Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu ładunku w hodowanych astrocytach

Streszczenie

Źródło: Creighton, B. A., et al. Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film przedstawia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu ładunku w hodowanych astrocytach za pomocą fluorescencyjnej sondy kwasotropowej, która selektywnie znakuje kwaśne pęcherzyki endolizosomalne. Obrazowanie poklatkowe i akwizycja stosu Z za pomocą mikroskopu konfokalnego umożliwiają śledzenie fluorescencyjnie znakowanego ładunku w całej trójwymiarowej objętości komórki. Analiza odróżnia ładunek stacjonarny od ładunku przemieszczającego się w kierunku obrzeża komórki lub jądra, dostarczając informacji na temat dynamiki transportu wewnątrzkomórkowego.

Protokół

1. Transfekcja fluorescencyjnie znakowanych plazmidów

1. Dzień przed transfekcją lub etykietowaniem wysiewaj astrocyty o pożądanej gęstości do obrazowania 24−48 godzin po transfekcji. Zalecana gęstość dla płytek 24-dołkowych lub studzienek ze szklanym dnem o średnicy 14 mm wynosi 2 x 104 komórki/dołek.
   UWAGA: Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem transfekcji astrocytów posianych na szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm na płytkach 24-dołkowych lub studzienkach ze szklanym dnem o średnicy 14 mm przy użyciu metody opartej na lipofekcji. Odczynniki powinny być skalowane w zależności od wielkości naczynia hodowlanego, w którym rosną astrocyty.
2. Rozcieńczyć odczynnik do lipofekcji (tabela materiałów) w pożywce o zredukowanej surowicy (tabela materiałów). Aby zoptymalizować stosunek odczynnika do lipofekcji do DNA, należy przetestować szereg odpowiednich rozcieńczeń. Na przykład, jeśli używasz odczynnika zastosowanego w tym protokole (Tabela materiałów), rozcieńczyć 2, 3, 4 i 5 μl odczynnika do lipofekcji w 50 μl pożywki o obniżonej surowicy.
3. Rozcieńczyć 5 μg DNA o wysokiej czystości w 250 μl pożywki o zredukowanej surowicy. Dodać 5 μl odczynnika wzmacniającego lipofekcję (tabela materiałów). Połączyć probówkę zawierającą odczynnik do lipofekcji z równą objętością mieszaniny wzmacniacza DNA i lipofekcji. Mieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut.
4. Usuń pożywkę do hodowli astrocytów i dodaj mieszaninę transfekcyjną (krok 1.3) do komórek kroplami. Po 6-godzinnej inkubacji w temperaturze 37 °C i 5% CO2 należy zastąpić kompleks transfekcyjny odpowiednią objętością pożywki do hodowli astrocytów (2 ml dla naczyń ze szklanym dnem o średnicy 14 mm). Inkubuj przez dodatkowe 24−72 godziny przed przystąpieniem do akwizycji obrazu. Ściśle monitoruj czas trwania etapu inkubacji, aby osiągnąć najlepszą równowagę między ekspresją białka a żywotnością komórek.

2. Znakowanie późnych endosomów/lizosomów za pomocą sond fluorescencyjnych

UWAGA: Niektóre ładunki mogą być znakowane przy użyciu barwników fluorescencyjnych o wysokim powinowactwie do białek specyficznych dla ładunku. Poniższy przykład pozwala na znakowanie późnych endosomów/lizosomów za pomocą fluorescencyjnej sondy acidotropowej.

1. Rozcieńczyć sondę znakującą lizosomami (tabela materiałów) w 200 μl pożywki do hodowli astrocytów do stężenia roboczego 1 μM i zastosować do astrocytów z kroku 1.1 o gęstości 2 x 104 komórek/basenik. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
2. Umyj komórki raz ciepłym podłożem do hodowli astrocytów i zastąp je pożywką do obrazowania (tabela materiałów). Natychmiast przejdź do obrazowania na żywo.

3. Akwizycja obrazu za pomocą systemu obrazowania poklatkowego

UWAGA: Obrazowanie poklatkowe na żywo powinno być wykonywane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w szybką kamerę, określoną ostrość, komorę inkubacyjną i obiektyw olejowy 40x o dużej aperturze numerycznej (np. Plan-Apochromat 1.4NA). Dostępnych jest wiele programów do akwizycji obrazów poklatkowych. Wybór systemu mikroskopowego i oprogramowania do akwizycji powinien opierać się na ich dostępności i przydatności do celów konkretnego badania. Poniżej znajduje się kilka ogólnych wskazówek.

1. Umieść komorę lub naczynie hodowlane w odpowiednim adapterze na stoliku mikroskopu. Używając światła epifluorescencyjnego, wybierz komórkę (komórki), które wyrażają białka fluorescencyjne lub sondę do nagrania. Dostosuj oświetlenie próbki fluorescencyjnej, aby zobrazować wybrane komórki za pomocą aparatu cyfrowego. Unikaj używania wysokiego oświetlenia, które może powodować fotowybielanie i fototoksyczność. Dostosuj ostrość i powiększenie.
2. Rejestruj pojedyncze serie poklatkowe Z-stack z częstotliwością 1 klatki co 2 s w odstępach czasu od 300 s do 500 s za pomocą funkcji zoomu i określonego ostrości.
   UWAGA: Dynamika ruchu (prędkość, częstotliwość ruchu itp.) będzie się różnić w zależności od białka będącego przedmiotem zainteresowania, dlatego przebieg czasowy akwizycji może wymagać korekty. Na przykład mitochondria są mniej ruchliwe niż lizosomy i wykazują częste przerwy. W tym przypadku bardziej odpowiednie jest ustawienie parametrów akwizycji na 1 klatkę co 5 s przez 800 s.
3. Zapisuj obrazy poklatkowe i eksportuj je jako pliki stosu AVI lub TIFF.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zmodyfikowany klon Dulbecco's Eagle Medium	Gen	25-500
Płodowa surowica bydlęca	Gemini	100-106	Inaktywowana termicznie
FIDŻI (Fidżi to tylko obraz J)	NIH	Wersja 1.52i
Pęseta z cienką końcówką	FST	11254-20	Styl #5
Fluorescencyjne źródło światła	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
Naczynia ze szklanym dnem	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish | Nr 1.5 Szkiełko nakrywkowe | Średnica szkła 14 mm | Niepowlekane
kleszcze Graefe	FST	11054-10	Graefe Kleszcze do tęczówki z zakrzywionymi końcówkami
Zielony barwnik fluorescencyjny, który barwi kwaśne przedziały (późne endosomy i lizosomy)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26. Wstępnie rozpuszczony w DMSOS do roztworu podstawowego o wielkości 1 mM. Rozcieńczyć do końcowego stężenia roboczego w wybranym pożywce wzrostowej lub buforze.
Zrównoważony roztwór soli Hanka (10x)	Gibco	14065-056	Bez magnezu i wapnia
Media obrazowania	Technologie życia	A14291DJ	Roztwór do obrazowania żywych komórek
Odwrócony mikroskop konfokalny	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent	Life Technologies	11514015	Plus Reagent
Lipofection Reagent	Life Technologies	15338100	Odczynnik Lipofectamine LTX
Orbitalny inkubator wstrząsowy	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 , inkubator do wytrząsania orbitalnego z regulacją temperatury i prędkości
Roztwór penicyliny/strepomycyny (100x)	Gen Clone	25-512
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)	Gen Clone	25-507x
Bromowodorek poli-D-lizyny	Sigma	P7405	Rozpuścić w buforze Tris, pH 8,5, w 1mg/mL. Zamrażać do długotrwałego przechowywania. Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania
Zredukowana pożywka surowicy	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Kolby do kultur tkankowych	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. 100% kątowy dostęp do szyjki, hydrofobowa wentylowana nasadka filtra 0,22um
Inkubator do hodowli tkankowych	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, inkubator kultur tkankowych z kontrolą
temperatury, wilgotności i CO2Tris-Base	Sigma	T1503	8,402 g rozpuszczony do jednego litra w wodzie z 4,829 g Tris HCl w celu uzyskania 0,1 M buforu Tris, pH 8,5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4,829 g rozpuszczony do jednego litra w wodzie z 8,402 g Tris Base do wytworzenia 0,1 M buforu Tris, pH 8,5