Otrzymywanie synaptoneurosomów z kory myszy przy użyciu nieciągłego gradientu gęstości perkolu i sacharozy

Summary

Opisano metodę przygotowania translacyjnie aktywnych, nienaruszonych synaptoneurosomów (SN) z kory mózgowej myszy. W metodzie wykorzystuje się nieciągły gradient gęstości perkolu i sacharozy, co pozwala na szybkie otrzymanie aktywnych SN.

Abstract

Synaptoneurosomy (SN) są uzyskiwane po homogenizacji i frakcjonowaniu kory mózgowej myszy. Są to ponownie uszczelnione pęcherzyki lub izolowane zakończenia, które odrywają się od zakończeń aksonów, gdy tkanka korowa jest homogenizowana. SN zachowują cechy pre- i postsynaptyczne, co czyni je przydatnymi w badaniu transmisji synaptycznej. Zachowują maszynerię molekularną wykorzystywaną w sygnalizacji neuronalnej i są zdolne do wychwytywania, przechowywania i uwalniania neuroprzekaźników.

Produkcja i izolacja aktywnych SN może być problematyczna przy użyciu pożywek takich jak Ficoll, które mogą być cytotoksyczne i wymagają przedłużonego wirowania ze względu na wysoką gęstość, oraz metod filtracji i wirowania, które mogą skutkować niską aktywnością z powodu mechanicznego uszkodzenia SN. Jednak zastosowanie nieciągłych gradientów gęstości perkolu i sacharozy do izolowania SN zapewnia szybką metodę uzyskania dobrych plonów aktywnych translacyjnie SN. Metoda gradientu perkolu i sacharozy jest szybka i delikatna, ponieważ wykorzystuje warunki izotoniczne, ma mniej i krótsze wirowanie oraz pozwala uniknąć etapów wirowania, które osadzają SN i powodują uszkodzenia mechaniczne.

Protocol

1. Przygotowania^1-4

1. Przygotować 500 ml buforu gradientowego (GM), mieszając 50 ml 2,5 M zawiesiny sacharozy, 2,5 ml 1M Tris-HCl bulionu o pH 7,5 i 0,1 ml 0,5 m EDTA, pH 8,0 z wodą mili-Q do objętości. Filtruj wysterylizuj roztwór, podwielokrotność i przechowuj zamrożony.
2. Przygotować 1000-krotny zapas tetrodotoksyny (TTX), sporządzając 1 mM roztwór w mili-Q H₂O. Podwielokrotności TTX można przechowywać w temperaturze -20°C.
3. Przygotuj 10x bufor stymulacyjny, sporządzając roztwór 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na₂HPO₄, 4 mM KH₂PO₄, 40 mM NaHCO₃ i 800 mM NaCl w wodzie mili-Q. Towar można przechowywać w temperaturze 4°C.
4. Wirówki wstępnie schłodzić do temperatury 4°C.
5. Przygotować roztwór podstawowy izosmotycznego Percollu (SIP), dodając 9 objętości Percollu (18 ml) do 1 objętości 2,5 M sacharozy (2 ml) w wodzie mili-Q i dobrze wymieszać.
6. Przygotuj warstwy gradientu 3, 10, 15 i 23%, dodając odpowiednie ilości SIP do bufora GM i mieszając każdą:

7. Wlać warstwy gradientu, pipetując po 2 ml z 23, 15, 10 i 3% izosmotycznych roztworów Percollu do probówek wirówkowych Beckman z nakrętkami za pomocą Pipetmana Gilson P1000. Interfejs między warstwami powinien być wyraźnie dostrzegalny, bez mieszania warstw. Przechowuj gradienty w temperaturze 4°C przez co najmniej 20 minut przed użyciem. Gradienty mogą być przechowywane do 24 godzin, chociaż zaleca się stosowanie tego samego dnia. [Niedoświadczony personel laboratoryjny może ćwiczyć przygotowywanie gradientów poprzez dodawanie niebieskiego barwnika do izomotycznych roztworów Percoll w celu wizualizacji interfejsów warstw.]

2. Sekcja myszy ¹

1. Upewnij się, że wszystkie procedury hodowli myszy i eutanazji są wykonywane zgodnie z wytycznymi NIH i uniwersytetu. Eutanazja szczeniąt (w wieku od P13 do P21) przez uduszenie dwutlenkiem węgla lub metodą zatwierdzoną w protokole dla zwierząt.
2. Przypnij mysz do deski preparacyjnej i spryskaj tył szyi i głowę etanolem. Za pomocą ostrych nożyczek przeciąć rdzeń kręgowy u podstawy czaszki, usuń skórę z górnej części czaszki, przetnij czaszkę bocznie między kością ciemieniową a kością międzyciemieniową lub między mózgiem a obszarami kory. Następnie przeciąć czaszkę od podstawy do nosa (wzdłuż szwu strzałkowego), ostrożnie usuń miękką kość ciemieniową, ciągnąc każdą półkulę na bok i usuń korę szpatułką. Włóż szpatułkę do mózgu nad móżdżkiem, a następnie wyjmij korę i umieść ją w lodowatym buforze GMO. Natychmiast przejdź do etapu homogenizacji. Nie pozwól, aby kora zbyt długo pozostawała w lodowatym buforze, ponieważ wpłynie to niekorzystnie na tworzenie SN.

3. Przygotowanie homogenatu i SNs ^1-4

1. Opłucz korę w lodowatym buforze GM i przenieś dwie korki do szklanego homogenizatora Dounce zawierającego 5 ml zimnego buforu GMO.
2. Delikatnie homogenizuj korę za pomocą 5-10 uderzeń luźnym tłuczkiem (tłuczek "A"), a następnie 5-10 uderzeń ciasnym tłuczkiem (tłuczek "B"). Uderzenia powinny być szybkie, ale na tyle powolne, aby nie powodować powstawania pęcherzyków powietrza. Zdjęcie homogenatu po homogenizacji znajduje się na schemacie 1. Liczba uderzeń będzie się różnić w zależności od indywidualnego homogenizatora i towarzyszących mu tłuczków. Po zakończeniu gradienty powinny dać silne pasmo SN, jeśli nie, dostosuj liczbę pociągnięć.
3. Przenieść homogenat do stożkowego o pojemności 15 ml i odwirować przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C w wahadłowym wirniku kubełkowym (wirówka Allegra 6KR) w celu osadzenia szczątków komórkowych i jąder. Zdjęcie wirowanego homogenatu znajduje się na schemacie 1.
4. Warstwę 2 ml supernatantu według gradientu perkolu i sacharozy, zakryć probówki i odwirować przy 32 500 xg przez 5 minut w temperaturze 4°C w wirniku o stałym kącie (wirówka Beckman J2-21, rotor JA-17) za pomocą odpowiednich adapterów (patrz tabela odczynników i sprzętu).
5. Odpipetować i wylać roztwór powyżej pasma SN za pomocą szklanej pipety Pasteura. Odpipetować pasmo SN na granicy faz 15/23%, przenieść do stożka i przechowywać na lodzie. Każdy gradient lub jedna kora wytworzy 0,9-1,1 ml SN.
6. Dostosuj stężenie soli w SN, dodając jedną dziesiątą objętości 10-krotnego buforu stymulacyjnego, dodaj 1000x CaCl₂ do końcowego stężenia 12 nM i dodaj 1 mM TTX do końcowego stężenia 1 μM, aby stłumić wzbudzenie niespecyficzne. (Dodanie CaCl₂ jest opcjonalne, jeśli będzie zakłócać działanie dalszych aplikacji SN).
7. Określ stężenie białka SN za pomocą zestawu do oznaczania białek Micro BCA. (Test białka Bradforda nie jest zalecany ze względu na wnioskowanie z Percoll.)
8. SN mogą być używane bezpośrednio i szybko do badań nad translacją białek. W przypadku innych zastosowań lizat SN można oczyścić lub zagęścić za pomocą zestawu do przygotowania próbek Pierce SDS-PAGE.

4. Reprezentatywne wyniki:

Gdy kora myszy została zhomogenizowana i rozdzielona na nieciągłych gradientach perkolu i sacharozy (Schemat 1), zaobserwowano 6 pasm lub frakcji (Rysunek 1). Wcześniej wykazano w przypadku kory mózgowej^3,5 szczura, że składnikami pasm o dużej masie cząsteczkowej były przerwana błona i mielina oraz że granulowany materiał zawierał mitochondria lub organelle (Tabela 1). Interfejs 23%/15% (pasmo 5) zawierał wzbogacone SN.

Pasmo na granicy faz 23%/15%, zawierające nienaruszone SNs, zostało usunięte i zbadane za pomocą mikroskopii elektronowej (EM), jak opisano wcześniej. ^2,6 EM wykazało obecność nienaruszonych pęcherzyków synaptycznych oraz zachowanie elementów presynaptycznych i postsynaptycznych (ryc. 2). Izolacja przedziałów pre- i postsynaptycznych jest ważna dla badania sygnalizacji i syntezy białek, które zachodzą w obu przedziałach. ^7-13 Gradient perkolu i sacharozy jest oczyszczaniem surowym, więc zaobserwowaliśmy niewielkie zanieczyszczenie komórkowe, jądrowe i organelle we frakcji SN, ale ogólna separacja była dobra.

Podczas badania metodą Western blot, frakcje Percoll zawierały oczekiwane markery białkowe ze wzrostem czystości synaptycznej w paśmie SN (Rysunek 3, Tabela 2). Markery synaptyczne i neuronalne zostały utrzymane we wzbogaconym paśmie SN (pasmo 5), ale obfitość innych markerów została znacznie zmniejszona. W szczególności obecność GFAP, markera dla astrocytów i komórek nowotworowych pochodzenia glejowego, oraz Lamin-B1, markera jądrowego, była znikoma, podczas gdy markery strukturalne i synaptyczne zostały utrzymane lub wzmocnione. Ponadto zaobserwowano zatrzymanie markerów organelli, takich jak mitochondria i Golgi, które odgrywają rolę w syntezie białek.

Typowe plony dla pasma SN wynosiły 250-500 ng białka na μL, zgodnie z testem białkowym BCA. Aktywność SN określono na podstawie ilości obecnej syntezy białek de novo, monitorowanej przez inkorporację [35S]-Met (Figura 4). ² Podstawowa aktywność translacyjna była zwiększona 1,56 razy, gdy SN były stymulowane 50 μM glutaminianu / 10 μM glicyny (Glu) lub 5,12 razy po aktywacji inhibitorem Pin1 juglonem. Wiadomo, że hamowanie Pin1 powoduje zwiększoną syntezę białek. ² Aby potwierdzić, że wzrost inkorporacji [35S]-Met był spowodowany syntezą białek de novo, dodaliśmy 40 μM anisomycyny, inhibitora syntezy białek i zaobserwowaliśmy wyraźny spadek inkorporacji w obecności i braku Glu w porównaniu z poziomami podstawowymi. Ponadto, po dodaniu 2% Triton-X 100, który zaburza integralność SN, podstawowa translacja została zmniejszona o 75%. ² Ponadto, podczas badania prążków (B4-B6), które wykazywały największe wzbogacenie markerów synaptycznych, SN lub Band 5 miały największą aktywność w syntezie białek de novo (Figura 5). W ten sposób nieciągłe gradienty perkolu i sacharozy szybko wytwarzają wysoce aktywne i wzbogacone pasmo SN, które można wykorzystać do badania translacji białek.

Nieciągła procedura gradientu perkolu i sacharozy jest bardziej korzystna niż inne metody, ponieważ uszkodzenia mechaniczne są spowodowane trudniejszymi warunkami. W porównaniu z metodą filtracji, w której oczyszczony homogenat korowy jest przepuszczany przez szereg filtrów, które zmniejszają swój ^{rozmiar,3,14-15} metoda Percolla tworzy więcej SN o większej aktywności. Jak widać na rysunku 6, gdy podwielokrotność SN przygotowanych metodą filtracji została przepuszczona przez gradient Percoll-sacharoza, na granicy faz 15/23% jest znacznie mniej SN i większa ilość pękniętych membran. Gdy syntezę białek de novo mierzono poprzez inkorporację S35-met, SN przygotowane metodą filtracji były znacznie mniej aktywne (Figura 7). Aby zmaksymalizować aktywność translacyjną, używamy myszy w wieku od P14 do P18. SN można przygotować z dorosłych myszy, ale zaobserwowaliśmy znacznie zwiększoną aktywność translacyjną z SN przygotowanym z młodych myszy (Figura 8).

Tabela 1. Składniki prążków z nieciągłych frakcjonowań w gradiologii Percoll homogenizowanej kory myszy.^3,5

Tabela 2. Podsumowanie analizy zachodnich nieciągłych składników pasma gradientu perkolu i sacharozy. Względne stężenia białek dla każdej z frakcji pasmowych wyizolowanych za pomocą nieciągłego gradientu perkol-sacharoza określono za pomocą Western blot. Brak obecnego białka (-), 0≥0,2 (+), 0,2≥0,8 (++) lub >0,8 (+++) razy większego niż białko obecne w supernatancie (S, odwirowany homogenat kory), reprezentatywny dla n=3.

Schemat 1: Schemat preparatu SN z wykorzystaniem nieciągłego gradientu gęstości perkolu i sacharozy. Kora mózgowa myszy została wypreparowana, zhomogenizowana i odwirowana z niską prędkością w celu usunięcia niehomogenizowanej tkanki, komórek, całych organelli, takich jak jądra i błony. Nieciągły gradient powinien mieć wyraźnie zdefiniowane warstwy. Wstawka obrazka przedstawia przykładowe warstwy, które zostały zabarwione na niebiesko wyłącznie w celach ilustracyjnych w celu wizualizacji warstw. Supernatant nakłada się na nieciągły gradient perkolu i sacharozy i odwirowuje ze średnią prędkością. Pasmo SN jest następnie pobierane z gradientu i jest gotowe do użycia.

Rysunek 1. Frakcjonowanie homogenatywne na nieciągłym gradiencie percoll-sacharoza. Kora myszy została zhomogenizowana i oddzielona na nieciągłym gradiencie percoll-sacharoza, co dało początek 6 prążkom lub frakcjom. Oczyszczone, aktywne SN (*) znaleziono w paśmie 5.

Rysunek 2. Preparaty SN dają niejednorodną mieszaninę SN, które zachowują elementy presynaptyczne i postsynaptyczne. Mikrografia elektronowa preparatu SN przygotowanego z myszy C57BL/6 (w wieku od P13 do P21) została wykonana zgodnie z wcześniejszym opisem i pokazuje SN z zachowanymi elementami presynaptycznymi i postsynaptycznymi. ^2,6 Czerwone strzałki wskazują na zagęszczenia postsynaptyczne. Podziałka wynosi 1 μm.

Rysunek 3. Analizy Western blot preparatów SN wykazały, że markery synaptyczne i neuronalne utrzymywały się w oczyszczonych SN (pasmo 5), ale obfitość innych markerów była znacznie zmniejszona. Immunobloty supernatantu (S, odwirowany homogenat korowy) i prążki 1-6 nieciągłego gradientu perkol-sacharoza badano pod kątem β-aktyny (strukturalna, kontrola obciążenia), GFAP (astrocytowa), GP73 (Golgi), HSC70 (cytoplazmatyczna i jądrowa), Lamin-B1 (jądrowa), prohibityna (mitochondrialna), PSD95 (gęstość postsynaptyczna), SNAP25 (synaptyczna), synaptofizyna (synaptyczna) i β3-tubulina (specyficzna dla neuronu). Pasma zostały zobrazowane za pomocą Storm 860 Phosphorimager, reprezentatywnego dla n=3.

Rysunek 4. SN są aktywne i wykazują syntezę białek de novo poprzez inkorporację [35S]-Met. SN były wstępnie równoważone do 37°C przez 10 minut. Następnie SN poddawano obróbce lub wstępnie traktowano przez 15 minut 40 μM anisomycyną lub 1 μM juglonem w temperaturze 37°C, a następnie dodano [35S]-Met, 20 μl Express Pro Label Mix S35 Easy Tag, plus lub minus Glu w temperaturze 37°C przez 30 minut. Próbki przygotowano przy użyciu zestawu Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, uruchomionego na 15% żelu poliakrylamidowym, wysuszonego i oznaczonego ilościowo za pomocą luminoobrazera Molecular Dynamics Storm 860, reprezentatywnego dla n=3, ±SEM.

Rysunek 5. Pasmo 5 z nieciągłego gradientu perkol-sacharoza zawierało najwyższe poziomy syntezy białek de novo. Pasma 4, 5 i 6 oraz supernatant (S, odwirowany homogenat korowy) były wstępnie zrównoważone do 37°C przez 10 minut. Następnie dodano [35S]-Met, Express Pro Label Mix S35 Easy Tag, plus lub minus Glu w temperaturze 37°C przez 30 min. Próbki przygotowano przy użyciu zestawu Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, uruchomionego na 15% żelu poliakrylamidowym, wysuszonego i oznaczonego ilościowo za pomocą luminoobrazera Molecular Dynamics Storm 860, reprezentatywnego dla n=3, ±SEM.

Rysunek 6. SN otrzymane metodą filtracji zawierają więcej uszkodzonych membran i mniej całych SN niż SN przygotowane metodą nieciągłego gradientu perkolu i sacharozy. SN wyprowadzono przez przepuszczenie homogenizowanej kory przez szereg filtrów o zmniejszającej się wielkości porów, jak opisano wcześniej. ^3,14-15 Podwielokrotność SN otrzymanych metodą filtracji odwirowano na nieciągłym gradiencie perkol-sacharoza i porównano z równoważną ilością materiału przy użyciu nieciągłego gradientu perkol-sacharoza.

Rysunek 7. SN otrzymane metodą filtracji zawierają mniejszą aktywność syntezy białek de novo niż SN otrzymane metodą nieciągłego gradientu perkol-sacharoza. SN wyprowadzono przez przepuszczenie homogenizowanej kory przez szereg filtrów o zmniejszającej się wielkości porów, jak opisano ^{wcześniej,3,14-15} oraz przez nieciągłe metody gradientu percoll-sacharoza. SN z obu preparatów wstępnie równoważono do temperatury 37°C przez 10 min. Następnie dodano [35S]-Met, Express Pro Label Mix S35 Easy Tag, plus lub minus Glu w temperaturze 37°C przez 30 min. Próbki przygotowano przy użyciu zestawu Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, uruchomionego na 15% żelu poliakrylamidowym, wysuszonego i oznaczonego ilościowo za pomocą luminoobrazera Molecular Dynamics Storm 860, reprezentatywnego dla n=3, ±SEM.

Rysunek 8. SN od młodszych myszy (P14) mają większą aktywność translacyjną niż starsze myszy (P85). SN przygotowano z myszy w różnym wieku przy użyciu metody nieciągłego gradientu perkolu i sacharozy, wstępnie zrównoważono w temperaturze 37°C przez 10 minut, potraktowano lub niepotraktowano Glu w obecności [35S]-Met (Express Pro Label Mix S35 Easy Tag) przez 30 minut, zamrożono, a następnie oczyszczono za pomocą zestawu do przygotowania próbek Pierce SDS-PAGE. SN przeprowadzono następnie na 12% żelu poliakrylamidowym SDS, wysuszono i zobrazowano na luminoobrazatorze Molecular Dynamics Storm 860, reprezentatywnym dla n = 3, ±SEM. SN od myszy P14 były co najmniej 3 razy bardziej aktywne niż myszy P85.

Discussion

Opisany tutaj nieciągły preparat gradientu perkolu i sacharozy jest szybką i niezawodną metodą izolowania aktywnych SN, która może być stosowana w różnych eksperymentach z transmisją synaptyczną. Ta metoda gradientowa, która opiera się na metodzie opracowanej przez Dunkley i wsp., ^3,4 jest subkomórkową procedurą frakcjonowania mózgu, która izoluje zarówno pre-, jak i postsynaptyczne pęcherzyki pochodzące z błony, które są ze sobą powiązane. Bez dalszego oczyszczania te SN są kompatybilne z różnymi technikami b...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nazwa odczynnika	Numer katalogowy	firmy	Uwagi (opcjonalnie)
Zestaw do oznaczania białek Micro BCA	Pierce	23235
CaCl2	Fisher	C79-500
CO2 gaz	Airgas (UW-MDS)	CD 50
EDTA	RPI	E57020
EtOH	Fisher	A407SK-4
HCl	Fisher	A142-212
Percoll	GE Opieka zdrowotna	17-0891-01
KH2PO4	Fisher	P285-500
PierceSDS-PAGE Zestaw do przygotowania próbki	Pierce	89888
NaCl	RPI	S23020
NaHCO3	Fisher	BP328-500
Na2PHO4	Fisher	S381-500
Sacharoza	RPI	S24060
Podstawa Tris RPI		T60040
Tetrodotoksyna	Sigma	T5651
Express Pro Label Mix S35 Easy Tag	Perkin Elmer	NEG772
Sprzęt	Numer katalogowy	firmy	Komentarze (opcjonalnie)
Narzędzia do preparacji
Homogenizator Dounce, 7 ml (w zestawie dwa szklane tłuczki z napisami "A" i "B")	Wheaton
P1000 Gilson Pipetman	Gilson	F123602
Wirówka Allegra 6KR	Beckman Coulter	366830
Wirnik GH 3.8, Wahliwy rotor kubełkowy	Beckman Coulter	360581
Wirówka Beckman J2-21	Beckman
Rurki Beckman z nakrętkami	Beckman	355672
Adaptery białościenne	Beckman	342327
Adaptery niebieskościenne	Beckman
JA-17 - Wirnik o stałym kącie nachylenia	Beckman	369691
Tabela przeciwciał stosowanych w przypadku zachodnich plam:
Nazwa firmy produkującej przeciwciała		Numer katalogowy	Gatunek żywiciela
i beta;-Actin	Sigma	A5441	mysz
GFAP	Santa Cruz	sc-65343	mysz
GP73	Santa Cruz	Sc-134509	królik
HSC70	Santa Cruz	sc-7298	mysz
Laminβ	Santa Cruz	Sc-6261	koza
Prohibitin	Santa Cruz	sc-28259	królik
PSD95	Mysz	MAB1596	miliporowa
SNAP25	AbCam	ab5666-100	królik
Synaptofizyna	Millipore	MAB368	mysz
i beta;-3-tubulina	Santa Cruz	sc-80016	mysz