Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie synaptoneurosomów z kory mózgu myszy z wykorzystaniem nieciągłego gradientu gęstości Percoll-sukroza

32K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3196

⸱

17 września 2011

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin, 2Department of Biochemistry, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę przygotowania translacyjnie aktywnych, nienaruszonych synaptoneurosomów (SNs) z kory mózgu myszy. Metoda ta wykorzystuje nieciągły gradient gęstości Percoll-sukroza, co umożliwia szybkie przygotowanie aktywnych SNs.

Streszczenie

Synaptonurosomu (SNs) otrzymuje się w wyniku homogenizacji i frakcjonowania kory mózgu myszy. Są to uszczelnione pęcherzyki lub odizolowane zakończenia, które oddzielają się od zakończeń aksonów podczas homogenizacji tkanki korowej. SNs zachowują cechy presynaptyczne i postsynaptyczne, co czyni je użytecznymi w badaniu przekaźnictwa synaptycznego. Zachowują one mechanizmy molekularne wykorzystywane w sygnalizacji neuronalnej oraz są zdolne do pobierania, magazynowania i uwalniania neurotransmiterów.

Produkcja i izolacja aktywnych SN mogą być problematyczne przy użyciu takich mediów jak Ficoll, który może być cytotoksyczny i wymagać przedłużonego wirowania ze względu na wysoką gęstość, a także przy zastosowaniu metod filtracji i wirowania, które mogą prowadzić do niskiej aktywności z powodu uszkodzeń mechanicznych SN. Jednak zastosowanie nieciągłych gradientów gęstości Percoll-sacharoza do izolacji SN stanowi szybką metodę pozwalającą na uzyskanie dobrej wydajności translacyjnie aktywnych SN. Metoda gradientu Percoll-sacharoza jest szybka i łagodna, ponieważ wykorzystuje warunki izotoniczne, wymaga mniejszej liczby krótszych cykli wirowania i pozwala uniknąć etapów wirowania prowadzących do sedymentacji SN i ich uszkodzenia mechanicznego.

Protokół

1. Przygotowania1-4

  1. Przygotować 500 mL buforu do medium gradientowego (GM), mieszając 50 mL zawiesiny sacharozy 2.5 M, 2,5 mL roztworu stokowego Tris-HCl 1 M o pH 7,5 oraz 0,1 mL roztworu stokowego EDTA 0,5 m o pH 8,0, uzupełniając objętość wodą milli-Q. Roztwór poddać sterylizacji przez filtrowanie, podzielić na alikwoty i przechowywać w zamrażarce.
  2. Przygotować 1000-krotny roztwór stokowy tetrodotoksyny (TTX), sporządzając roztwór 1 mM w wodzie milli-Q H2O. Alikwoty TTX można przechowywać w temperaturze -20°C.
  3. Przygotować 10-krotny bufor stymulujący, sporządzając w wodzie milli-Q roztwór zawierający 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na2HPO4, 4 mM KH2PO4, 40 mM NaHCO3 oraz 800 mM NaCl. Roztwór stokowy można przechowywać w temperaturze 4°C.
  4. Wychłodzić wirówki do 4°C.
  5. Przygotować roztwór stokowy izosmotycznego Percollu (SIP), dodając 9 objętości Percollu (18 mL) do 1 objętości sacharozy 2.5 M (2 mL) w wodzie milli-Q, a następnie dokładnie wymieszać.
  6. Przygotować warstwy gradientu 3%, 10%, 15% i 23%, dodając odpowiednie ilości SIP do buforu GM i mieszając każdą z nich:

Tabela gradientu z objętościami buforu GM i SIP do analizy danych eksperymentu chromatograficznego.

  1. Nalej warstwy gradientu, pipetując po 2 ml izoosmotycznych roztworów Percoll o stężeniach 23, 15, 10 i 3% do probówek z nakrętkami do wirówki Beckman, używając pipety P1000 Gilson Pipetman. Granica między warstwami powinna być wyraźnie widoczna, bez mieszania się roztworów. Przechowuj gradienty w temperaturze 4°C przez co najmniej 20 min przed użyciem. Gradienty można przechowywać do 24 godzin, choć zaleca się ich użycie w tym samym dniu. [Osoby z mniejszym doświadczeniem laboratoryjnym mogą ćwiczyć przygotowywanie gradientów, dodając niebieski barwnik do izoosmotycznych roztworów Percoll w celu wizualizacji granic między warstwami.]

2. Disekccja myszy 1

  1. Należy upewnić się, że wszystkie procedury związane z hodowlą i uśmiercaniem myszy są wykonywane zgodnie z wytycznymi NIH oraz uczelni. Uśmiercić młode myszy (wiek P13 do P21) poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla lub metodą zatwierdzoną w protokole dotyczącym zwierząt.
  2. Przymocować mysz do deski sekcyjnej i spryskać kark oraz głowę etanolem. Za pomocą ostrych nożyczek przeciąć rdzeń kręgowy u podstawy czaszki, usunąć skórę z górnej części czaszki, przeciąć czaszkę bocznie pomiędzy kością ciemieniową a kością międzyciemieniową lub pomiędzy obszarami mózgowia i kory. Następnie przeciąć czaszkę od podstawy do nosa (wzdłuż szwu strzałkowego), ostrożnie usunąć miękką kość ciemieniową, odsuwając każdą półkulę na bok, i usunąć korę za pomocą szpatułki. Wprowadzić szpatułkę do mózgu powyżej móżdżku, a następnie wybrać korę i umieścić ją w lodowatym buforze GM. Bezzwłocznie przejść do etapu homogenizacji. Nie pozostawiać kory w lodowatym buforze przez zbyt długi czas, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na tworzenie się SN.

3. Przygotowanie homogenatu i nadnadczyn 1-4

  1. Opłukać korę w lodowatym buforze GM i przenieść dwie części kory do szklanego homogenizatora Dounce zawierającego 5 mL zimnego buforu GM.
  2. Delikatnie zhomogenizować korę, wykonując 5-10 ruchów luźnym tłuczkiem (tłuczyk „A”), a następnie 5-10 ruchów ciasnym tłuczkiem (tłuczyk „B”). Ruchy powinny być szybkie, ale na tyle powolne, aby nie powodować powstawania pęcherzyków powietrza. Zdjęcie homogenatu po homogenizacji znajduje się w Schemacie 1. Liczba ruchów może się różnić w zależności od konkretnego homogenizatora i dołączonych tłuczyków. Po zakończeniu gradienty powinny wykazać wyraźny prążek SN; w przeciwnym razie należy dostosować liczbę ruchów.
  3. Przenieść homogenat do probówki stożkowej 15 mL i wirować przy 1000xg przez 10 min w temperaturze 4°C w rotorze z koszyczkami wahadłowymi (wirówka Allegra 6KR), aby odwirować resztki komórkowe i jądra. Zdjęcie odwirowanego homogenatu znajduje się w Schemacie 1.
  4. Nanieść 2 mL supernatantu na każdy gradient Percoll-cukru, zakręcić probówki i wirować przy 32 500xg przez 5 min w temperaturze 4°C w rotorze kątowym (wirówka Beckman J2-21, rotor JA-17), używając odpowiednich adapterów (patrz Tabela odczynników i sprzętu).
  5. Odessać i usunąć roztwór znajdujący się powyżej prążka SN za pomocą szklanej pipety Pasteura. Odessać prążek SN z interfejsu 15/23%, przenieść do probówki stożkowej i przechowywać w lodzie. Każdy gradient lub jedna część kory pozwoli uzyskać 0,9-1,1 mL SN.
  6. Dostosować stężenie soli w SN, dodając jedną dziesiątą objętości 10x buforu stymulującego, dodać 1000x CaCl2 do stężenia końcowego 12 nM oraz dodać roztwór stokowy 1 mM TTX do stężenia końcowego 1 μM w celu zahamowania niespecyficznego pobudzenia. (Dodanie CaCl2 jest opcjonalne, jeśli mogłoby ono zakłócić dalsze zastosowania SN).
  7. Oznaczyć stężenie białka w SN przy użyciu zestawu Micro BCA Protein Assay Kit. (Analiza białek metodą Bradforda nie jest zalecana ze względu na interferencję z Percollem).
  8. SN można wykorzystać bezpośrednio i szybko do badań nad translacją białek. W przypadku innych zastosowań lizat SN można oczyścić lub zagęścić przy użyciu zestawu Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit.

4. Reprezentatywne wyniki:

Po homogenizacji kory mózgu myszy i rozdzieleniu jej na nieciągłych gradientach Percoll-sacharozy (Schemat 1), zaobserwowano 6 prążków lub frakcji (Rysunek 1). Wcześniej wykazano dla kory mózgowej szczura3,5, że składnikami prążków o wysokiej masie cząsteczkowej były fragmenty błon i mielina, a materiał w osadzie zawierał mitochondria lub organelle (Tabela 1). Interfejs 23%/15% (Prążek 5) zawierał wzbogacone SNs.

Prążek na interfejsie 23%/15%, zawierający nienaruszone SN, został usunięty i poddany badaniu za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.2,6 EM wykazała obecność nienaruszonych pęcherzyków synaptycznych oraz zachowanie elementów presynaptycznych i postsynaptycznych (Rysunek 2). Izolacja przedziałów presynaptycznych i postsynaptycznych jest istotna dla badania sygnalizacji oraz syntezy białek, która zachodzi w obu tych przedziałach.7-13 Gradient Percoll-cukier pełni rolę wstępnego oczyszczania, dlatego w frakcji SN zaobserwowano niewielkie zanieczyszczenia komórkowe, jądrowe i organellowe, jednak ogólna separacja była dobra.

Analiza metodą Western blot wykazała, że frakcje Percoll zawierały oczekiwane markery białkowe, przy jednoczesnym wzroście czystości synaptycznej w prążku SN (Rysunek 3, Tabela 2). Markery synaptyczne i neuronalne zostały zachowane w wzbogaconym prążku SN (prążek 5), natomiast liczebność innych markerów uległa znacznemu zmniejszeniu. W szczególności obecność GFAP, markera astrocytów i komórek nowotworowych pochodzenia glejowego, oraz Lamin-B1, markera jądrowego, była pomijalna, podczas gdy markery strukturalne i synaptyczne zostały zachowane lub nasilone. Ponadto odnotowano obecność markerów organelli, takich jak mitochondria i aparat Golgiego, które odgrywają rolę w syntezie białek.

Typowe wydajności dla frakcji SN wynosiły 250-500 ng białka na μL, co określono za pomocą testu białkowego BCA. Aktywność SNs określono na podstawie ilości syntezy białek de novo, monitorowanej poprzez wbudowywanie [35S]-Met (Rycina 4).2 Bazowa aktywność translacyjna wzrosła 1,56-krotnie po stymulacji SNs za pomocą 50 μM glutaminianu/10 μM glicyny (Glu) lub 5,12-krotnie po aktywacji inhibitorem Pin1, juglonem. Znane jest, że inhibicja Pin1 prowadzi do zwiększenia syntezy białek.2 Aby potwierdzić, że wzrost wbudowywania [35S]-Met wynikał z syntezy białek de novo, dodano 40 μM anisomycyny, inhibitora syntezy białek, co spowodowało wyraźny spadek wbudowywania zarówno w obecności, jak i w przypadku braku Glu w porównaniu z poziomami bazowymi. Ponadto po dodaniu 2% Triton-X 100, który zaburza integralność SNs, translacja bazowa spadła o 75%.2 Dodatkowo, podczas badania frakcji (B4-B6), które wykazały największe wzbogacenie w markery synaptyczne, SNs lub frakcja 5 wykazały największą aktywność syntezy białek de novo (Rycina 5). Zatem nieciągłe gradienty Percoll-sukroza pozwalają na szybkie uzyskanie wysoce aktywnej i wzbogaconej frakcji SN, która może być wykorzystana do badania translacji białek.

Procedura z wykorzystaniem nieciągłego gradientu Percoll-cukier jest korzystniejsza od innych metod, ponieważ surowsze warunki powodują uszkodzenia mechaniczne. W porównaniu z metodą filtracyjną, w której oczyszczony homogenat kory przepuszczany jest przez serię filtrów o malejącej wielkości oczek,3,14-15 metoda z użyciem Percollu pozwala uzyskać więcej SN o większej aktywności. Jak pokazano na Rysunku 6, gdy aliquot SN przygotowanych metodą filtracyjną przepuszczono przez gradient Percoll-cukier, na granicy 15/23% stwierdzono znacznie mniej SN oraz większą ilość uszkodzonych membran. Podczas pomiaru syntezy białek de novo za pomocą wbudowywania S35-met, SN przygotowane metodą filtracyjną wykazały znacznie niższą aktywność (Rysunek 7). Aby zmaksymalizować aktywność translacyjną, wykorzystujemy myszy w wieku od P14 do P18. SN można przygotować z dorosłych myszy, jednak zaobserwowaliśmy znacząco zwiększoną aktywność translacyjną w przypadku SN przygotowanych z młodych myszy (Rysunek 8).

Rozkład komponentów komórkowych, tabela przedstawiająca frakcje z błonami, mielinę, synaptosomy, organelle.
Tabela 1. Składniki frakcji z przerwanych gradientów Percoll po homogenizacji kory mózgu myszy.3,5

Wykres rozkładu markerów białkowych; wyniki laboratoryjne wykazujące obecność białek w różnych prążkach.
Tabela 2. Podsumowanie analizy Western blot składników prążków z nieciągłego gradientu Percoll-sacharoza. Względne stężenia białek dla każdej z frakcji prążków wyizolowanych przy użyciu nieciągłego gradientu Percoll-sacharoza określono metodą Western blot. Brak białka (-), 0≥0,2 (+), 0,2≥0,8 (++), lub >0,8 (+++) razy więcej białka niż w supernatancie (S, odwirowany homogenat kory), reprezentatywnie dla n=3.

Schemat wycinania kory mózgu i wirowania; przedstawia homogenizację, gradienty Percoll, pasmo SN.
Schemat 1: Schemat przygotowania SN z wykorzystaniem nieciągłego gradientu gęstości Percoll-sukroza. Korę mózgu myszy wycięto, poddano homogenizacji, a następnie wirowano z niską prędkością w celu usunięcia niehomogenizowanej tkanki, komórek oraz całych organelli, takich jak jądra i błony. Gradient nieciągły powinien posiadać wyraźnie zdefiniowane warstwy. Wstawka na zdjęciu pokazuje przykład warstw, które zostały zafarbowane na niebiesko wyłącznie w celach ilustracyjnych, aby umożliwić wizualizację tych warstw. Nadfiltr nakłada się na nieciągły gradient Percoll-sukroza i wiruje z umiarkowaną prędkością. Następnie z gradientu odzyskuje się pasmo SN, które jest gotowe do użycia.

Schemat wirowania w gradiencie gęstości; rozdział białek, procentowe stężenia gradientu, identyfikacja pasm.
Rycina 1. Frakcjonowanie homogenatu w nieciągłym gradiencie Percoll-sukroza. Kora mózgu myszy została zhomogenizowana i rozdzielona w nieciągłym gradiencie Percoll-sukroza, co doprowadziło do powstania 6 pasm lub frakcji. Oczyszczone, aktywne SNs (*) znajdowały się w paśmie 5.

Obraz z mikroskopii elektronowej; analiza ultrastruktury komórki, organelle zaznaczone strzałkami.
Rysunek 2. Preparaty SN dają heterogenną mieszaninę synaps (SN), które zachowują elementy przedsynaptyczne i postsynaptyczne. Wykonano mikrofotografię elektronową preparatu SN otrzymanego z myszy C57BL/6 (wiek P13 do P21) zgodnie z wcześniejszym opisem, która pokazuje synapsy z zachowanymi elementami przedsynaptycznymi i postsynaptycznymi.2,6 Czerwone strzałki wskazują gęstości postsynaptyczne. Pasek skali wynosi 1 μm.

Schemat Western blot; analiza ekspresji białek β-Actin, GFAP, GP73 w frakcjach 1-6, S.
Rycina 3. Analizy Western blot preparatów SN wykazały, że markery synaptyczne i neuronalne zostały zachowane w oczyszczonych SN (frakcja 5), natomiast zawartość innych markerów była znacząco zredukowana. Immunobloty nadnadkładu (S, odwirowany homogenat kory) oraz frakcji 1-6 nieciągłego gradientu Percoll-sacharozy poddano analizie pod kątem obecności β-Actin (strukturalna, kontrola załadunku), GFAP (astrocytarny), GP73 (aparatu Golgiego), HSC70 (cytoplazmatyczny i jądrowy), Lamin-B1 (jądrowy), Prohibitin (mitochondrialny), PSD95 (gęstość postsynaptyczna), SNAP25 (synaptyczny), Synaptophysin (synaptyczny) oraz β3-Tubulin (specyficzny dla neuronów). Frakcje wizualizowano za pomocą obrazownika fosforowego Storm 860, wyniki reprezentatywne dla n=3.

Elektroforeza białek SDS-PAGE i wykres słupkowy wbudowywania S35-Met w celu analizy działania leków.
Rysunek 4. SN są aktywne i wykazują syntezę białek de novo poprzez wbudowywanie [35S]-Met. SN poddano wstępnej równowadze w temperaturze 37°C przez 10 min. Następnie SN pozostały nieleczone lub zostały poddane wstępnej inkubacji przez 15 min z 40 μM anisomycyną lub 1 μM juglonem w 37°C, po czym dodano [35S]-Met, 20 μl Express Pro Label Mix S35 Easy Tag, z dodatkiem lub bez dodatku Glu w 37°C przez 30 min. Próbki przygotowano przy użyciu Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, rozdzielono na 15% żelu poliakrylamidowym, wysuszono i poddano kwantyfikacji za pomocą fosforymageru Molecular Dynamics Storm 860; wyniki reprezentatywne dla n=3, ±SEM.

Wykres elektroforezy białek i wbudowywania S35-Met; prążki żelu, porównanie na wykresie słupkowym, kontekst Glu.
Rycina 5. Prążek 5 z nieciągłego gradientu Percoll-sacharoza zawierał najwyższe poziomy syntezy białek de novo. Prążki 4, 5 i 6 oraz nadsącz (S, odwirowany homogenat kory) poddano wstępnej inkubacji w temperaturze 37°C przez 10 min. Następnie dodano [35S]-Met (Express Pro Label Mix S35 Easy Tag), z dodatkiem lub bez dodatku Glu, i inkubowano w 37°C przez 30 min. Próbki przygotowano przy użyciu Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, rozdzielono na 15% żelu poliakrylamidowym, wysuszono i skwantyfikowano za pomocą fosforimageru Molecular Dynamics Storm 860; wyniki reprezentatywne dla n=3, ±SEM.

Proces oczyszczania białek w probówkach do ultrawirowania; rozdział osadu i nadsączu.
Rysunek 6. SN przygotowane metodą filtracji zawierają więcej uszkodzonych błon i mniej całych SN niż SN przygotowane metodą nieciągłego gradientu Percoll-sacharozy. SN przygotowano poprzez przepuszczenie homogenizatu kory przez serię filtrów o zmniejszającej się wielkości porów, zgodnie z wcześniejszym opisem.3,14-15 Alikwot SN przygotowanych metodą filtracji odwirowano nad nieciągłym gradientem Percoll-sacharozy i porównano z równoważną ilością materiału otrzymanego metodą nieciągłego gradientu Percoll-sacharozy.

Żel SDS-PAGE i wykres słupkowy przedstawiające analizę białek; wyniki filtracji w porównaniu z metodą Percoll w eksperymencie.
Rycina 7. SN-y przygotowane metodą filtracyjną wykazują mniejszą aktywność syntezy białek de novo niż SN-y przygotowane metodą nieciągłego gradientu Percoll-sacharoza. SN-y przygotowano poprzez przepuszczanie homogenizatu kory przez serię filtrów o malejącej wielkości porów zgodnie z opisem z poprzednich prac,3,14-15 oraz metodą nieciągłego gradientu Percoll-sacharoza. SN-y z obu preparatów poddano wstępnej ekwilibracji w temperaturze 37°C przez 10 min. Następnie dodano [35S]-Met (Express Pro Label Mix S35 Easy Tag), z dodatkiem lub bez dodatku Glu, w temperaturze 37°C przez 30 min. Próbki przygotowano przy użyciu Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, rozdzielono na żelu poliakrylamidowym 15%, wysuszono i skwantyfikowano za pomocą fosforymageru Molecular Dynamics Storm 860, wyniki reprezentatywne dla n=3, ±SEM.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym i wykres słupkowy; analiza syntezy białek, wbudowywanie S35-Met.
Rycina 8. Synaptosomy (SNs) z młodszych myszy (P14) wykazują większą aktywność translacyjną niż synaptosomy z myszy starszych (P85). SNs przygotowano z myszy w różnym wieku przy użyciu metody nieciągłego gradientu Percoll-sacharoza, inkubowano w temperaturze 37°C przez 10 min w celu równowagi, poddano działaniu Glu lub nie w obecności [35S]-Met (Express Pro Label Mix S35 Easy Tag) przez 30 min, zamrożono błyskawicznie, a następnie oczyszczono za pomocą Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit. Następnie SNs rozdzielono w 12% żelu SDS-poliakrylamidowym, osuszono i obrazowano na fosforimagerze Molecular Dynamics Storm 860; wyniki reprezentatywne dla n=3, ±SEM. SNs z myszy P14 były co najmniej 3-krotnie bardziej aktywne niż SNs z myszy P85.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tutaj przygotowanie nieciągłego gradientu Percoll-sacharoza jest szybką i niezawodną metodą izolacji aktywnych SN, które mogą być wykorzystane w różnorodnych eksperymentach nad transmisją synaptyczną. Ta metoda gradientowa, oparta na procedurze opracowanej przez Dunkley i wsp.,3,4 jest procedurą subkomórkowego frakcjonowania mózgu, która izoluje pęcherzyki pochodzące z błon presynaptycznych i postsynaptycznych, które są ze sobą powiązane. Bez dalszej puryfikacji te SN są kompatybilne z wieloma technika...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Pragniemy podziękować B. K. August z Electron Microscope Facility na University of Wisconsin-Madison za wykonanie mikroskopii elektronowej. Praca ta była finansowana z grantów NIH R01-DA026067 oraz P30-HD03352 (przyznanych J.S.M.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nazwa odczynnikaFirmaNumer katalogowyKomentarze (opcjonalnie)
Zestaw do analizy białek Micro BCA Protein Assay KitPierce23235 
CaCl2FisherC79-500 
Gaz CO2Airgas (UW-MDS)CD 50 
EDTARPIE57020 
EtOHFisherA407SK-4 
HClFisherA142-212 
PercollGE Healthcare17-0891-01 
KH2PO4FisherP285-500 
Zestaw do przygotowania próbek PierceSDS-PAGE Sample Prep KitPierce89888 
NaClRPIS23020 
NaHCO3FisherBP328-500 
Na2PHO4FisherS381-500 
SacharozaRPIS24060 
Tris w formie zasadyRPIT60040 
TetrodotoksynaSigmaT5651 
Mieszanina Express Pro Label Mix S35 Easy TagPerkin ElmerNEG772 
    
SprzętFirmaNumer katalogowyKomentarze (opcjonalnie)
Narzędzia do sekcji   
Homogenizator Dounce'a, 7 mL (wyposażony w dwa szklane tłuczki oznaczone jako "A" oraz "B")Wheaton  
Pipeta P1000 Gilson PipetmanGilsonF123602 
Wirówka Allegra 6KRBeckman Coulter366830 
Rotor GH 3.8, rotor z koszami wahadłowymiBeckman Coulter360581 
Wirówka Beckman J2-21Beckman  
Probówki Beckman z nakrętkamiBeckman355672 
Adaptery białeBeckman342327 
Adaptery niebieskieBeckman  
Rotor JA-17, rotor z kątem stałymBeckman369691 

Tabela przeciwciał użytych do western blotów:

Nazwa przeciwciałaFirmaNumer katalogowyGatunek gospodarza
β-aktynaSigmaA5441mysz
GFAPSanta Cruzsc-65343mysz
GP73Santa CruzSc-134509królik
HSC70Santa Cruzsc-7298mysz
LaminβSanta CruzSc-6261koza
ProhibitynaSanta Cruzsc-28259królik
PSD95MilliporeMAB1596mysz
SNAP25AbCamab5666-100królik
SynaptofizynaMilliporeMAB368mysz
β-3-tubulinaSanta Cruzsc-80016mysz

Bibliografia

  1. Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
  2. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis. Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).
  3. Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Res. 441, 59-71 (1988).
  4. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  5. Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes. J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).
  6. Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level. J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).
  7. Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow. Front. Neural Circuits. 3, (2009).
  8. Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis. Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).
  9. Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons. Neuron. 49, 349-356 (2006).
  10. Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation. J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).
  11. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity. J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).
  12. Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology. J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).
  13. Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry. J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).
  14. Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals. J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).
  15. Weiler, I. J., Greenough, W. T. Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes. Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).
  16. Billard, J. M. Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium. Magnes Res. 19, 199-215 (2006).
  17. Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice. Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).
  18. Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels. J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
  19. Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development. Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).
  20. Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo. Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).
  21. Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses. Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).
  22. Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus. J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).
  23. Weiler, I. J., Greenough, W. T. Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).
  24. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J. Anat. 96, 79-88 (1962).
  25. Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex. Cytometry A. 60, 90-96 (2004).
  26. Hajós, F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity. Brain Res. 93, 485-489 (1975).
  27. Bai, F., Witzmann, F. A. Synaptosome Proteomics. Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).
  28. Rao, A., Steward, O. Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes. J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).
  29. Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. Methods of Cell Separation. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).
  30. Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. High affinity uptake of L-glutamate and γ-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster. J. Biosci. 11, 119-135 (1987).
  31. Munteanu, L. S., Dinu, A. Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints. Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).
  32. Cell separation composition, kit and method. US patent. , 019713 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Gradient Percoll-SacharozaCentryfugacja w gradiencie gęstościIzolacja synaptosomówAnaliza Western blotWbudowywanie S35 metioninyBadania translacji białekPobieranie pęcherzyków synaptycznychUwalnianie neuroprzekaźników
Przygotowanie synaptoneurosomów z kory mózgu myszy z wykorzystaniem nieciągłego gradientu gęstości Percoll-sukroza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.