Ten film przedstawia obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości bariery krew-mózg (BBB) przy użyciu mikroskopii konfokalnej, pokazując wycinki mózgu myszy barwione przeciwciałami w celu analizy składników BBB i struktur wewnątrzkomórkowych, mających zastosowanie do badania homeostazy mózgu, interakcji nerwowo-naczyniowych i dysfunkcji BBB związanej z chorobą.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Trójwymiarowe obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości bariery krew-mózg w wycinku mózgu myszy
754 wyświetleń
⸱
18 czerwca 2025
W tym artykule
Streszczenie
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
- Obrazowanie konfokalne bariery krew-mózg w wysokiej rozdzielczości
- Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą odpowiedniego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego (patrz tabela materiałów) z liniami laserowymi o długości fali 405, 488, 561 i 633 nm w celu wzbudzenia fluoroforów w niebieskich, zielonych, pomarańczowych i czerwonych obszarach widma światła. Do robienia zdjęć należy używać obiektywu olejowego 63X o aperturze numerycznej 1,4.
- W menu akwizycji oprogramowania sterującego mikroskopem ustaw parametry akwizycji obrazu. W menu "Rozmiar obrazu" wybierz wartość 1024 x 1024 pikseli. Zmodyfikuj rozmiar piksela do wartości od 200 do 300 nm, dostosowując wartość menu "Zoom"."
UWAGA: W przypadku analizy struktur wewnątrzkomórkowych zmniejsz rozmiar piksela do 75 nm. To ustawienie rozmiaru obrazu znacznie wydłuża czas akwizycji i można je zmniejszyć do 512 x 512 pikseli, aby skrócić czas akwizycji poprzez obrazowanie mniejszego pola widzenia. - W menu rozwijanym "Szybkość akwizycji" wybierz wartość 400 Hz, czyli 400 linii na sekundę. W menu "Ustawienia systemowe" wybierz menu rozwijane "Głębokość pikseli" i zmień wartość na 12 bitów.
- W oprogramowaniu mikroskopu, w zakładce "Akwizycja", włącz opcję sekwencyjnej akwizycji klatek. Ustaw grubość przekroju optycznego na wartość od 0,75 do 1 μm dla każdego kanału, modyfikując wartość w menu "Otworek".
- W panelu wzbudzenia fluorescencyjnego aktywuj laser wymagany do optymalnego wzbudzenia fluoroforów w próbce, na przykład linię laserową 488 nm dla fluoroforu emitującego zieleń.
UWAGA: Użyj przeglądarki widm fluoroforowych (patrz Tabela materiałów), aby wybrać odpowiedni laser wzbudzający. - W panelu detekcji fluorescencyjnej przesuń suwak, aby wybrać długości fal, które będą mierzone w każdym kanale, na przykład między 510 a 550 nm dla fluoroforu emitującego zieleń.
UWAGA: Użyj przeglądarki widm fluoroforowych (patrz Tabela materiałów), aby wybrać odpowiednie długości fal detekcji. - Dodaj kroplę olejku immersyjnego o współczynniku załamania światła 1,52 na wierzch szkiełka nakrywkowego z sekcją mózgu, aby dopasować współczynnik załamania szklanego szkiełka nakrywkowego i obiektywu. Umieść próbkę w mikroskopie i włącz lampę epifluorescencyjną, aby uwidocznić próbkę za pomocą lornetki mikroskopowej.
- Za pomocą przycisków na statywie mikroskopu zmień koło filtra, aby wybrać filtr odpowiedni do wizualizacji jąder barwionych DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol). Użyj zgrubnej ostrości, aby ustawić ostrość sygnału z jąder barwionych DAPI.
- Za pomocą przycisków na statywie mikroskopu zmień filtry, aby zobrazować sygnał z markerów naczyniowych (na przykład CollagenIV lub CD31) i wyśrodkować pole widzenia na pojedynczym segmencie naczyń włosowatych.
- Naciśnij przycisk, aby uruchomić tryb skanowania na żywo. Podczas skanowania dostosuj wzmocnienie i intensywność lasera dla każdego kanału, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny obrazów i uniknąć nasycenia pikseli.
UWAGA: Użyj tabeli przeglądowej, która oznacza nasycone piksele, aby wizualnie ocenić przesycenie. Aby uniknąć przesycenia sygnału, dostosuj ustawienia dla próbki, która ma mieć najwyższy sygnał fluorescencyjny. - Ustaw wartość uśredniania linii na 2.
UWAGA: W przypadku korzystania z wyższych prędkości akwizycji zwiększ tę wartość, aby zmniejszyć szum. - Ustal sekcje początkowe i końcowe do wykonywania optycznych stosów z, które obejmują całą objętość kapilary. Użyj rozmiaru kroku 0,45 μm.
UWAGA: Jeśli obrazy będą używane do późniejszej kwantyfikacji, zachowaj te same ustawienia akwizycji dla całego zestawu danych. - W celu oceny ilościowej należy pobrać od 10 do 20 stosów z na sekcję od co najmniej trzech różnych myszy w celu porównań statystycznych.
UWAGA: Uzyskaj pełny zestaw danych podczas tej samej sesji, aby zmniejszyć zmienność wynikającą z bielenia próbki i wahań intensywności lasera.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szczurzy klon przeciwciała monoklonalnego ER-MP12 przeciwko CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Etykiety Komórki śródbłonka mózguUżyj w rozcieńczeniu 1:100wykryć za pomocą poliklonalnej antyszczurzej IgG (H+L) osła w połączeniu z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanym w rozcieńczeniu 1:400 |
| Szczurze przeciwciało monoklonalne przeciwko systemom | badawczo-rozwojowym | MAB1556 | etykiety Światło naczyń włosowatychStosować w rozcieńczeniu 1:100wykryć poliklonalnym anty-szczurim IgG (H+L) osła w połączeniu z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanym w rozcieńczeniu 1:400 |
| Przeciwciało poliklonalne królika przeciwko CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Etykiety Błona podstawna naczyń włosowatychStosować w rozcieńczeniu 1:100wykryć poliklonalnym anty-króliczym IgG (H+L) osła sprzężonym z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanym w rozcieńczeniu 1:400 |
| Kozie przeciwciało poliklonalne przeciwko CD13 | Systemy badawczo-rozwojowe | AF2335 | Etykiety perycytyStosować w rozcieńczeniu 1:100wykryć za pomocą poliklonalnej anty-koziej IgG (H+L) osła w połączeniu z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanym w rozcieńczeniu 1:400 |
| Mysi klon przeciwciała monoklonalnego G-A-5 przeciwko GFAP sprzężony z Cy3 | Abcam | ab49874 | Etykiety AstrocytyStosować w rozcieńczeniu 1:100 |
| Przeciwciało poliklonalne królika przeciwko Iba-1 | Wako | 019-19741 | Etykiety MicrogliaStosować w rozcieńczeniu 1:100wykryć poliklonalnym anty-szczurzym IgG (H + L) osła sprzężonym z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanym w rozcieńczeniu 1:400 |
| Przeciwciało monoklonalne szczura ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Etykiety LizosomyStosować w rozcieńczeniu 1:100wykryć za pomocą poliklonalnej antyszczurzej IgG (H+L) osła sprzężonej z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanej w rozcieńczeniu 1:400 |
| Przeciwciało poliklonalne osła przeciwko mysiej IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Stosować w rozcieńczeniu 1:400 |
| Przeciwciało poliklonalne osła przeciwko mysiej IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Stosować w rozcieńczeniu 1:400 |
| Kozie przeciwciało poliklonalne przeciwko mysim IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Stosować w rozcieńczeniu 1:400 |
| Fluorescencyjne medium montażowe | Dako | S3023 | Dako Fluorescencyjny nośnik montażowy Laserowy |
| skaningowy mikroskop konfokalny | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X z detektorami HyD i laserem światła białego |
| Oprogramowanie do przetwarzania obrazu | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF wersja 3.1.0 build 8587 |
| Oprogramowanie do analizy obrazu | Bitplane scientific software | NA | Imaris wersja 7.6.5 build 31770 dla x64 |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |
