Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie Hsp104, białkowej dysagregazy

17.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3190

⸱

30 września 2011

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy protokół oczyszczania wysoce aktywnego białka Hsp104, heksamerycznego białka AAA+ z drożdży, które sprzęga hydrolizę ATP z disagregacją białek. Schemat ten wykorzystuje konstrukt z oznakowaniem His6 do oczyszczania powinowactwa z E. coli, a następnie chromatografię wymiany anionowej, usunięcie znacznika His6 za pomocą proteazy TEV oraz chromatografię wykluczania cząsteczkowego.

Streszczenie

Hsp104 jest heksamerycznym białkiem AAA+1 pochodzącym z drożdży, które łączy hydrolizę ATP z dysagregacją białek2-10 (Rys. 1). Aktywność ta zapewnia dwie kluczowe przewagi selekcyjne. Po pierwsze, renaturacja nieuporządkowanych agregatów przez Hsp104 umożliwia przetrwanie drożdży po różnych stresach związanych z błędnym fałdowaniem białek, w tym po szoku termicznym3,5,11,12. Po drugie, przebudowa włókien amyloidowych o strukturze cross-beta przez Hsp104 pozwala drożdżom wykorzystywać liczne priony (zakaźne amyloidy) jako rezerwuar korzystnej i dziedzicznej zmienności fenotypowej13-22. Co niezwykłe, Hsp104 bezpośrednio przebudowuje oligomery preamyloidowe i włókna amyloidowe, w tym te składające się z drożdżowych białek prionowych Sup35 i Ure223-30. Ta funkcjonalność przebudowy amyloidów jest wyspecjalizowaną cechą drożdżowego Hsp104. Ortolog z E. coli, ClpB, nie potrafi przebudowywać oligomerów preamyloidowych ani włókien amyloidowych26,31,32.

Ortologi Hsp104 występują we wszystkich królestwach organizmów z wyjątkiem, co jest zagadkowe, zwierząt. W rzeczywistości nie wiadomo, czy komórki zwierzęce posiadają jakikolwiek system enzymatyczny, który łączy dysagregację białek z renaturacją (a nie degradacją)33-35. W związku z tym my i inni zaproponowaliśmy, że Hsp104 może zostać opracowane jako środek terapeutyczny w leczeniu różnych chorób neurodegeneracyjnych związanych z błędnym fałdowaniem specyficznych białek w toksyczne oligomery preamyloidowe i włókna amyloidowe4,7,23,36-38. Nie istnieją leki, które bezpośrednio celują w gatunki zagregowane związane z tymi chorobami. Tymczasem Hsp104 rozpuszcza toksyczne oligomery i włókna amyloidowe składające się z alfa-synukleiny, które są związane z chorobą Parkinsona23, a także amyloidowe formy PrP39. Co istotne, Hsp104 redukuje agregację białek i łagodzi neurodegenerację w modelach gryzoni w chorobie Parkinsona23 oraz chorobie Huntingtona38. Idealnie, aby zoptymalizować terapię i zminimalizować skutki uboczne, Hsp104 zostałoby zmodyfikowane i usprawnione tak, aby selektywnie przebudowywać specyficzne agregaty kluczowe dla danej choroby4,7. Jednak ograniczone zrozumienie strukturalne i mechanistyczne tego, w jaki sposób Hsp104 dysagreguje tak zróżnicowany repertuar struktur zagregowanych i niepowiązanych białek, utrudnia te starania30,40-42.

Aby zrozumieć strukturę i mechanizm działania Hsp104, niezbędne jest zbadanie czystego białka i odtworzenie jego aktywności dysagregazy przy użyciu minimalnej liczby komponentów. Hsp104 jest białkiem o masie 102 kDa i pI ~5,3, które tworzy heksamery w obecności ADP lub ATP, bądź przy wysokich stężeniach białka w przypadku braku nukleotydów43-46. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół oczyszczania wysokiej aktywności, stabilnego białka Hsp104 z E. coli. Wykorzystanie E. coli umożliwia uproszczoną produkcję na dużą skalę, a nasza metoda może być przeprowadzona szybko i niezawodnie dla licznych wariantów Hsp104. Nasz protokół zwiększa czystość Hsp104 i upraszcza usuwanie znacznika His6 w porównaniu z poprzednią metodą oczyszczania z E. coli47. Ponadto nasz protokół jest prostszy i wygodniejszy niż dwa nowsze protokoły26,48.

Protokół

1. Ekspresja Hsp104

  1. Plazmid wykorzystywany do oczyszczania w E. coli, pPROEX-HTb-Hsp104, zawiera otwartą ramkę odczytu Hsp104 pod indukowalną kontrolą promotora trc26. Plazmid ten produkuje Hsp104 z N-terminalnym znacznikiem His6, który może zostać usunięty poprzez cięcie proteazą TEV. Przetransformuj pPROEX-HTb-Hsp104 do zoptymalizowanych kodonowo komórek E. coli BL21-CodonPlus-RIL (Stratagene, Agilent Technologies), stosując typową procedurę transformacji bakteryjnej (np. zgodnie z instrukcją producenta). Ważne jest użycie zoptymalizowanego kodonowo szczepu E. coli, ponieważ Hsp104 wykazuje nietypową preferencję kodonów.
  2. Zaszczep świeże transformanty do 100mL kultury 2XYT (USB. Przepis: 16g/L peptonu kazeinowego, 10g/L ekstraktu drożdżowego, 5g/L NaCl, pH 7.0) uzupełnionej o 100μg/mL ampicyliny i 34μg/mL chloramfenikolu i inkubuj przez noc w 37°C przy wytrząsaniu z prędkością 200rpm.
  3. Przenieś 10mL kultury nocnej do 6 x 1L pożywki 2XYT z 100μg/mL ampicyliny i 34μg/mL chloramfenikolu w kolbach o pojemności 2L. Inkubuj przy wytrząsaniu z prędkością 250rpm w 37°C do uzyskania OD600 = 0.4-0.6. Przerwij wytrząsanie i obniż temperaturę do 15°C. Pozostaw komórki bez wytrząsania w inkubatorze przez 30min, aż temperatura osiągnie 15°C. Po osiągnięciu 15°C indukuj ekspresję białka, dodając IPTG do stężenia końcowego 1mM. Wznów wytrząsanie z prędkością 250rpm przez noc (12-16 godzin).

2. Zbiór i lizy komórek

  1. Zebrać komórki poprzez wirowanie (w schłodzonym wirniku) z prędkością 4,000rpm przez 20min w temperaturze 4°C (używamy wirówki Sorvall RC 3BP+). Kolejne etapy należy przeprowadzić niezwłocznie, ponieważ aktywność Hsp104 ulega zmniejszeniu po zamrożeniu komórek E. coli. Ponadto wszystkie następne czynności powinny być wykonywane na lodzie lub w temperaturze 4°C.
  2. Resuspendować osad komórkowy w 10mL schłodzonego (na lodzie) buforu do lizy (40mM HEPES-KOH pH 7.4, 500mM KCl, 20mM MgCl2, 2.5% (w/v) glicerolu, 20mM imidazolu, 5μM pepstatyny A, kompletnego koktajlu inhibitorów proteaz (1 tabletka bez EDTA/50mL) oraz 2mM β-merkaptoetanolu).
  3. Przeprowadzić lizę komórek za pomocą homogenizatora French press (Emulsiflex) z wymiennikiem ciepła zanurzonym w wodzie z lodem. Przed rozpoczęciem należy upewnić się, że wszystkie aglomeraty komórkowe zostały rozpuszczone. Po wyrównaniu buforu do lizy w homogenizatorze, dwa przejścia przez cylinder pod ciśnieniem 15,000-18,000psi są wystarczające do pełnej lizy. W przypadku braku dostępu do urządzenia French press można zastosować inkubację z lizozymem, a następnie sonikację (patrz sekcja dyskusja). Odstawić niewielką próbkę zlizowanych komórek (1μL) do analizy SDS-PAGE (Lysate na Rys. 2).
  4. Usunąć szczątki komórkowe poprzez wirowanie z prędkością 16,000rpm przez 20min w temperaturze 4°C (używamy wirówki Sorvall RC5C+). Zebrać nadsącz do następnego etapu i odstawić niewielką próbkę (1μL) nadsączu do analizy SDS-PAGE (Ni Load na Rys. 2).

3. Oczyszczanie białka Hsp104

  1. Wymieszać nadpływ z kroku 2.4 z 12 mL (2 mL kulek Ni-Sepharose na 1 L komórek) 50% zawiesiny kulek Ni-Sepharose (GE) równoważonych buforem do lizy.
  2. Próbkę obracać powoli przez 3 godziny w temperaturze 4°C w taki sposób, aby Ni-Sepharose pozostały równomiernie zawieszone i zminimalizować pienienie. Możliwe są krótsze czasy inkubacji, jednak zmniejszy to wydajność. W 4°C w obecności inhibitorów proteaz degradacja zachodzi w niewielkim stopniu, a 3-godzinny czas inkubacji z Ni-Sepharose nie obniża aktywności produktu końcowego. Odwirować Ni-Sepharose przez 2 min w 4°C przy 2 000 rpm (wirówka Eppendorf 5810R). Odstawić małą próbkę nadpływu do analizy SDS-PAGE (1 μL), a resztę odrzucić (Ni Flow Through (FT) na rys. 2).
  3. Przemyć odzyskane Ni-Sepharose 25 objętościami kolumny buforem do przemywania (40 mM HEPES-KOH pH 7.4, 150 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2.5% (w/v) glicerolu, 20 mM imidazolu, 2 mM β-merkaptoetanolu), 5 objętościami kolumny buforem do przemywania z 1 M KCl w celu usunięcia zanieczyszczeń związanych elektrostatycznie z Hsp104 oraz 25 objętościami kolumny buforem do przemywania. Ni-Sepharose zbierać po każdym przemywaniu przez wirowanie przez 2 min w 4°C przy 2 000 rpm (wirówka Eppendorf 5810R). Po każdym cyklu przemywania i wirowania usunąć bufor za pomocą aspiratora.
  4. Aby eluować Hsp104, wymieszać Ni-Sepharose z 1 mL buforu do elucji (40 mM HEPES-KOH pH 7.4, 150 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2.5% (w/v) glicerolu, 350 mM imidazolu, 2 mM β-merkaptoetanolu) na każdy 1 mL Ni-Sepharose i obracać w 4°C przez 20 minut. Wysokie stężenie imidazolu rozrywa oddziaływanie między kuleczkami Ni a His6. Usunąć Ni-Sepharose za pomocą pustych kolumienek wirowych 1.2 mL (Bio-Rad) przez wirowanie przez 2 min w 4°C przy 2 000 rpm (wirówka Eppendorf 5810R). Odstawić 1 μL eluatu do analizy SDS-PAGE (eluat Ni na rys. 2). Na każdy litr komórek na tym etapie uzyskuje się ˜15 mg Hsp104.
  5. Przeprowadzić wymianę buforu eluatu na bufor Q (20 mM Tris-HCl pH 8, 0.5 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 50 mM NaCl) przy użyciu koncentratorów wirowych Amicon Ultra (Millipore) o MWCO 30 000 i pojemności 15 mL. Najpierw skoncentrować białko do ˜1.5 mL, a następnie dodać 14.5 mL buforu Q, aby rozcieńczyć białko 10-krotnie. Powtórzyć 3 razy w celu wymiany buforu. Podwyższone pH i niskie stężenie soli zapewniają wysoką ujemną ładunek Hsp104.
  6. Oczyścić Hsp104 za pomocą chromatografii wymiany anionowej, używając kolumny Resource Q 6 mL (GE) równoważonej buforem Q. Przed wstrzyknięciem białko przefiltrować przez filtr strzykawkowy Millex GP PES Membrane 0.22 μm (Millipore) o niskim wiązaniu białek. Stosujemy przepływ 1 mL/min. Wypłukać słabo wiążące białka 1 objętością kolumny 20% buforu Q+ (20 mM Tris-HCl pH 8, 0.5 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 1 M NaCl). Eluować Hsp104 gradientem liniowym (20%–50% buforu Q+) przez 5 objętości kolumny (rys. 3). Zbierać frakcje 1 mL. Hsp104 i większość wariantów eluuje zazwyczaj przy ˜400 mM NaCl (31 mS/cm). Odstawić próbki z frakcji szczytowych (1 μL) do analizy SDS-PAGE (rys. 3, wstawka).
  7. Aby usunąć znacznik His6, wymienić bufor białka za pomocą koncentratora wirowego Amicon, jak opisano powyżej (patrz krok 3.5), na bufor do cięcia (20 mM HEPES-KOH pH 7.4, 140 mM KCl i 10 mM MgCl2). Użyć proteazy proTEV (Promega) lub proteazy AcTEV (Invitrogen) zgodnie z instrukcją producenta. W przypadku Hsp104 stwierdziliśmy, że do pełnego cięcia wymagane są wyższe stosunki proteazy TEV do Hsp104. Stosujemy stosunek 1 jednostki proteazy na 12 μg Hsp104. Cięcie należy przeprowadzać w 30°C przez 2–4 godziny, a następnie inkubować przez 16 godzin w 4°C. Końcowe stężenie Hsp104 powinno wynosić od 20 do 75 μM monomeru. Usunąć wszelkie pozostałe Hsp104 ze znacznikiem His6 oraz proteazę TEV za pomocą Ni-Sepharose (GE), dodając Ni-Sepharose w nadmiarze w stosunku do ilości Hsp104 w reakcji cięcia (zakładając, że kulki mogą wiązać 15 mg białka na mL upakowanej żywicy). Usunąć kulki za pomocą pustych kolumienek wirowych (Bio-Rad), wirując przez 2 min przy 2 000 rpm w 4°C. Zebrać próbki przed i po cięciu (1 μL) do analizy SDS-PAGE, aby potwierdzić zajście cięcia oraz usunięcie niepociętego białka (rys. 4).
  8. Wymienić bufor na bufor do wykluczania wielkości (20 mM HEPES-KOH pH 7.4, 140 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT) przy użyciu Amicon Ultra (Millipore) MWCO 30 000, jak opisano w kroku 3.5.
  9. Dalej oczyszczać Hsp104 za pomocą chromatografii wykluczania wielkości. Użyć kolumny Superose 6 lub Superdex 200 (obie od GE) równoważonej buforem do wykluczania wielkości (rys. 5). Przed wstrzyknięciem białko przefiltrować przez filtr strzykawkowy Millex GP PES Membrane 0.22 μm (Millipore) o niskim wiązaniu białek. Dla ilości białka mniejszych niż 10 mg można użyć kolumn o rozmiarze 10/300 (24 mL) i zbierać frakcje 0.5 mL. Dla próbek powyżej 10 mg należy użyć kolumny o rozmiarze 12/60 (120 mL) i zbierać frakcje 1 mL. Prędkości przepływu i objętości próbek do nałożenia znajdują się w instrukcjach producenta. Po oczyszczeniu frakcje Hsp104 są łączone, jak pokazano na rys. 5, i zagęszczane w jednostkach koncentratora wirowego Amicon (Millipore) [Uwaga redakcyjna: Lektor w filmie błędnie podaje filtr strzykawkowy 0.22 μM (mikromolarny), podczas gdy w czasie 04:38 powinien podać filtr strzykawkowy 0.22 μm (mikrometr)]. Hsp104 przechowuje się zgodnie z poniższym opisem. Ze względu na straty materiału podczas oddzielania produktów degradacji Hsp104 i zanieczyszczeń, końcowa wydajność oczyszczonego Hsp104 o pełnej długości wynosi ˜1–3 mg na litr kultury początkowej.

4. Aktywność dysagregazy Hsp104

  1. Po oczyszczaniu dobrą praktyką jest ocena aktywności Hsp104 w teście dysagregacji. Zazwyczaj stosujemy test reaktywacji lucyferazy2 (Rys. 6). W tym teście Hsp104 we współpracy z systemem chaperonów Hsp70 (Hsp70 i Hsp40) dysagreguje agregaty lucyferazy świetlika zdenaturowane mocznikiem2. Rozpuszczalna lucyferaza katalizuje utlenianie lucyferyny do oksylucyferyny, co jest reakcją emitującą światło. Poprzez monitorowanie luminescencji można określić względną reaktywację, a tym samym stopień dysagregacji lucyferazy. Hsp104 musi być zdolne do synergistycznej współpracy z systemem kokaperonów Hsp70. Ilość odzyskanej luminescencji zależy od zastosowanej pary Hsp70:Hsp40. Rutynowo stosujemy Hsp72 i Hsp40 (Assay Designs). Co najmniej aktywna Hsp104 powinna spowodować 5-krotny wzrost reaktywacji lucyferazy w porównaniu do reaktywacji przez samo Hsp72:Hsp40 (Rys. 6). Preparaty Hsp104, które nie osiągają takiego poziomu aktywności, są odrzucane.

5. Przechowywanie Hsp104

  1. W przypadku przechowywania krótkoterminowego białko Hsp104 można trzymać w temperaturze 4°C w buforze do chromatografii wykluczania. Należy jednak pamiętać, że aktywność białka spadnie po 2-3 dniach w 4°C, a gwałtownie po 1 tygodniu w 4°C. W testach dysagregacji zaleca się stosowanie Hsp104 jak najszybciej po puryfikacji. W idealnym przypadku Hsp104 powinno zostać wykorzystane natychmiast do testów dysagregacji amyloidów.
  2. Jeśli białko musi być przechowywane długoterminowo, Hsp104 przekłada się do buforu do przechowywania (20mM HEPES-KOH pH 7.4, 140mM KCl, 10mM MgCl2, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 10% glicerolu (w/v)). Alikwoty o objętości 100μl są gwałtownie zamrażane w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80°C. Cykle zamrażania i rozmrażania drastycznie obniżają aktywność Hsp104, dlatego należy ich unikać. Zaleca się powolne rozmrażanie Hsp104 na lodzie. Aktywność dysagregazy amyloidowej gwałtownie spadnie po 1 miesiącu w temperaturze -80°C.

6. Reprezentatywne wyniki i rysunki:

Schemat procesu agregacji białek z udziałem Hsp104, Hsp70 i Hsp40, przedstawiający renaturację.
Rycina 1. Hsp104 jest bifunkcyjną dysagregazą. Dysagregacja nieuporządkowanych agregatów (pokazana po lewej stronie) wymaga współpracy systemu chaperonowego Hsp70 (Hsp70 i Hsp40)2. Hsp104 przebudowuje uporządkowane agregaty amyloidowe (pokazane po prawej stronie) bez pomocy Hsp70 i Hsp40 in vitro, jednak Hsp70 i Hsp40 mogą zwiększać aktywność Hsp104 przeciwko amyloidom26,28. W przypadku obu typów struktur agregacyjnych Hsp104 łączy hydrolizę ATP z translokacją substratu przez kanał centralny, aby promować dysagregację. Pętle porów zawierające tyrozynę wiążą substrat i transportują go przez kanał centralny49-52.

Wyniki elektroforezy żelowej SDS-PAGE przedstawiające proces oczyszczania białka z markerami masy cząsteczkowej.
Rycina 2. Analiza SDS-PAGE etapu oczyszczania powinowactwem na Ni-sepharose. Próbki lizatu, Ni Load, Ni FT oraz eluatu Ni zostały poddane frakcjonowaniu metodą SDS-PAGE przy użyciu żelu Criterion 4-20% Tris-HCl 1,0 mm (Bio-Rad) i zabarwione błękitem Coomassie. Należy zauważyć, że nie całe białko Hsp104 jest w stanie związać się z Ni-sepharose. Przedstawiono markery masy cząsteczkowej Broad Range (Bio-Rad) (lewa ścieżka).

Wykres chromatografii absorbancyjnej z układem do oczyszczania białek i wynikami elektroforezy.
Rycina 3. Oczyszczanie eluatu z Ni-sepharose na kolumnie Resource Q. Niebieska linia przedstawia absorbancję przy 280nm, a zielona linia przedstawia % buforu Q+ (maksimum 50%). Pierwszy pik, eluujący przy 20% Q+, zawiera zanieczyszczenia, produkty degradacji oraz nieprawidłowo sfałdowane białko Hsp104. Drugi i główny pik zawiera prawidłowo sfałdowane i aktywne białko Hsp104. Szybkość przepływu wynosiła 1ml/min. Gradient od 20-50% Q+ trwa 30 minut lub 5 objętości kolumny. Wstawka: frakcje pików zostały rozdzielone za pomocą analizy SDS-PAGE z użyciem żelu Criterion 4-20% Tris-HCl 1,0mm (Bio-Rad) i zabarwione Coomassie. Po lewej stronie pokazano markery masy cząsteczkowej Broad Range (Bio-Rad).

Wynik elektroforezy białek SDS-PAGE, marker MW, analiza przed i po cięciu, kDa.
Rycina 4. Analiza SDS-PAGE etapu cięcia proteazą proTEV. His6-Hsp104 z oczyszczania Zasobu Q poddano działaniu proteazy proTEV przez 4 godziny w 30°C, a następnie przez 16 godzin w 4°C. Próbki rozdzielono metodą SDS-PAGE przy użyciu żelu Criterion 4-20% Tris-HCl 1,0 mm (Bio-Rad) i zabarwiono Coomassie. Należy zauważyć, że cięte przez proTEV białko Hsp104 migruje szybciej. Proteaza TEV oraz niecięte białko Hsp104 zostały usunięte za pomocą Ni-Sepharose, zgodnie z opisem w kroku 3.7. Po lewej stronie przedstawiono markery masy cząsteczkowej Broad Range (Bio-Rad).

Wykres chromatografii oczyszczania białka; absorbancja względem objętości; wstawka z elektroforezą żelową.
Rysunek 5. Oczyszczanie Hsp104 metodą wykluczania rozmiarów. Rozcięte białko Hsp104 poddano dalszemu oczyszczaniu na kolumnie do filtracji żelowej Superose 6 (10/300, GE). Szybkość przepływu = 0.4ml/min. Pik między liniami przerywanymi reprezentuje połączone frakcje. Wstawka: frakcje piku rozdzielono za pomocą analizy SDS-PAGE przy użyciu żelu Criterion 4-20% Tris-HCl 1.0mm (Bio-Rad) z barwieniem Coomassie. Po lewej stronie przedstawiono markery masy cząsteczkowej Broad Range (Bio-Rad).

Wykres słupkowy porównujący luminescencję dla Hsp40/Hsp72, Hsp104 oraz Hsp104 i Hsp40/Hsp72.
Rysunek 6. Test reaktywacji lucyferazy. Zdenaturowane agregaty lucyferazy świetlika (50nM) inkubowano przez 90min w 25°C z Hsp72 i Hsp40 (1μM) (oba od Assay Designs), Hsp104 (6μM monomeru) lub Hsp104, Hsp72 i Hsp40. Zdenaturowana lucyferaza ulega pełnej reaktywacji jedynie w obecności zarówno Hsp104, jak i Hsp40/Hsp72. Przywróconą luminescencję mierzono za pomocą czytnika płytek Infinite M1000 (Tecan). Wartości przedstawiają średnie±SEM (n=3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Harmonogram: Aby uzyskać maksymalną aktywność Hsp104, zaleca się, aby cały schemat oczyszczania został zrealizowany tak szybko, jak to możliwe. Jednak liczba etapów oczyszczania tworzy wymagający harmonogram, który nie zawsze może być praktyczny. Jeśli etapy oczyszczania są przeprowadzane tak szybko, jak to możliwe, czas od zakończenia nocnej ekspresji do 2-4 godzin inkubacji w 30°C z proteazą TEV wynosi około 9-11 godzin. Jednym z potencjalnych miejsc na przerwę jest czas po etapie cięcia przez TEV. W razie absol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez grant z NIH (5T32GM008275-22) oraz stypendium przeddoktoranckie American Heart Association (dla E.A.S.); stypendium Chemistry-Biology Interface Fellowship z NIH (2T32GM071339-06A1) (dla M.E.D.); oraz granty z NIH (1DP2OD002177-01 i NS067354-0110), The Ellison Medical Foundation oraz The Bill and Melinda Gates Foundation (dla J.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki kompetentne BL21-CodonPlus-RILStratagene, Agilent Technologies230255
pożywka 2XYTUSB Corp., Affymetrix75864
Tabletki z kompletnym, mini, bez-EDTA inhibitorem proteazRoche Group1836170
Pepstatyna ASigma-AldrichP4265
Ni-Sepharose 6 Fast FlowGE Healthcare17-5318-02
Odśrodkowe jednostki filtrujące Amicon Ultra-15 (MWCO 30,000)EMD MilliporeUFC903008
Kolumna Resource Q - 6mlGE Healthcare17-1179-01
Proteaza proTEVPromega Corp.V6052
Proteaza AcTEVInvitrogen12575015
Superose 6 10/300 GLGE Healthcare17-5172-01
Hsp40Assay DesignsSPP-400
Hsp72Assay DesignsADI-NSP-555

Bibliografia

  1. Erzberger, J. P., Berger, J. M. Evolutionary relationships and structural mechanisms of AAA+ proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 93-114 (2006).
  2. Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: A Novel Chaperone System that Rescues Previously Aggregated Proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
  3. Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
  4. Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88, 1-13 (2010).
  5. Parsell, D. A., Sanchez, Y., Stitzel, J. D., Lindquist, S. Hsp104 is a highly conserved protein with two essential nucleotide-binding sites. Nature. 353, 270-273 (1991).
  6. Doyle, S. M., Wickner, S. Hsp104 and ClpB: protein disaggregating machines. Trends Biochem Sci. 34, 40-48 (2009).
  7. Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16, 63-74 (2008).
  8. Glover, J. R., Lum, R. Remodeling of protein aggregates by Hsp104. Protein Pept Lett. 16, 587-597 (2009).
  9. Mogk, A., Haslberger, T., Tessarz, P., Bukau, B. Common and specific mechanisms of AAA+ proteins involved in protein quality control. Biochem Soc Trans. 36, 120-125 (2008).
  10. Grimminger-Marquardt, V., Lashuel, H. A. Structure and function of the molecular chaperone Hsp104 from yeast. Biopolymers. 93, 252-276 (2010).
  11. Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248, 1112-1115 (1990).
  12. Sanchez, Y., Taulien, J., Borkovich, K. A., Lindquist, S. Hsp104 is required for tolerance to many forms of stress. Embo J. 11, 2357-2364 (1992).
  13. Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137, 146-158 (2009).
  14. Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20, 125-1233 (2010).
  15. Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6, 435-450 (2005).
  16. True, H. L., Berlin, I., Lindquist, S. L. Epigenetic regulation of translation reveals hidden genetic variation to produce complex traits. Nature. 431, 184-187 (2004).
  17. True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407, 477-483 (2000).
  18. Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6, e294-e294 (2008).
  19. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268, 880-884 (1995).
  20. Halfmann, R., Lindquist, S. Epigenetics in the extreme: prions and the inheritance of environmentally acquired traits. Science. 330, 629-632 (2010).
  21. Satpute-Krishnan, P., Langseth, S. X., Serio, T. R. Hsp104-dependent remodeling of prion complexes mediates protein-only inheritance. PLoS Biol. 5, e24-e24 (2007).
  22. Sweeny, E. A., Shorter, J. Prion proteostasis: Hsp104 meets its supporting cast. Prion. 2, 135-140 (2008).
  23. Lo Bianco, C. Hsp104 antagonizes alpha-synuclein aggregation and reduces dopaminergic degeneration in a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 118, 3087-3097 (2008).
  24. Narayanan, S., Walter, S., Reif, B. Yeast prion-protein, sup35, fibril formation proceeds by addition and substraction of oligomers. Chembiochem. 7, 757-765 (2006).
  25. Savistchenko, J., Krzewska, J., Fay, N., Melki, R. Molecular chaperones and the assembly of the prion Ure2p in vitro. J Biol Chem. 283, 15732-15739 (2008).
  26. Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304, 1793-1797 (2004).
  27. Shorter, J., Lindquist, S. Destruction or potentiation of different prions catalyzed by similar Hsp104 remodeling activities. Mol Cell. 23, 425-438 (2006).
  28. Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70 and Hsp40 interplay regulates formation, growth and elimination of Sup35 prions. Embo J. 27, 2712-2724 (2008).
  29. Doyle, S. M. Asymmetric deceleration of ClpB or Hsp104 ATPase activity unleashes protein-remodeling activity. Nat Struct Mol Biol. 14, 114-122 (2007).
  30. Wendler, P. Atypical AAA+ subunit packing creates an expanded cavity for disaggregation by the protein-remodeling factor Hsp104. Cell. 131, 1366-1377 (2007).
  31. Hinault, M. P. Stable alpha-synuclein oligomers strongly inhibit chaperone activity of the Hsp70 system by weak interactions with J-domain co-chaperones. J Biol Chem. 285, 38173-38182 (2010).
  32. Tipton, K. A., Verges, K. J., Weissman, J. S. In vivo monitoring of the prion replication cycle reveals a critical role for Sis1 in delivering substrates to Hsp104. Mol Cell. 32, 584-591 (2008).
  33. Bieschke, J., Cohen, E., Murray, A., Dillin, A., Kelly, J. W. A kinetic assessment of the C. elegans amyloid disaggregation activity enables uncoupling of disassembly and proteolysis. Protein Sci1. 8, 2231-2241 (2009).
  34. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313, 1604-1610 (2006).
  35. Cohen, E. Reduced IGF-1 signaling delays age-associated proteotoxicity in mice. Cell. 139, 1157-1169 (2009).
  36. Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 23, 1191-11201 (2010).
  37. Carmichael, J. Bacterial and yeast chaperones reduce both aggregate formation and cell death in mammalian cell models of Huntington's disease. Proc Natl Acad Sci. 97, 9701-9705 (2000).
  38. Vacher, C., Garcia-Oroz, L., Rubinsztein, D. C. Overexpression of yeast hsp104 reduces polyglutamine aggregation and prolongs survival of a transgenic mouse model of Huntington's disease. Hum Mol Genet. 14, 3425-3433 (2005).
  39. Liu, Y. H. Heat Shock Protein 104 Inhibited the Fibrillization of Prion Peptide 106-126 and Disassembled Prion peptide 106-126 Fibrils in vitro. Int J Biochem Cell Biol. , (2011).
  40. Wendler, P., Saibil, H. R. Cryo electron microscopy structures of Hsp100 proteins: crowbars in or out. Biochem Cell Biol. 88, 89-96 (2010).
  41. Wendler, P. Motor mechanism for protein threading through Hsp104. Mol Cell. 34, 81-92 (2009).
  42. Lee, S., Sielaff, B., Lee, J., Tsai, F. T. CryoEM structure of Hsp104 and its mechanistic implication for protein disaggregation. Proc Natl Acad Sci. 107, 8135-8140 (2010).
  43. Parsell, D. A., Kowal, A. S., Lindquist, S. Saccharomyces cerevisiae Hsp104 protein. Purification and characterization of ATP-induced structural changes. J Biol Chem. 269, 4480-4487 (1994).
  44. Schirmer, E. C., Queitsch, C., Kowal, A. S., Parsell, D. A., Lindquist, S. The ATPase activity of Hsp104, effects of environmental conditions and mutations. J Biol Chem. 273, 15546-15552 (1998).
  45. Schirmer, E. C., Ware, D. M., Queitsch, C., Kowal, A. S., Lindquist, S. L. Subunit interactions influence the biochemical and biological properties of Hsp104. Proc Natl Acad Sci. 98, 914-919 (2001).
  46. Hattendorf, D. A., Lindquist, S. L. Cooperative kinetics of both Hsp104 ATPase domains and interdomain communication revealed by AAA sensor-1 mutants. EMBO J. 21, 12-21 (2002).
  47. Schirmer, E. C., Lindquist, S. Purification and properties of Hsp104 from yeast. Methods Enzymol. 290, 430-444 (1998).
  48. Hattendorf, D. A., Lindquist, S. L. Analysis of the AAA sensor-2 motif in the C-terminal ATPase domain of Hsp104 with a site-specific fluorescent probe of nucleotide binding. Proc Natl Acad Sci. 99, 2732-2737 (2002).
  49. Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J Biol Chem. 283, 30139-30150 (2008).
  50. Lum, R., Tkach, J. M., Vierling, E., Glover, J. R. Evidence for an unfolding/threading mechanism for protein disaggregation by Saccharomyces cerevisiae Hsp104. J Biol Chem. 279, 29139-29146 (2004).
  51. Tessarz, P., Mogk, A., Bukau, B. Substrate threading through the central pore of the Hsp104 chaperone as a common mechanism for protein disaggregation and prion propagation. Mol Microbiol. 68, 87-97 (2008).
  52. Weibezahn, J. Thermotolerance requires refolding of aggregated proteins by substrate translocation through the central pore of ClpB. Cell. 119, 653-665 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie Hsp104znacznik powinowactwa histydynowegochromatografia wymiany jonowejfiltracja żelowatest reaktywacji lucyferazycięcie proteazą TEVekspresja w E. coliwymiana anionowawykluczanie wielkościowe
Oczyszczanie Hsp104, białkowej dysagregazy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.