Opisujemy metodę in vitro hodowli schistosomul pasożytniczego płazińca Schistosoma mansoni, polegającą na pozyskiwaniu i transformacji zakaźnych cerkariów z pośredniego żywiciela – słodkowodnego ślimaka Biomphalaria glabrata.
Artykuł metodologiczny
Transformacja cerkarii i hodowla in vitro schistosomul Schistosoma mansoni
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pasożyty z rodzaju Schistosoma są czynnikami etiologicznymi schistosomatozy, przewlekłej, wyniszczającej choroby, która dotyka ponad 200 milionów ludzi na całym świecie i zajmuje drugie miejsce po malarii wśród chorób pasożytniczych pod względem wpływu na zdrowie publiczne i sytuację społeczno-ekonomiczną (1-4). Schistosomy są przywrami o złożonym cyklu życiowym, który obejmuje fazy pasożytnicze w organizmach mięczaków i ssaków, przedzielone wolno pływającymi stadiami pośrednimi. W skrócie, wolno pływające cerkarie zakażają gospodarza ssaka poprzez penetrację skóry przy pomocy wydzielanych proteaz; w tym czasie cerkarie tracą ogony, przekształcając się w schistosomule. Schistosomule muszą teraz uniknąć odpowiedzi układu odpornościowego gospodarza, wykształcić jelito do trawienia erytrocytów i migrować przez płuca oraz krążenie wrotne do miejsca docelowego w układzie wrotnym wątroby, a ostatecznie do żył krezkowych (w przypadku S. mansoni), gdzie robaki samce i samice łączą się w pary i rozmnażają, produkując codziennie setki jaj. Część jaj jest wydalana z organizmu do słodkiej wody, gdzie wykluwają się z nich wolno pływające miracidia (5-10). Miracidia zakażają określone gatunki ślimaków i przekształcają się w sporocysty macierzyste i potomne, które z kolei produkują zakaźne cerkarie, zamykając cykl życiowy. Niestety, całego cyklu życiowego schistosomów nie można hodować in vitro, ale zakaźne cerkarie mogą zostać przekształcone w schistosomule, a schistosomule mogą być hodowane przez wiele tygodni w celu analizy rozwoju schistosomów in vitro lub analizy mikromacierzy. W niniejszym protokole przedstawiamy wizualny opis transformacji cerkarii oraz hodowli schistosomul in vitro. Uzyskujemy zakaźne cerkarie z gospodarza ślimaka Biomphalaria glabrata i ręcznie przekształcamy je w schistosomule poprzez oddzielenie ogonów za pomocą emulsyjnej igły dwustronnej. Opisane techniki transformacji cerkarii in vitro oraz hodowli schistosomul pozwalają uniknąć wykorzystania gospodarza ssaka, co upraszcza wizualizację schistosomów i ułatwia pobieranie pasożytów do analizy eksperymentalnej. Techniki transformacji i hodowli schistosomów in vitro są stosowane od lat (11, 12), jednak nie opracowano protokołów wizualnych, które byłyby dostępne dla całej społeczności naukowej.
Protokół
Środki bezpieczeństwa:
Cerkarie schystosomów mogą bezpośrednio przenikać przez skórę, nie wymagając do tego skaleczeń ani porów, wywołując przewlekłą chorobę – schistosomozę. S. mansoni jest organizmem o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2), dlatego podczas pracy z zakaźnymi cerkariami należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej oraz właściwe środki bezpieczeństwa. Większość sprzętu niezbędnego do hodowli i transformacji schystosomów jest standardowa, z wyjątkiem kilku kluczowych pozycji wymienionych w tabeli na końcu protokołu. Wszystkie prace z cerkariami powinny być prowadzone w oddzielnym pomieszczeniu. Schystosomule należy hodować w sterylnym, zatwierdzonym dygestorium biologicznym. Należy nosić dwie warstwy rękawiczek nitrylowych lub lateksowych, fartuch laboratoryjny, wodoodporne obuwie, spodnie bez dziur ani rozdarć oraz wodoodporne osłony na nadgarstki i przedramiona. W przypadku przypadkowego rozlania substancji, należy natychmiast spryskać skażony obszar 70% etanolem lub 10% wybielaczem, intensywnie pocierając, jeśli substancja dostanie się na ciało. Będzie to wystarczające do unieszkodliwienia pasożyta, jednak wszystkie możliwe zakażenia powinny zostać zgłoszone i potraktowane poważnie. Chociaż schystosomule nie są z natury zakaźne, wytyczne instytucjonalne mogą się różnić, dlatego należy je sprawdzić, aby ustalić, czy środki ostrożności BSL2 są wymagane podczas niezakaźnych etapów cyklu życiowego. Po zakończeniu eksperymentu należy zdezynfekować wszystkie powierzchnie, które miały kontakt z jakąkolwiek potencjalnie zakaźną substancją, a odpady zutylizować w zatwierdzonym pojemniku na odpady biologiczne.
UWAGA: Przykryć pojemniki z gospodarzami (ślimakami) od 1 do 2 dni przed zrzuceniem i chronić przed światłem
1. Pozyskiwanie cerkarii z gospodarza ślimaka
- Napełnij czysty zlewka o pojemności 500mL, wolny od detergentów, do połowy wodą destylowaną wyrównaną do temperatury pokojowej. Jeśli pracuje się z ślimakami gospodarzami zainfekowanymi miracidiami w różnych terminach, należy użyć osobnego zlewka dla każdej daty infekcji (jest to szczególnie istotne, jeśli ślimaki mają być ponownie wykorzystane w przyszłych eksperymentach). Rozmiar zlewka może być mniejszy, w zależności od doświadczenia użytkownika.
- Zabierz zainfekowane ślimaki gospodarzy, z których chcesz uzyskać uwalnianie, i ostrożnie umieść je w zlewce, używając standardowego siatkowego łapaka akwariowego i pęsety ogólnego przeznaczenia w razie potrzeby.
- Umieść zlewkę na tacy ociekowej przeciwrozlewowej w odległości około 8 do 12 cali poniżej żarowego źródła światła. Pozostaw na 1-2 godziny pod światłem. Cercarie opuszczają ślimaka gospodarza po wystawieniu na jasne światło.
- Ostrożnie odfiltruj ślimaki z mieszaniny cercarii. Zachowaj szczególne środki ostrożności, ponieważ mieszanina jest silnie zakaźna. Pamiętaj, że cercarie mogą bezpośrednio przenikać przez ludzką skórę!
- Umieść mieszaninę ponownie pod źródłem światła na około 15 minut, aby pozwolić na osadzenie się wszelkich cząsteczkowych zanieczyszczeń.
- Przenieś cercarie do czystej kolby Erlenmeyera za pomocą pipety, unikając pobierania osadu z dna zlewki. Umieść kolbę pod kątem około 45° w lodzie i w ciemności na 45 - 60 minut, aby cercarie osiadły w jednym rogu.
- Za pomocą pipety 50 mL usuń od 75 do 90% nadsączu i przelej go do zlewki zawierającej 10% wybielacz lub 70% etanol, dbając o to, aby krople wody zawierające cercarie nie kapały z pipety.
- Delikatnie zakręć kolbą Erlenmeyera z cercariami, aby resuspendować je w roztworze. Użyj pipety, aby przenieść próbkę do sterylnych stożkowych probówek 50 ml. Ponownie umieść probówki w lodzie na 20 minut w ciemności. W ciemności cercarie osadzą się w stronę dna probówki.
2. Ręczna transformacja cerkarii do postaci schistosomul
Przed rozpoczęciem: Przygotować pełne pożywkę RPMI 1640 (RPMI, 5% płodowej surowicy bydlęcej, 1X Pen/Strep) i ogrzać do 37°C. (Kluczowe jest, aby użyta płodowa surowica bydlęca została inaktywowana poprzez inkubację w temperaturze 56°C przez 1 godzinę, ponieważ schistosomy mogą być wrażliwe na dopełniacz).
- W komorze z laminarnym przepływem powietrza (biohazard hood), usuń nadmiar nadosadu za pomocą pipety lub pompy próżniowej, pozostawiając od 5 do 10 ml roztworu w każdej probówce stożkowej o pojemności 50 ml.
- Do strzykawki o odpowiedniej pojemności przymocuj obustronną igłę emulgacyjną luer lok o rozmiarze 22 gauge.
- Powoli nabierz mieszaninę do strzykawki. Zbierz cerkarie ze wszystkich probówek 50 ml do jednej strzykawki. Zwróć uwagę, aby roztwór nie kapał.
- Ostrożnie obróć strzykawkę tak, aby wolny koniec igły był skierowany do góry. Do tego końca igły emulgacyjnej przymocuj drugą strzykawkę.
- Przepuść mieszaninę przez igłę łącznie 40 razy (20 razy w obie strony), aby przekształcić cerkarie.
- Ustaw strzykawki pionowo tak, aby mieszanina znajdowała się w dolnej strzykawce, a górna była pusta. Zdejmij górną strzykawkę i zdezynfekuj ją w 70% Ethanol.
- Przelewaj mieszaninę kropla po kropli do czystej, wysokiej szalki Pyrex o wymiarach 100mm x 50mm lub naczynia krystalizacyjnego. Zdezynfekuj igłę i strzykawkę w 70% Ethanol.
- Dodaj podgrzane do 37°C kompletne medium RPMI 1640 w ilości takiej, aby dno szalki Petri było całkowicie pokryte, analogicznie do przygotowywania szalek z pożywką Luria broth.
- Delikatnie zakręć zawartością, aby zgromadzić schistosomule w centrum szalki Petri. Unikaj rozbryzgów.
Uwaga: Na tym etapie może być pomocne wyłączenie oświetlenia komory, aby lepiej zwizualizować schistosomule w centrum. - Natychmiast przenieś skoncentrowane schistosomule do dołka nowej 12-dołkowej płytki hodowlanej za pomocą sterylnego zakraplacza.
- Powtarzaj kroki 2.9 i 2.10 do czasu, aż w centrum szalki nie będzie już obecnych schistosomule (około 10 razy). Każdą kolejną porcję przenoś do nowego dołka.
- Wypełnij każdy dołek do połowy (˜1.5 mL) uprzednio ogrzanym kompletnym medium RPMI.
- Zweryfikuj obecność schistosomule oraz brak cerkarii za pomocą mikroskopu odwróconego.
- Hoduj schistosomule w inkubatorze CO2 ustawionym na 37°C i 5% CO2.
3. Reprezentatywne wyniki:
Przed przeniesieniem przekształconych schistosomul do pożywki hodowlanej, obserwacja pod odwróconym mikroskopem w polu jasnym (przykład znajduje się w tabeli sprzętu) powinna pozwolić na uzyskanie obrazu podobnego do Ryciny 1, na którym w dołku znajdują się wyłącznie przekształcone schistosomule. Potencjalne zanieczyszczenia mogą obejmować nieuszkodzone cerkarie, odcięte ogony cerkarii lub inne zanieczyszczenia. W przypadku braku mikroskopu odwróconego, do wizualizacji schistosomul wystarczy standardowy mikroskop lub nawet stereomikroskop sekcyjny. Należy pamiętać, że procedura ta nie zawsze prowadzi do przekształcenia 100% cerkarii.
Rysunek 1: Przekształcone schistosomulum
Rycina 2: Cerkarie i odcięte ogony
Dyskusja
Podczas procedury transformacji mogą wystąpić liczne potencjalne problemy, jednak niniejszy protokół został opracowany tak, aby uniknąć większości z nich. Jednym z potencjalnych zagrożeń jest zapchanie igły emulgującej, co zazwyczaj wynika z obecności zanieczyszczeń pozostałych po zbiorach w kroku 1.3. Aby uniknąć tego problemu, należy upewnić się, że w kroku 1.5 wszystkie cząstki stałe opadły na dno, a w kroku 1.6 ostrożnie przenieść cerkarie. Ponadto, zgodnie z wcześniejszym opisem, zaleca się pracę w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosowanie środków ochrony osobistej (w tym przyłbic) oraz unikanie wywierania nadmiernego nacisku na strzykawki.
Odseparowane ogony cerkarii można zaobserwować w medium, co świadczy o niewłaściwej separacji podczas kroku 2.9. Ogony wykazują ruchy przypominające skurcze i mają charakterystyczny kształt (patrz Rycina 2), dzięki czemu można je łatwo odróżnić od schistosomulów. Ogony można usunąć, przemywając schistosomule nadmiarem pełnego medium RPMI i pozwalając im opaść na dno. Ogony pozostaną na powierzchni i mogą zostać odessane.
Jeśli w medium znajdują się nienaruszone cerkarie, oznacza to, że transformacja z kroku 2.5 nie została wykonana prawidłowo. Obraz nienaruszonej cerkarii przedstawiono w Rysunku 3b w celu odniesienia. W przypadku wystąpienia tego problemu należy upewnić się, że używana igła do emulgowania ma odpowiedni rozmiar. Można również zwiększyć liczbę przejść mieszaniny cerkarii przez igłę, choć 40 powtórzeń jest zazwyczaj znacznie więcej niż wystarczy, aby osiągnąć niemal 100% odcięcie ogonów cerkarii.
Przemiana cerkariów w schistosomule została po raz pierwszy opisana w 1974 roku przez Colleya i Wikela (13). Od tego czasu przygotowywanie schistosomul odbywało się albo za pomocą strategii ścinania z użyciem igły i strzykawki, zgodnie z opisem w niniejszym protokole, albo przy użyciu metody wirowania w wstrząsarku (vortex) z późniejszym rozdzielaniem za pomocą gradientów percoll (14, 15) lub poprzez mieszanie wirowe, jak pokazano w niniejszej pracy. Te dwie techniki przygotowywania schistosomul zostały szczegółowo opisane przez Freda Lewisa (16), a więcej informacji na temat dalszej hodowli schistosomul w celu długoterminowego wzrostu można znaleźć w NIAID Schistosome Resource Center (www.schisto-resource.org).
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Projekt ten został sfinansowany ze środków startowych Case Western Reserve University przyznanych E. Jolly. Zainfekowane ślimaki zostały udostępnione przez Schistosome Resource Center, NIH-NIAID (kontrakt NIAID nr HHSN272201000009I). Dziękujemy również Chrisowi Kingowi i Ronaldowi Blantonowi za wsparcie w pozyskaniu zainfekowanych ślimaków z przywrą oraz za pomocne dyskusje.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Igła emulsyjna 22g x 2-7/8" | Fisher Scientific | 14-825-17G | |
| Pożywka RPMI 1640 1X (500ml) | Invitrogen | 11835030 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) inaktywowana ciepłem | Invitrogen | 10082139 | |
| Penicylina/Streptomycyna (100X) | Invitrogen | 15070063 | |
| Szalka krystalizacyjna (100mm) | Fisher Scientific | 08-741D | |
| Pęseta ogólnego przeznaczenia | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Siatka akwariowa Petco do artemii | Petco | SKU:1190954 |
Bibliografia
- Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M. Schistosomiasis. N Engl J Med. 346, 1212-1220 (2002).
- Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk. Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).
- Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis. Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).
- King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis. Lancet. 365, 1561-159 (2005).
- Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology. 124, 153-167 (2002).
- Grabe, K., Haas, W. Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration. Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).
- Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni. J Parasitol. 58, 476-480 (1972).
- Saladin, K. S. Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes. J Parasitol. 68, 120-124 (1982).
- Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum. Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).
- Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes. PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing. J Parasitol. 67, 179-185 (1981).
- Yoshino, T. P. &, Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J Parasitol. 81, 714-722 (1995).
- Colley, D. G., Wikel, S. K. Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules. Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).
- Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll. Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).
- Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules. Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).
- Lewis, F. Schistosomiasis. Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).
Przedruki i uprawnienia
