Niniejszy artykuł przedstawia wiarygodny protokół izolacji i hodowli komórek macierzystych grzebienia neuronalnego z ludzkich mieszków włosowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i hodowla komórek macierzystych grzebienia neuronalnego z ludzkich mieszków włosowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mieszki włosowe podlegają wzrostowi przez całe życie, a cykl wzrostu włosa jest ściśle kontrolowanym procesem obejmującym proliferację i spoczynek komórek macierzystych. Wybrzuszenie włosa jest dobrze scharakteryzowaną niszą dla dorosłych komórek macierzystych1. Ten segment zewnętrznej osłonki korzeniowej zawiera szereg różnych typów komórek macierzystych, w tym epitelialne komórki macierzyste2, melanocytarne komórki macierzyste3 oraz komórki macierzyste podobne do grzebienia neuronalnego4-7. Mieszki włosowe stanowią dostępny i bogatyt źródło różnych typów ludzkich komórek macierzystych. My oraz inni badacze wyizolowaliśmy komórki macierzyste grzebienia neuronalnego (NCSCs) z ludzkich płodowych i dorosłych mieszków włosowych4,5. Te ludzkie komórki macierzyste są komórkami zatrzymującymi znacznik i są zdolne do samoodnawiania poprzez asymetryczny podział komórkowy in vitro. Wykazują one ekspresję markerów niedojrzałych komórek grzebienia neuronalnego, ale nie markerów różnicowania. Nasze badanie profilowania ekspresji wykazało, że wykazują one podobny wzorzec ekspresji genów co niedojrzałe komórki grzebienia neuronalnego skóry mysiej. Wykazują one klonalną multipotentność, co pozwala na powstanie linii komórek miogennych, melanocytarnych i neuronalnych po klonalnej hodowli pojedynczych komórek in vitro. Zróżnicowane komórki nie tylko nabywają specyficzne dla danej linii markery, ale także wykazują odpowiednie funkcje w warunkach ex vivo. Ponadto te NCSCs wykazują potencjał różnicowania w kierunku linii mezenchymalnych. Zróżnicowane komórki neuronalne mogą przetrwać w mózgu myszy i zachować markery różnicowania neuronalnego. Wykazano, że pochodzące z mieszków włosowych NCSCs mogą wspomagać regenerację nerwów i poprawiać funkcje motoryczne u myszy przeszczepionych tymi komórkami macierzystymi po przeciąciu rdzenia kręgowego8. Ponadto nerwy obwodowe były naprawiane przy użyciu przeszczepów komórek macierzystych9, a implantacja prekursorowych komórek pochodzenia skórnego w sąsiedztwie zmiażdżonych nerwów kulszowych doprowadziła do remielinizacji10. Zatem pochodzące z mieszków włosowych/skóry NCSCs wykazały już obiecujące wyniki w terapii regeneracyjnej w modelach przedklinicznych.
Reprogramowanie komórek somatycznych do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) wykazuje ogromny potencjał w medycynie regeneracyjnej. Istnieje jednak wciąż wiele problemów związanych z komórkami iPS, w szczególności nie zostały one odpowiednio rozwiązane kwestie długoterminowego wpływu integracji onkogenów/wirusów oraz potencjalnej tumorigeniczności pluripotencjalnych komórek macierzystych. Przed wykorzystaniem komórek iPS w medycynie regeneracyjnej należy jeszcze pokonać wiele przeszkód. Z kolei dorosłe komórki macierzyste są znane jako bezpieczne i są stosowane klinicznie od wielu lat, na przykład w przypadku przeszczepów szpiku kostnego. Wielu pacjentów odniosło już korzyści z takiego leczenia. Autologiczne dorosłe komórki macierzyste są nadal preferowanymi komórkami do transplantacji. W związku z tym łatwo dostępne i zdolne do ekspansji dorosłe komórki macierzyste w ludzkiej skórze/mieszkach włosowych stanowią cenne źródło dla medycyny regeneracyjnej.
Protokół
1. Przygotowanie płytek do hodowli tkankowej
- Pokryć każde dołeczki odpowiednią ilością poli-D-lizyny (PDL), aby zakryć dno dołeczki. Pozostawić płytki do wyschnięcia w dygestorium.
- Po wyschnięciu dołeczek wypłukać je sterylną wodą, a następnie odessać płyn. Pozostawić płytki do wyschnięcia w dygestorium.
- Po wyschnięciu pokryć fibronektyną (rozpuszczoną w wodzie Biowhittaker przez noc w temperaturze 37 °C w stężeniu 1 mg w 6 ml).
- Dodać pożywkę NCSC [95 ml DMEM/F12, 1 ml Penn/Strep (P/S), 1 ml N2, 2 ml B27, 100 μl mercaptoetanolu (2ME; roztwór stokowy 50 mM), bFGF (20 ng/ml pożywki), IGF-1 (20 ng/ml pożywki) oraz EGF (20 ng/ml pożywki)] przed wyschnięciem fibronektyny na płytkach.
2. Izolacja komórek mieszków włosowych ze skóry głowy człowieka
- Przed rozpoczęciem procedury izolacji NCSCs należy przygotować odpowiednie pożywki i odczynniki (patrz Tabela 1).
- Pobiera się świeżą skórę skalpu dorosłego człowieka z zabiegów liftingu twarzy lub tkankę skalpu płodowego, a następnie przemywa ją PBS zawierającym penicylinę-streptomycynę.
- Następnie skórę przenosi się do probówek 50 ml i inkubuje w DMEM z dispazą (10 mg/ml) przez noc w temperaturze 4 °C. Skuteczna jest również inkubacja przez 2-4 h w temperaturze 37 °C. Fragmenty skóry powinny mieć maksymalną szerokość 1 cm, aby umożliwić penetrację enzymu.
- Przenieś skórę do sterylnej szalki Petriego; usuwaj każdy włos ze skóry, chwytając łodygę włosa blisko powierzchni skóry i ciągnąc go zdecydowanie i płynnie. Mieszki włosowe wykazują morfologię anagenu (Rycina 1A) lub telogenu (Rycina 1B).
- Wyizolowane fragmenty mieszków inkubuj w 0,05% trypsynie-EDTA (Invitrogen) przez 15-20 min w temperaturze pokojowej, okresowo wstrząsając, a następnie dodaj 4 ml DMEM z 10% FBS, aby zatrzymać reakcję. Nabłonek mieszkowy zostaje poddany trypsynizacji i przefiltrowany przez filtr 40 μm w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek o różnej wielkości i kształcie.
- Wiruj przy 200 x g przez 5 min, ostrożnie odlej nadsącz i ponownie zawieś w 1 ml PBS zawierającego 2% surowicy (FBS).
- Alternatywnie, wyrwane mieszki włosowe można umieścić w hodowli bez trawienia trypsyną w celu wzrostu sfer włosowych in situ.
3. Izolacja NCSC z mieszków włosowych przy użyciu sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej
- Jednokomórkową zawiesinę z mieszków włosowych otrzymano poprzez trawienie trypsyną, a następnie znakowano przeciwciałami przeciwko CD271 (sprzężonym z APC) / HNK1 (sprzężonym z FITC) lub CD271/ integrynie alpha4 (sprzężonej z PE) przez 40 min w ciemności, w temperaturze 0°C.
- Wirować przez 5 min przy 200 x g w temperaturze pokojowej, a następnie odprowadzić nadsącz.
- Resuspender komórki w PBS zawierającym 2% surowicy (FBS); przed sortowaniem dodać PI w celu wykluczenia martwych komórek.
- Przeprowadzić sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej (FACS). Zebrać komórki podwójnie dodatnie CD271+, HNK1+ lub komórki podwójnie dodatnie CD271+, integryna alpha+ (Rysunek 2).
- Po sortowaniu komórki podwójnie dodatnie CD271+, HNK1+ lub komórki podwójnie dodatnie CD271+, integryna alpha+ hodowano w płytkach o ultra-niskiej adhezji w medium NCSC.
4. Hodowla pierwotnych NCSCs
- Kulturować rozdzielone komórki mieszkowe lub komórki wyselekcjonowane metodą FACS w płytkach o ultra-niskim przywieraniu w pożywce NCSC, wymieniając pożywkę codziennie.
- Codziennie kontrolować hodowlę komórkową pod mikroskopem. Komórki NCSC zaczną tworzyć pływające małe agregaty po kilku dniach, a dobrze uformowane sfery w ciągu 2-5 tygodni hodowli, w zależności od wieku dawców (Rysunek 3A). W przypadku hodowli całych mieszków włosowych w pożywce NCSC, po kilku dniach pojawi się rozrost w obszarze wybrzuszenia (bulge), a w ciągu kilku tygodni uformują się sfery in situ (Rysunek 3B).
5. Ekspansja komórek NCSCs
- Przemyć komórki raz PBS.
- Dodać uprzednio ogrzaną (do 37 °C, krytyczne) accutase i inkubować w 37 °C przez 5-10 min, okresowo wstrząsając, aby upewnić się, że sfery neuralnych komórek macierzystych rozpadły się na pojedyncze komórki (w przypadku hodowli adhezyjnej NCSC, inkubować komórki z accutase w 37 °C przez 5 min, aby upewnić się, że komórki macierzyste mieszków włosowych oddzieliły się od podłoża).
- Przemyć i odwirować komórki dwukrotnie przez 5 min przy 200 x g w temperaturze pokojowej w medium DMEM/F12, aby usunąć pozostałości roztworu accutase.
- Resuspender komórki w medium hodowlanym NCSC.
- W przypadku hodowli zawiesinowej przenieść komórki na płytki o ultra-niskiej adhezji. W przypadku hodowli adhezyjnej przenieść komórki na wstępnie przygotowane płytki do hodowli tkankowych.
6. Reprezentatywne wyniki
Pożywka do hodowli NCSC jest wystarczająca do utrzymania hNCSC w stanie niezróżnicowanym bez konieczności stosowania komórek karmicieli. Keratynocyty nie będą proliferować i stopniowo obumrą w tej pożywce. Niektóre małe, okrągłe komórki będą proliferować i tworzyć niewielkie agregaty w zawiesinie po 3 do 5 dniach. Te pływające agregaty powoli zwiększają swoje rozmiary, tworząc trójwymiarowe struktury przypominające sfery, które nazwaliśmy sferami włosa (Ryc. 3A). W przypadku hodowli na powlekonych płytkach, NCSC przywierają do powierzchni i nie tworzą sfer. Przytwierdzone NCSC rosną szybciej niż w zawiesinie. Komórki macierzyste tworzące sfery lub przytwierdzone wykazują ekspresję markerów NCSC. Podczas hodowli całych mieszków włosowych sfery powstają w obszarze odpowiadającym regionowi wybrzuszenia (Ryc. 3B).
Rysunek 1. Wyрłukane mieszki włosowe w fazie anagenu (A) i telogenu (B).
Rycina 2. Reprezentatywne obrazy analizy FACS komórek NCSC. Panel lewy: bramkowanie komórek z użyciem przeciwciał anty-CD271 i anty-integryna alpha 4. Panel prawy: bramkowanie komórek z użyciem przeciwciał anty-CD271 i anty-HNK1.
Rycina 3. Morfologia sfer włosa. (A) Morfologia pływających sfer włosa, panel lewy: małe powiększenie, panel prawy: duże powiększenie. (B) Morfologia sfery włosa in situ w obszarze wybrzuszenia, panel lewy: sfera włosa w wybrzuszeniu w fazie telogenu, panel prawy: sfera włosa w obszarze wybrzuszenia mieszka włosowego w fazie anagenu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisane metody izolacji i hodowli komórek są powtarzalne i niezawodne. Wygenerowaliśmy NCSCs od kilkudziesięciu osób w szerokim zakresie wieku. Choć najlepiej jest przetwarzać tkankę bezpośrednio po jej pobraniu, stwierdziliśmy, że tkanki skóry głowy mogą być bezpiecznie przechowywane w pożywce w lodzie podczas transportu nocnego przy minimalnym wpływie na żywotność komórek.
Ważne jest, aby tkankę skóry głowy traktować antybiotykami i stosować technikę aseptyczną podczas izolacji mieszków włos...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta jest finansowana z grantów NIH o numerach R01AR054593 oraz R01AR054593-S1 przyznanych Xu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-32 | |
| Inaktywowana termicznie surowica bydlęca (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| suplement B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| suplement azotowy (N2) | Invitrogen | 17502048 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0026 | |
| EGF | R&system amp;D | 236-EG-01M | |
| IGF-I | R&system amp;D | 291-G1-050 | |
| 0,05% trypsyna/EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| Dyspase | Invitrogen | 17105041 | |
| Penicylina-streptomycyna | Invitrogen | 15070063 | |
Tabela 1. |
Bibliografia
- Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
- Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell. 61, 1329-1337 (1990).
- Tanimura, S., et al. Hair follicle stem cells provide a functional niche for melanocyte stem cells. Cell Stem Cell. 8, 177-187 (2011).
- Yu, H., et al. Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells from human hair follicles. Am. J. Pathol. 168, 1879-1888 (2006).
- Yu, H., Kumar, S. M., Kossenkov, A. V., Showe, L., Xu, X. Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles. J. Invest. Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).
- Wong, C. E., et al. Neural crest-derived cells with stem cell features can be traced back to multiple lineages in the adult skin. J. Cell Biol. 175, 1005-1015 (2006).
- Sieber-Blum, M., Grim, M., Hu, Y. F., Szeder, V. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle. Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).
- Amoh, Y., et al. Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17734-17738 (2005).
- Koliatsos, V. E., Xu, L., Yan, J. Human stem cell grafts as therapies for motor neuron disease. Expert Opin. Biol. Ther. 8, 137-141 (2008).
- McKenzie, I. A., Biernaskie, J., Toma, J. G., Midha, R., Miller, F. D. Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system. J. Neurosci. 26, 6651-6660 (2006).
- LeDouarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. Cambridge. (1999).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Roh, C., et al. Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 44, 236-244 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
