Kwantyfikacja kolców dendrytycznych za pomocą obrazowania w mikroskopii konfokalnej

Abstract

Źródło: Gouder, et. al. Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film przedstawia obrazowanie i analizę kolców dendrytycznych w transdukowanych, znakowanych immunologicznie neuronach piramidowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Szum tła jest redukowany, a dendryty są śledzone, szacując ich średnicę i długość. Automatyczna segmentacja kręgosłupa polega na ustawieniu parametrów dla wymiarów dendrytów i kręgosłupa oraz klasyfikacji kolców. Model 3D jest generowany i eksportowany do analizy.

Protocol

1. Hodowla neuronalna

1. Potraktuj 6-dołkowe płytki hodowlane szklanymi szkiełkami nakrywkowymi z poliornityną (rozcieńczoną do 1/6 w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS), stężenie podstawowe 0,01%) przez noc (O / N), a następnie trzy płukania w DPBS. Następnie dodać lamininę (stężenie podstawowe 1 mg/ml, rozcieńczoną 500 razy w DPBS) przez co najmniej 10 godzin pod okapem przepływowym.
2. Płytkę i wysłać nerwowe komórki macierzyste (NSC) o niskiej gęstości (50 000 komórek/cm2) na 6-dołkowych płytkach hodowlanych ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi w 3 ml pożywki składającej się ze zmodyfikowanej pożywki Eagle firmy Dulbecco i mieszaniny składników odżywczych F-12 lub DMEM/F12 (500 ml), 2 fiolek (po 5 ml każda) suplementu N2, 2 fiolki (10 ml każda) suplementu B27, 10 ml Pen-Streptomycyny (penicylina = 10 000 jednostek/ml i streptomycyna = 10 000 jednostek/ml), 1 ml 2-merkaptoetanolu (roztwór podstawowy: 50 mM) i lamininy (1/500), bez czynników wzrostu.
   KRYTYCZNY KROK: Wykonaj ten krok ostrożnie, dodając komórki powolnymi ruchami obrotowymi, aby zmniejszyć grupowanie komórek.
3. Usuń pożywkę hodowlaną. Dodać świeżą pożywkę N2B27 zawierającą 2 μg/ml świeżego roztworu lamininy, aby utrzymać neuron przyczepiony do szklanych szkiełek nakrywkowych i uniknąć zbrylania. Zmieniaj podłoże co 3 dni. Zachowaj część pozostałej pożywki (200 μl) przed dodaniem świeżej pożywki, aby zapobiec wysuszeniu komórki. Alternatywnie postępuj szybko i zmień całkowitą objętość (3 ml).

2. Transdukcja lotiwirusowa

Uwaga: Ekspresja białka zielonej fluorescencji (GFP) jest napędzana przez promotor mysiej kinazy fosfoglicerynianowej (PGK). W tym badaniu miano wirusa wynosiło 400 ng/μl (roztwór podstawowy w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 1x).

1. Transdukować ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste lub neurony pochodzące z iPSC na dowolnym etapie dojrzewania przez cząstki wirusa, dodając 1 μl roztworu podstawowego zawierającego 40 ng wektora lentiwirusowego GFP na basenik hodowlany (płytki 6-dołkowe) i inkubować przez 48 godzin w świeżej pożywce hodowlanej. Uwaga: W przypadku tego protokołu czas trwania inkubacji pozwala na dobre oznakowanie struktur kręgosłupa.

3. Immunofluorescencja

Uwaga: W celu poprawy znakowania całej morfologii kręgosłupa przeprowadzono znakowanie immunofluorescencyjne przy użyciu przeciwciała anty-GFP w warunkach przepuszczalnych.

1. Usunąć pożywkę hodowlaną i utrwalić transdukowane komórki na szkiełkach nakrywkowych w 4% paraformaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej lub RT, a następnie przemyć 3 razy w 1x PBS (10 minut każdy).
2. Zanurz szkiełka nakrywkowe w PBS uzupełnionym 0,05% Tritonem (100x) i 10% surowicy końskiej na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie umyj 3 razy w 1x PBS.
3. Dodać 100 μl 1x PBS uzupełnionego 4% surowicą końską i pierwszorzędowym przeciwciałem (1/1,000) podniesionym przeciwko GFP i rozcieńczonym przez współczynnik 1,000 na każdym szkiełku nakrywkowym. Inkubować w ciemnym pudełku O/N w temperaturze 4°C, a następnie przemyć 3 razy 1x PBS.
4. Rozcieńczyć przeciwciało sprzężone z Alexa Fluor 488 (1/200) w PBS uzupełnionym 0,5% Tween 20 i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie umyć 3 razy w 1x PBS i zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach z podłożem montażowym do mikroskopii fluorescencyjnej.

4. Dendrytyczne obrazowanie kręgosłupa

1. Wykonaj obrazowanie konfokalne za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego laserowego.
2. Wybierz zdrowe neurony o morfologii piramidalnej i pełnej arboryzacji dendrytycznej i określ ilościowo co najmniej 10 neuronów na stan z oddzielnych eksperymentów. Określić ilościowo 60 - 100 μm na dendryt.
3. Uzyskuj obrazy za pomocą obiektywu 40X oil NA = 1,3 i linii laserowej 488 nm do wzbudzenia GFP, z typową mocą szczytową na poziomie próbki około 20 μW. Ustaw rozmiar piksela około 80 nm, aby prawidłowo próbkować kolce dendrytyczne.
   Uwaga: Późniejsza analiza wymaga obrazu, w którym szum nie zagraża prawidłowej segmentacji dendrytów i kolców. Dzięki wspomnianym powyżej ustawieniom próbkowania przestrzennego i mocy zaobserwowaliśmy, że czas przebywania pikseli wynoszący 3,15 μs jest wystarczający do zebrania wystarczającej liczby fotonów do zbudowania takiego obrazu. W przypadku przyciemnionych próbek jakość obrazu można poprawić, uzyskując średnio od 2 do 4 skanów. Może być konieczne nabycie kilku płytek XY, aby pokryć obszar zainteresowania, które następnie muszą zostać zszyte przed obróbką.
4. Aby pobrać próbkę całej objętości neuronu, należy uzyskać stos Z o odstępach Z od 150 nm do 300 nm, co daje od 20 do 30 warstw Z.
   Uwaga: Boczna rozdzielczość przestrzenna osiągnięta przy tych ustawieniach wynosi 234 nm, a rozdzielczość osiowa wynosi 591 nm. Wybrane tutaj próbkowanie jest odpowiednie, ale ponieważ rozdzielczość osiowa jest większa niż najmniejszy rozmiar kolców, które mają być zobrazowane, analiza faworyzuje kolce, które rozciągają się bocznie od dendrytów.

5. 3D Kwantyfikacja kolców dendrytycznych

Uwaga: Poniższe sekcje szczegółowo opisują zastosowanie oprogramowania Imaris do analizy. Istnieją alternatywne implementacje, w tym NeuronStudio lub Metamorph, które mogą zapewnić podobne wyniki.

Użyj następujących kluczowych ustawień:

1. Jako etap przetwarzania wstępnego, filtrowanie Gaussa jest używane za pośrednictwem funkcji przetwarzania obrazu oferowanych przez oprogramowanie. Filtrowanie gaussowskie można wykonać za pomocą filtra Gaussa Przetwarzanie obrazu > Wygładzanie > Filtr gaussowski. Ustaw szerokość filtra tak, aby była równa rozmiarowi piksela w XY.
2. Wykonaj półautomatyczne śledzenie dendrytów za pomocą modułu Filament Tracer oprogramowania.
   1. Najpierw oszacuj średnicę dendrytu za pomocą narzędzia do pomiaru odległości w zakładce Slice w oprogramowaniu.
   2. W zakładce Surpass kliknij narzędzie Filamenty. Aby zapewnić lepszą niezawodność, protokół ten opiera się na półautomatycznym śledzeniu; Kliknij Pomiń automatyczne tworzenie. W interfejsie modułu wyświetlana jest teraz zakładka Rysuj. W tym miejscu wybierz AutoPath jako metodę, Dendrite jako typ i wprowadź szacowaną średnicę dendrytu.
   3. Użyj trybu Wybierz wskaźnika, zamieniając kursor w pole. Kliknij prawym przyciskiem myszy na punkcie początkowym dendrytu. Uwaga: Oprogramowanie wykonuje wstępne obliczenia.
   4. Przesuń wskaźnik wzdłuż dendrytu. Od punktu początkowego (reprezentowanego przez niebieską kulę) pokazana jest żółta linia reprezentująca najbardziej prawdopodobną ścieżkę dendrytów. Kliknij lewym przyciskiem myszy na punkcie końcowym dendrytu.
3. Wykonaj automatyczną segmentację kręgosłupów. Uwaga: Grzbiety na śledzonym dendrycie są automatycznie znajdowane przez interfejs modułu.
   1. W interfejsie modułu kliknij na zakładkę Tworzenie. Z listy rozwijanej Odbuduj ponownie wybierz opcję Odbuduj średnicę dendrytu i zaznacz pole Zachowaj dane. Następnie kliknij przycisk Odbuduj.
   2. Ustaw Próg tak, aby objętość podzielona na segmenty odpowiadała rzeczywistej objętości dendrytu. Jako algorytm wybierz najkrótszą odległość z mapy odległości. Kliknij przycisk Dalej.
   3. Określ najmniejszą średnicę główki grzbietu i maksymalną długość, ponownie za pomocą narzędzia do pomiaru odległości w zakładce Slice w oprogramowaniu, a następnie wróć do zakładki Surpass i wprowadź parametry. Dla tego protokołu dobrym punktem wyjścia są wartości około 200 - 300 nm dla minimalnej średnicy i 4 μm dla maksymalnej długości. Nie zaznaczaj pola Zezwalaj na kolce gałęzi. Kliknij przycisk Dalej.
   4. Dostosuj próg punktów początkowych tak, aby niebieskie punkty reprezentujące kolce lokalizowały się na rzeczywistych głowach grzbietów. Kliknij przycisk Dalej. Uwaga: Podstawowe obliczenia są teraz wykonywane i mogą być długie.
4. Klasyfikuj grzbiety, przechodząc do zakładki Narzędzia w interfejsie modułu. Kliknij Klasyfikuj kolce. W wyświetlonym monicie interfejsie użytkownika upewnij się, że istnieją cztery klasy, zdefiniowane przez ich morfologię w następujący sposób: Krótki: długość <1 μm; Grzyb: Długość (grzbiet) >3 i Maksymalna szerokość (głowa) >średnia szerokość (szyja) x 2; Długa cienka: Średnia szerokość (głowa) ≥ Średnia szerokość (szyja); Podobne do filopodiów: długość ≤ 4 μm (bez głowy). Uwaga: Interfejs modułu generuje cztery nowe obiekty Filament zawierające wyniki klasyfikacji.
5. Eksport danych statystycznych: w każdym z tych czterech interfejsów obiektu przejdź do zakładki Statystyki. Kliknij przycisk Eksportuj wszystkie statystyki do pliku.
   Uwaga: Inne wartości statystyczne można wyeksportować dla dendrytów (np. długość, powierzchnia, średnia średnica, głębokość gałęzi, kąt rozgałęzienia, objętość itp.) oraz grzbietów (np. prostoliniowość, obszar przyczepu, długość i objętość odrębnych części kręgosłupa, średnica kręgosłupa, gęstość itp.).

Materials