Method Article

Otrzymywanie synaptoneurosomów z kory myszy przy użyciu nieciągłego gradientu gęstości perkolu i sacharozy

DOI:

10.3791/3196

⸱

September 17th, 2011

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin, 2Department of Biochemistry, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę przygotowania translacyjnie aktywnych, nienaruszonych synaptoneurosomów (SN) z kory mózgowej myszy. W metodzie wykorzystuje się nieciągły gradient gęstości perkolu i sacharozy, co pozwala na szybkie otrzymanie aktywnych SN.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synaptoneurosomy (SN) są uzyskiwane po homogenizacji i frakcjonowaniu kory mózgowej myszy. Są to ponownie uszczelnione pęcherzyki lub izolowane zakończenia, które odrywają się od zakończeń aksonów, gdy tkanka korowa jest homogenizowana. SN zachowują cechy pre- i postsynaptyczne, co czyni je przydatnymi w badaniu transmisji synaptycznej. Zachowują maszynerię molekularną wykorzystywaną w sygnalizacji neuronalnej i są zdolne do wychwytywania, przechowywania i uwalniania neuroprzekaźników.

Produkcja i izolacja aktywnych SN może być problematyczna przy użyciu pożywek takich jak Ficoll, które mogą być cytotoksyczne i wymagają przedłużonego wirowania ze względu na wysoką gęstość, oraz metod filtracji i wirowania, które mogą skutkować niską aktywnością z powodu mechanicznego uszkodzenia SN. Jednak zastosowanie nieciągłych gradientów gęstości perkolu i sacharozy do izolowania SN zapewnia szybką metodę uzyskania dobrych plonów aktywnych translacyjnie SN. Metoda gradientu perkolu i sacharozy jest szybka i delikatna, ponieważ wykorzystuje warunki izotoniczne, ma mniej i krótsze wirowanie oraz pozwala uniknąć etapów wirowania, które osadzają SN i powodują uszkodzenia mechaniczne.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowania1-4

  1. Przygotować 500 ml buforu gradientowego (GM), mieszając 50 ml 2,5 M zawiesiny sacharozy, 2,5 ml 1M Tris-HCl bulionu o pH 7,5 i 0,1 ml 0,5 m EDTA, pH 8,0 z wodą mili-Q do objętości. Filtruj wysterylizuj roztwór, podwielokrotność i przechowuj zamrożony.
  2. Przygotować 1000-krotny zapas tetrodotoksyny (TTX), sporządzając 1 mM roztwór w mili-Q H2O. Podwielokrotności TTX można przechowywać w temperaturze -20°C.
  3. Przygotuj 10x bufor stymulacyjny, sporządzając roztwór 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na2HPO4, 4 mM KH2PO4, 40 mM NaHCO3 i 800 mM NaCl w wodzie ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj nieciągły preparat gradientu perkolu i sacharozy jest szybką i niezawodną metodą izolowania aktywnych SN, która może być stosowana w różnych eksperymentach z transmisją synaptyczną. Ta metoda gradientowa, która opiera się na metodzie opracowanej przez Dunkley i wsp., 3,4 jest subkomórkową procedurą frakcjonowania mózgu, która izoluje zarówno pre-, jak i postsynaptyczne pęcherzyki pochodzące z błony, które są ze sobą powiązane. Bez dalszego oczyszczania te SN są kompatybilne z różnymi technikami b.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować B. K. Augustowi z University of Wisconsin-Madison Electron Microscope Facility za mikroskopię elektronową. Praca ta była wspierana przez granty NIH R01-DA026067 i P30-HD03352 (dla J.S.M.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nazwa odczynnika Numer katalogowy firmy Uwagi (opcjonalnie)
Zestaw do oznaczania białek Micro BCAPierce23235 
CaCl2FisherC79-500 
CO2 gazAirgas (UW-MDS)CD 50 
EDTARPIE57020 
EtOHFisherA407SK-4 
HClFisherA142-212 
PercollGE Opieka zdrowotna17-0891-01 
KH2PO4FisherP285-500 
PierceSDS-PAGE Zestaw do przygotowania próbkiPierce89888 
NaClRPIS23020 
NaHCO3FisherBP328-500 
Na2PHO4FisherS381-500 
SacharozaRPIS24060 
Podstawa Tris RPIT60040 
TetrodotoksynaSigmaT5651 
Express Pro Label Mix S35 Easy TagPerkin ElmerNEG772 
    
Sprzęt Numer katalogowy firmy Komentarze (opcjonalnie)
Narzędzia do preparacji   
Homogenizator Dounce, 7 ml (w zestawie dwa szklane tłuczki z napisami "A" i "B")Wheaton  
P1000 Gilson PipetmanGilsonF123602 
Wirówka Allegra 6KRBeckman Coulter366830 
Wirnik GH 3.8, Wahliwy rotor kubełkowyBeckman Coulter360581 
Wirówka Beckman J2-21Beckman  
Rurki Beckman z nakrętkamiBeckman355672 
Adaptery białościenneBeckman342327 
Adaptery niebieskościenneBeckman  
JA-17 - Wirnik o stałym kącie nachyleniaBeckman369691 

Tabela przeciwciał stosowanych w przypadku zachodnich plam:

Nazwa firmy produkującej przeciwciała Numer katalogowy Gatunek żywiciela
i beta;-ActinSigmaA5441mysz
GFAPSanta Cruzsc-65343mysz
GP73Santa CruzSc-134509królik
HSC70Santa Cruzsc-7298mysz
LaminβSanta CruzSc-6261koza
ProhibitinSanta Cruzsc-28259królik
PSD95MyszMAB1596miliporowa
SNAP25AbCamab5666-100królik
SynaptofizynaMilliporeMAB368mysz
i beta;-3-tubulinaSanta Cruzsc-80016mysz

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
  2. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic pr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

SynaptoneurosomesMouse CortexPercoll Sucrose GradientDensity Gradient CentrifugationSynaptosome IsolationWestern Blot AnalysisS35 Methionine IncorporationProtein Translation StudiesSynaptic Vesicle UptakeNeurotransmitter Release

Related Articles