Przeszczep komórek prekursorowych interneuronów do mózgu szczeniaka myszy

Streszczenie

Źródło: Quattrocolo, G., et al. Homochroniczne przeszczepianie prekursorów interneuronów do wczesnych postnatalnych mózgów myszy. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje przeszczep komórek prekursorowych interneuronów do mózgu nowonarodzonego myszy przy użyciu podejścia homotopowego lub heterotopowego. Procedura polega na zabezpieczeniu znieczulonego szczeniaka biorcy, zidentyfikowaniu docelowego obszaru mózgu i wstrzyknięciu zawiesiny komórek prekursorowych pochodzących od szczeniaka dawcy na tym samym etapie rozwoju. Po wstrzyknięciu młode jest przenoszone do podkładki rozgrzewającej w celu regeneracji, co pozwala na późniejszą ocenę przeżycia i dojrzewania komórek dawcy.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Usunięcie mózgu myszy P0-P2

1. Tuż przed rozpoczęciem zabiegu napełnij kilka szalek Petriego schłodzonym, karbokoksydowanym sacharozowym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (sACSF). Napełnij również probówkę (probówki) zbiorczą ~25 ml sACSF.
2. Zawiń szczenię w dniu poporodowym od 0 do 2 (P0-P2) w parafilm lub rękawiczkę i umieść je dobrze przykryte pod lodem. Ustaw minutnik na 5 minut i uruchom go. Po tym czasie wyjmij szczeniaka i sprawdź, czy nie reaguje na szczypanie tylnej łapy.
3. Odetnij głowę szczeniakowi i zbierz głowę na szalkę Petriego wypełnioną sACSF. Przetnij skórę wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić czaszkę.
4. Zlokalizuj otwór w czaszce w tyłomózgowiu/rdzeniu kręgowym i włóż jeden koniec kleszczy wzdłuż grzbietowej części czaszki. Delikatnie chwyć czaszkę na linii środkowej i "oderwij" kawałki z boku, aby odsłonić mózg, uważając, aby nie uszkodzić mózgu.
5. Po usunięciu grzbietowej i bocznej części czaszki użyj kleszczy lub szpatułki, aby delikatnie usunąć mózg z czaszki, zgarniając pod brzuszną powierzchnię mózgu, starając się nie uszkodzić żadnego obszaru. Umieść mózg na innej szalce Petriego wypełnionej karpogenowanym sACSF. nuta: Przedstawiamy dwie różne strategie preparowania hipokampa, prążkowia i kory mózgowej. Pierwsza strategia (kroki 2.1-2.10) jest przydatna dla każdej linii myszy, podczas gdy druga strategia (kroki 3.1-3.7) wymagałaby fluorescencyjnej myszy reporterowej, aby czysto oddzielić prążkowie od gałki bladej i innych struktur mózgu. Jeśli prążkowie nie jest pożądane, zignoruj specyficzne dla prążkowia części tych dwóch technik

2. Żniwa Pążkowia, Hipokampa i Kory Mózgowej, Technika #1

1. Umieść cały mózg na formie matrycy do cięcia, brzuszną stroną do góry. Umieść 1 żyletkę przez najbardziej przednią część mózgu (przez przedni przewód węchowy).
2. Włóż kolejną żyletkę tuż za pierwszą, aby wygenerować plasterek o grubości 0,5 mm i umieść dodatkową żyletkę za tą.
3. Przenieś te plastry na szalkę Petriego z karbotlenowym sACSF i umieść resztę mózgu w osobnym naczyniu z sACSF. Przenieś plasterki prążkowia do zakresu preparacyjnego, aby uwidocznić prążkowie. Plastry te powinny zawierać duże części przedniego prążkowia i nie powinny być pozbawione hipokampa. Użyj fluorescencyjnej lunety sekcyjnej z Nkx2.1-Cre^+/-; Plastry Ai9 ^+/- w celu odróżnienia słabego sygnału tdTomato prążkowia od silnego sygnału tdTomato gałki bladej.
4. Z fluorescencją lub bez, uszczypnij prążkowie z obu półkul na wszystkich odcinkach i przenieś kawałki prążkowia do odpowiednio oznakowanej probówki 50 ml z sACSF, przechowuj na lodzie.
5. Wytnij mózg wzdłuż linii środkowej za pomocą kleszczy lub żyletki i połóż półkulę tak, aby powierzchnia przyśrodkowa była skierowana do góry.
6. Usuń brzuszną tkankę mózgową (wzgórze, zwoje podstawy itp.), Ściskając tę tkankę kleszczami. Po zakończeniu hipokamp (struktura w kształcie kiełbasy obejmująca oś przednio-tylną wzdłuż kory grzbietowej) i komorowa strona kory powinny być wyraźnie widoczne.
7. Aby usunąć hipokamp, włóż końcówki kleszczy przed przednim hipokampem i delikatnie oddziel hipokamp od kory, przesuwając kleszcze do tyłu i ściskając wzdłuż granicy hipokampowo-korowej. Przenieś izolowany hipokamp do odpowiednio oznakowanej probówki o pojemności 50 ml z sACSF, przechowuj na lodzie.
8. Aby wypreparować korę, umieść półwyciętą korę przyśrodkową do dołu. Następnie użyj kleszczy, aby uszczypnąć najbardziej grzbietową, brzuszną, przednią i tylną część kory, aby pozostawić kwadratowy fragment przyśrodkowej kory somatosensorycznej, ~2 mm x 2 mm. W razie potrzeby odwróć korę tak, aby strona przyśrodkowa była skierowana do góry i oczyszczona z nadmiaru tkanki niekorowej (wzgórze, zwoje podstawy itp.) na powierzchni przyśrodkowej. Przenieś kawałek kory mózgowej do odpowiednio oznakowanej probówki o pojemności 50 ml z sACSF, przechowuj na lodzie.
9. Powtórz procedurę z drugą półkulą, aby zebrać zarówno hipokampy, jak i obszary kory.
10. Powtórz tę procedurę dla wszystkich szczeniąt, upewniając się, że sACSF został wymieniony na szalkach Petriego między szczeniętami, aby upewnić się, że sACSF pozostaje zimny i świeży.

3. Żniwa prążkowia, hipokampa i kory mózgowej, Technika # 2

1. Umieść mózg brzuszną stroną do dołu na pokrytej sylgardem szalce Petriego zawierającej sACSF i przypnij ją przez móżdżek i korę przednią lub opuszki węchowe.
2. Zaczynając od jednej półkuli, użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie oddzielić tylną korę od leżącego poniżej hipokampa i innych tkanek. Delikatnie połóż obraną korę płasko na szalce Petriego. Powtórz dla drugiej półkuli. Hipokamp i prążkowie powinny być wyraźnie widoczne w odsłoniętym mózgu.
3. Użyj kleszczy, aby uszczypnąć jeden hipokamp w linii środkowej i obierz hipokamp na boki, aby usunąć. Umieścić w fiolce zbiorczej na lodzie i powtórzyć z innymi hipokampami.
4. W przypadku prążkowia delikatnie zeskrob krawędzie prążkowia, aby poluzować je z otaczającej tkanki. Następnie usuń prążkowie, ściskając je od spodu i dodaj do probówki zbiorczej na lodzie. Powtórz dla drugiego prążkowia.
5. Skrawki kory mózgowej można pobrać zgodnie z opisem w kroku 2.8.
6. W przypadku korzystania z transgenicznej linii myszy reporterowej (np. Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP itp.), przenieść prążkowie na szalkę Petriego za pomocą sACSF i obejrzeć pod fluorescencyjną lunetą sekcyjną. Użyj kleszczy, aby usunąć jakąkolwiek tkankę nieprążkowiową z prążkowia (w Nkx2.1-Cre; Myszy Ai9 usuwają całą "jasną" tkankę, ponieważ gałka blada ma znacznie wyższą wyniosłość przyśrodkowego zwoju lub gęstość komórek pochodzącą z MGE, tdTomato+ w porównaniu z prążkowiem). Powtórz dla całego prążkowia.
7. Powtórz tę procedurę dla wszystkich szczeniąt, upewniając się, że sACSF został wymieniony na szalkach Petriego między szczeniętami, aby upewnić się, że sACSF pozostaje zimny i świeży.

4. Generowanie dysocjacji pojedynczych komórek

1. Po zakończeniu sekcji przygotuj 1 mg/ml roztworu pronazy, ważąc 10 mg pronazy i rozpuszczając w 10 ml karbotleniowanego sACSF.
2. Przenieść tkankę z fiolek zbiorczych o pojemności 50 ml do probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml zawierających 2 ml roztworu Pronase-sACSF. Inkubować tkankę przez 20 minut w temperaturze pokojowej, potrząsając/przesuwając probówkę 3-4 razy palcem podczas inkubacji, aby wymieszać próbki.
3. Podczas tej inkubacji należy przygotować roztwór do rozpuszczenia: 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, 100 μl) + DNAzy (1 μl podstawowego DNA w proporcji 1:10 000) w 10 ml karbotlenowego sACSF.
4. Po 20 minutach ostrożnie usunąć roztwór pronazy, aby nie naruszyć tkanki na dnie i zastąpić go 1-2 ml roztworu do rozpuszczania (całkowita objętość zależy od początkowej ilości tkanki).
5. Mechanicznie dysocjować tkankę poprzez rozcieranie tkanki za pomocą wcześniej przygotowanych, polerowanych ogniowo pipet Pasteura. Zaczynając od pipety o dużym otworze (~600 μm), odessać i wydalić roztwór tkankowy co najmniej dziesięć razy, aby rozbić tkankę. Nie wprowadzaj pęcherzyków do roztworu. Powtórz ten proces dla pipety o średnim otworze i pipety o małym otworze. Roztwór powinien być mętny, a w probówkach do pobierania nie powinien być widoczny żaden przezroczysty fragment tkanki.
6. Odpipetować roztwór lizatu komórkowego przez filtr 50 μm do stożkowych probówek o pojemności 5 ml, aby usunąć wszelkie grudki komórek. Kontynuuj z tymi roztworami pojedynczych komórek do cytometrii przepływowej (lub potencjalnie bezpośrednio do zliczania komórek, jeśli sortowanie nie jest potrzebne).

5. Przygotowanie roztworów komórkowych oczyszczonych z sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do przeszczepu

1. Po otrzymaniu roztworów komórkowych z cytometru przepływowego przenieś roztwór do jednej (lub wielu) stożkowych probówek o pojemności 1,5 ml i wiruj komórki pod ciśnieniem 500 g przez 5 minut w temperaturze 4^oC. Po odwirowaniu usuń pożywkę tak, aby w probówce pozostało ~20-40 μL. Rozpuść komórki w pozostałym pożywce (i połącz roztwór, jeśli potrzebnych jest wiele probówek).
2. Na małym kawałku parafilmu wymieszaj ze sobą 2 μl roztworu komórkowego + 8 μl sACSF + 10 μl niebieskiego barwnika trypanowego. Odmierzyć 10 μl do hemocytometru z pokrywą wsuwaną.
3. Policz liczbę żywych komórek w każdej z kwadratowych siatek 4 x 4 w rogach hemocytometru za pomocą standardowego laboratoryjnego licznika ręcznego (martwe komórki będą niebieskie od barwnika) i uśrednij te 4 zliczenia. Pomnóż tę liczbę przez 100, aby określić liczbę komórek na μl.
4. W razie potrzeby dostosuj objętość tak, aby komórki miały stężenie 10 000-30 000 komórek/μl w roztworze do rekonstytucji. Końcowe stężenie zależy od całkowitej ilości komórek i pożądanej liczby przeszczepów. Utrzymuj komórki na lodzie do przeszczepu

6. Przeszczep do szczeniąt P0-2 WT

1. Owiń szczenię typu dzikiego (WT) w jakiś parafilm lub rękawicę i umieść je dobrze przykryte pod lodem. Ustaw minutnik na 5 minut i uruchom go. Po tym czasie wyjmij szczeniaka i sprawdź, czy nie reaguje na szczypanie tylnej łapy.
2. Gdy szczenię znajduje się na lodzie, należy wymieszać roztwór komórkowy, odpipetowując go kilka razy, aby upewnić się, że zawiesina komórek jest dobrze wymieszana przed załadowaniem (wymieszać komórki przed załadowaniem mikropipety przy każdym wstrzyknięciu). Następnie opróżnij mikropipetę z oleju mineralnego i wypełnij ją całkowicie zawiesiną komórkową.
3. Umieść znieczulone szczenię na szalce Petriego z głową leżącą na klejącej szpachli, tak aby czubek głowy był stosunkowo płaski. Umieść taśmę z diamentowym otworem w poprzek głowy szczeniaka, naciągając ją, aby upewnić się, że skóra jest rozciągnięta, a głowa jest jędrna, ale mysz jest wygodna i dobrze oddycha. Lambda powinna być widoczna przez otwór diamentowy.
4. Przesuń zabezpieczoną końcówkę pod Nanoject i opuść mikropipetę tak, aby końcówka mikropipety znalazła się bezpośrednio nad lambdą. Zapisz współrzędne x-y na manipulatorze.
5. Wyreguluj pokrętła manipulatora, aby przesunąć mikropipetę do żądanych współrzędnych wzdłuż osi przyśrodkowo-bocznej i przednio-tylnej głowy: pierwszorzędowa kora somatosensoryczna lub kora S1 → 1,0 mm przednia i 1,0 mm boczna, Hipokamp → 0,75-1,0 mm przedni i 1,0-1,2 mm boczny, prążkowie → 2,0-2,2 mm przednie i 1,5 mm boczne. Współrzędne można nieznacznie dostosować, aby skompensować wiek szczeniaka (np. P0 vs. P2) lub szczep myszy (np. myszy CD1 są większe niż i C57/B6 w P2).
6. Opuścić mikropipetę, aż utworzy się niewielka wklęsłość na skórze. Następnie mocno, ale delikatnie przekręć pokrętło manipulatora osi z, aby przebić mikropipetę przez skórę i czaszkę i wprowadzić ją do mózgu. Kiedy mikropipeta dostanie się do mózgu, nacisk na czaszkę zostanie zwolniony, a wklęsłość zniknie.
7. Lekko cofnąć mikropipetę, aż końcówka zostanie otoczona stożkiem skóry w kształcie namiotu. Odczytaj współrzędne wzdłuż osi z: Będzie to punkt zerowy osi z.
8. Obniż mikropipetę na żądaną głębokość: kora → 0,75-1,0 mm, Hipokamp → 1,2-1,5 mm, Prążkowie → 2,0-2,5 mm. Głębokość można nieznacznie zregulować, aby skompensować wiek lub obciążenie szczeniaka.
9. Wstrzyknąć zawiesinę komórkową za pomocą programu Nanoject III opisanego powyżej. Po zakończeniu programu wstrzykiwania należy odczekać 15-20 s przed powolnym cofnięciem mikropipety, aby zminimalizować wyciek roztworu z miejsca wstrzyknięcia.
10. W przypadku wykonywania wstrzyknięć obustronnych należy ponownie wyzerować mikropipetę powyżej lambdy i przesunąć do odpowiednich współrzędnych na drugiej półkuli. Alternatywnie można wykonać dwa wstrzyknięcia do kory mózgowej tej samej półkuli, przesuwając mikropipetę o 1 mm przed pierwszym wstrzyknięciem.
11. Po zakończeniu przeszczepu usuń taśmę i przenieś szczenię na poduszkę grzewczą. W razie potrzeby oznacz szczeniaka obcinaniem ogona lub palca. Gdy szczenię odzyska czerwony kolor i zacznie się poruszać, umieść je z powrotem w klatce z matką.

Materiały