Transfekcja zwojów korzenia grzbietowego myszy za pośrednictwem elektroporacji w celu wspomagania regeneracji aksonów czuciowych

Streszczenie

Źródło: Li, Q. et al. Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje transfekcję neuronów DRG myszy za pośrednictwem elektroporacji w celu zbadania regeneracji aksonów. Przedstawiono w nim etapy dostarczania konstruktów kwasu nukleinowego do neuronów DRG, indukowania uszkodzenia nerwu kulszowego i oceny regeneracji aksonów.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Wstrzyknięcie do ganglionu korzenia grzbietowego (DRG)
   1. Wstrzyknąć roztwór znieczulający (rozcieńczyć awertynę w sterylnym roztworze soli fizjologicznej o końcowym stężeniu 20 mg/ml, z avertyną 200 mg/kg masy ciała) dootrzewnowo, aby podtrzymać znieczulenie przed wstrzyknięciem DRG.
   2. Załaduj plazmidy kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) lub oligonukleotydy kwasu rybonukleinowego (RNA) (1 μl na DRG) do szklanej pipety kapilarnej.
   3. Ostrożnie włóż końcówkę szklanej pipety kapilarnej do DRG.
   4. Stopniowo wstrzykiwać 1,0 μl roztworu plazmidów DNA lub oligonukleotydów RNA do DRG za pomocą wewnątrzkomórkowych systemów dozowania mikroiniekcji (30 psi, 8 ms).
      UWAGA: Czas trwania wstrzyknięcia nie powinien trwać krócej niż 5 minut.
2. Electroporation
   1. Upuść sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) na końcówki elektrod.
   2. Oczyść krwawienie za pomocą wysterylizowanej kwadratowej gazy bawełnianej.
   3. Delikatnie ściśnij docelowy DRG elektrodami i zastosuj 5 kwadratowych impulsów elektrycznych za pomocą systemu elektroporacji.
   4. Zamknij warstwy mięśni i skóry odpowiednio nylonowymi szwami 5-0.
   5. Umieść mysz na podgrzewanym kocu (35.0 °C) pod ścisłą uwagą, aż całkowicie odzyska wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia.
      UWAGA: Mysz potrzebuje około 60 minut, aby całkowicie wyzdrowieć ze znieczulenia na kocu o temperaturze 37 °C. Rozpuść jedną tabletkę (200 mg) ibuprofenu w 1 000 ml wody (0,2 mg/ml) do codziennego karmienia w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego.
3. Zmiażdżenie nerwu kulszowego
   1. Dwa lub trzy dni (w zależności od projektu eksperymentalnego) po elektroporacji DRG, znieczulij mysz dootrzewnowo roztworem znieczulającym (z avertyną 400 mg/kg masy ciała).
   2. Przyklej cztery kończyny myszy do tablicy korkowej.
   3. Wykonaj 1 cm nacięcie 0,5 cm w lewo wzdłuż linii środkowej. Przetnij mięśnie, takie jak mięsień pośladkowy wielki i mięsień gruszkowaty, podłużnie. Odsłoń odcinek nerwu kulszowego między większym otworem kulszowym a wcięciem kulszowym.
   4. Zmiażdż nerw kleszczami mikrochirurgicznymi przez 12 s i oznacz miejsce zmiażdżenia nylonowym szwem epineuralnym 10-0. Zrób węzeł na membranie opony twardej, aby zaznaczyć miejsce zgniecenia.
   5. Zamknij warstwy mięśni i skóry za pomocą nylonowego szwu 5-0.
   6. Umieść mysz na podgrzewanym kocu (35.0 °C) ze szczególną uwagą, aż całkowicie odzyska wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia.
      UWAGA: Mysz potrzebuje około 60 minut, aby całkowicie wyzdrowieć ze znieczulenia na kocu o temperaturze 37 °C. Rozpuść jedną tabletkę (200 mg) ibuprofenu w 1 000 ml wody (0,2 mg/ml) do codziennego karmienia w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ECM 830 System elektroporacji fal prostokątnych	BTX Harvard Apparatus	45-0052	Do elektroporacji in vivo
Elektrody pęsetowe	BTX Harvard Apparatus	45-0524	Do elektroporacji in vivo, płaski
1 mmPicospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Wewnątrzkomórkowe systemy dozowania mikroiniekcji
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	World Precision Instruments, Inc.
Stereoskopowy mikroskop preparacyjny	Leica	M80
Kleszcze mikrochirurgiczne	FST firmy DUMONT, Szwajcaria	11255-20	Tylko do zmiażdżenia nerwu kulszowego
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, standardowa taśma ścienna
	Fisherbrand	15-901-30	Do mocowania myszy na tablicy korkowej
2, 2, 2-Tribromoetanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin roztwór podstawowy
2-metylo-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin roztwór podstawowy
siRNA Fluorescencyjna uniwersalna kontrola negatywna #1	Sigma-Aldrich	SIC003	Niedocelowe siRNA z fluorescencyjną
mikroRNA Naśladująca kontrola transfekcji za pomocą Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	mikroRNA niedocelowego z fluorescencyjną
plazmidą	Invitrogen Purelink	K210016	Preparat plazmidowy kodujący GFP
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	Dla lepszej wizualizacji konturu DRG podczas wstrzykiwania
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Indukcja znieczulenia
Ksylazyna	AnaSed	NDC 59399-110-20	Indukcja znieczulenia
Paracetamol	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Ulga w bólu pooperacyjnym

1902328 Zestaw do przygotowania