Dokanałowe podawanie wirusów w modelu mysim w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego

Streszczenie

Źródło: Li, D., et al. Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film przedstawia procedurę dokanałowego wstrzykiwania wirusów związanych z adenowirusem (AAV) do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) obudzonej myszy, obejmującą przygotowanie strzykawki, wyrównanie kręgosłupa i precyzyjne wprowadzenie igły. Metoda ta weryfikuje celowane dostarczanie genów, potwierdzając jej potencjał w terapiach OUN.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie 20% roztworu podstawowego chlorowodorku lidokainy

1. Odważyć 2 g chlorowodorku lidokainy. Dodaj 5-6 ml sterylnej wody i delikatnie wymieszaj. Zwiększ objętość do 10 ml sterylną wodą.
2. 1.2 Przefiltruj roztwór podstawowy przez filtry 0,2 mikrona. Roztwór podstawowy podzielić na porcje, 1 ml na 1,5 ml probówki mikrowirówkowej i zamknąć folią uszczelniającą. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Bezpośrednie dokanałowe podawanie AAV u obudzonych myszy

1. Wytrzyj obszar roboczy sterylną gazą z 70% etanolem i przygotuj wymagane zapasy.
2. Przygotować 100 μl kompleksu chlorowodorku lidokainy AAVrh.10/1%, dodając 95 μl roztworu podstawowego rAAVrh10 (5 x^{10 12} kopii genomu/ml) do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 200 μl i dodać 5 μl 20% roztworu podstawowego chlorowodorku lidokainy. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Następnie należy przechowywać roztwór wirusa na lodzie (4 °C).
   UWAGA: Zostanie użyte 8 μl na mysz.
3. Przygotowanie strzykawki z roztworem AAV do wstrzykiwań
   1. Złóż strzykawkę Hamiltona o pojemności 25 μl z igłą 27 G i wyrównaj skośną końcówkę igły ze skalą wolumetryczną na strzykawce.
   2. Delikatnie pobrać 8 μl z 4 x^{10 10} kopiami genomu roztworu wirusa do strzykawki. Upewnij się, że usunąłeś pęcherzyki powietrza.
4. Przygotowanie myszy
   UWAGA: W tym badaniu wykorzystano samce lub samice myszy FVB/NJ (w wieku 30–70 dni). Iniekcja IT została wykonana w masce.
   1. Wysterylizuj obszar roboczy w kapturze z 70% etanolem. Połóż obudzoną mysz (samiec lub samicę, 30–70 dni, waga 13–20 g) na łóżku w pozycji leżącej w kapturze. Przykryj górną część ciała sterylną gazą, aby uspokoić mysz i uniknąć ugryzienia.
   2. Przymocuj zwierzę, chwytając odpowiednio i mocno za obręcz miednicy kciukiem po jednej stronie i palcem wskazującym/środkowym po drugiej stronie. Utrzymuj skórę między obustronnymi obręczami miednicznej napiętą kciukiem i palcem wskazującym. Przytrzymaj delikatnie górną część ciała zwierzęcia dłonią.
   3. Ogol futro na grzbiecie między obustronnymi obręczami miednicy, a następnie wysterylizuj powierzchnię skóry peelingiem na bazie jodku i 70% etanolem.
5. Wstrzyknięcie dooponowe
   1. Poczuj przestrzeń międzykręgową wzdłuż środkowej linii między obustronnymi obręczami miednicy kciukiem lub palcem wskazującym drugiej ręki i naciśnij wgłębienie paznokciem, aby wskazać przestrzeń międzykręgową L5-L6 (zlokalizuj miejsce wstrzyknięcia).
   2. Obróć lekko i delikatnie podstawę ogona, aby wskazać linię środkową kręgosłupa. Przed wstrzyknięciem należy ustawić skos igły w kierunku głowy zwierzęcia.
   3. Upewnij się, że zwierzęta są mocno zamocowane i wyrównaj igłę wzdłuż linii środkowej kręgosłupa.
   4. Delikatnie i pionowo (lub lekko przechylić igłę pod kątem 70–80°) w miejscu przecięcia wgłębienia, utrzymując strzykawkę w środkowej płaszczyźnie strzałkowej. Powoli zmniejsz kąt do około 30°, gdy łączy się z kością, a następnie wsuń igłę w przestrzeń międzykręgową.
      UWAGA: Wyraźny nagły ruch ogonem jest oznaką udanego wejścia w przestrzeń śródoponową. Gdy igła wejdzie do przestrzeni międzykręgowej, końcówka igły będzie mocno zaciśnięta. Igła 27 G użyta w tym badaniu nadaje się do podawania IT u myszy, ale nie u szczurów.
   5. Wstrzyknąć roztwór wektorowy. Uruchomić stoper i wstrzyknąć 8 μl roztworu wektorowego z prędkością 1 μl/4 s. Zachowaj igłę około 1 minutę po zakończeniu porodu. Wyjmij igłę, delikatnie obracając, aby uniknąć wycieku.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
myszy FVB/NJ	Charles River Laboratories Chiny Monohydrat
chlorowodorku lidokainy	HEOWNS	73-78-9
AAV	Rdzeń Centrum Terapii Genowej na Uniwersytecie Massachusetts Medical School
25μL strzykawka Hamilton / igła 27-30g	GASTIGHT	1702
70% Etanol	WEN ZHI
Gauze	Wei AN 5171112		8 cm * 10 cm * 12 cm

Wektor wirusowy