać nową porcję 30 mM muscymolu co 3-5 dni (i przechowywać w temperaturze 20 °C podczas użytkowania).
- Rozcieńczyć 30 mM bulion muscymolowy w stosunku 1:1 kulkami polistyrenu, aby uzyskać roztwór do walcowania.
- Pozycjonowanie robaka do obrazowania
- Umieść 1,6 μl roztworu do walcowania na środku podkładki agarowej.
UWAGA: Ilość płynu powinna być dostosowana do obrazowania młodszych (mniej) lub starszych zwierząt (więcej). - Używając preferowanego kilofa do robaków (tj. szpikulca lub platynowego drutu), przenieś robaka w pożądanym wieku bez fenotypu wielosromu do roztworu do walcowania na podkładce agarowej (Figura 1A-iv). nuta. Reprezentatywne dane pochodzą od 1-dniowych hermafrodytów (szczep GCaMP6f = FJH185; szczep mitoGCaMP; FJH597), który można zidentyfikować po obecności tylko jednego rzędu jaj.
- Poczekaj ~ 5 minut, aż muscimol zmniejszy ruch robaka, a następnie upuść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm na podkładkę agarową, fizycznie ograniczając ruch robaka.
- W celu zobrazowania neurytów w brzusznym rdzeniu nerwowym, zwiń robaka do orientacji pokazanej na rysunkach 1B i 1C, lekko przesuwając szkiełko nakrywkowe.
UWAGA. Aby uwidocznić brzuszny rdzeń nerwowy, ustaw robaka z głową do góry i przetaczaj robaka, aż jelito znajdzie się po prawej stronie bliższej części, a po lewej stronie dystalnej części robaka (z perspektywy widza). Odwróć tę orientację (ryc. 1C) do obrazowania neurytów w rdzeniu nerwowym grzbietowym.
- Montaż robaka na mikroskopie
- Umieść kroplę olejku immersyjnego na szkiełku nakrywkowym przed zamontowaniem go na stoliku mikroskopu.
- Znajdź robaka za pomocą obiektywu o małym powiększeniu (10x) w jasnym polu.
- Przełącz się na obiektyw 100x i wyreguluj ostrość.
- Zlokalizuj neuryt AVA za pomocą oświetlenia GCaMP lub mitoGCaMP za pomocą lasera obrazującego 488 nm.
UWAGA: Użyj niewielkich regulacji, aby zapobiec zgnieceniu robaka lub ściągnięciu szkiełka nakrywkowego.
2. Akwizycja strumieni obrazu o wysokiej rozdzielczości
- Obrazowanie in vivo GCaMP
- Ustaw czas naświetlania na 20 ms.
- Dostosuj ustawienia lasera obrazowania i akwizycji, aż podstawowa fluorescencja GCaMP znajdzie się w środkowym zakresie zakresu dynamicznego aparatu. Zapoznaj się z dyskusją, aby uzyskać sugestie dotyczące optymalizacji parametrów obrazowania przy użyciu innych ustawień mikroskopowych.
UWAGA: W przypadku konfiguracji optycznej użytej w tym badaniu ustaw laser obrazujący 488 nm na następujące ustawienia wyjściowe: moc lasera = 50% i tłumienie = 1. Zmodyfikuj dodatkowe ustawienia akwizycji w następujący sposób: wzmocnienie zwielokrotnienia elektronów EM = 200 i wzmocnienie przedwzmacniacza = 1. - Po zlokalizowaniu neurytu AVA za pomocą fluorescencji GCaMP przy 100-krotnym powiększeniu, ustaw korektor dryfu Z (ZDC, patrz tabela materiałów) na zakres ±30 μm i rozpocznij ciągły autofokus. W razie potrzeby należy ręcznie skorygować płaszczyznę ogniskowej przed obrazowaniem.
- Uchwyć strumień obrazów w 100-krotnym powiększeniu. Czas trwania wynoszący nawet 10 minut można osiągnąć przy użyciu konfiguracji zastosowanej w tym badaniu.
- Obrazowanie in vivo mitoGCaMP
- Wykonaj kroki 2.1.1- 2.1.2, aby uzyskać podstawową fluorescencję mitoGCaMP w średnim zakresie dla zakresu dynamicznego kamery.
UWAGA. W przypadku konfiguracji optycznej zastosowanej w tym badaniu należy ustawić laser obrazujący 488 nm na następujące ustawienia wyjściowe: moc lasera = 20% i tłumienie = 10. Zmodyfikuj ustawienia akwizycji na następujące: wzmocnienie EM = 100 i wzmocnienie wzmacniacza przedwzmacniacza = 2. - Po zlokalizowaniu mitochondriów w neurycie AVA za pomocą fluorescencji mitoGCaMP, ustaw ZDC zgodnie z opisem powyżej w kroku 2.3.
- Uchwyć strumień obrazów w 100-krotnym powiększeniu.
