Trójwymiarowe obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości bariery krew-mózg w wycinku mózgu myszy

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Villaseñor, R i Collin. L. Obrazowanie konfokalne bariery krew-mózg w wysokiej rozdzielczości: obrazowanie, rekonstrukcja 3D i kwantyfikacja transcytozy. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film przedstawia obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości bariery krew-mózg (BBB) przy użyciu mikroskopii konfokalnej, pokazując wycinki mózgu myszy barwione przeciwciałami w celu analizy składników BBB i struktur wewnątrzkomórkowych, mających zastosowanie do badania homeostazy mózgu, interakcji nerwowo-naczyniowych i dysfunkcji BBB związanej z chorobą.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

Obrazowanie konfokalne bariery krew-mózg w wysokiej rozdzielczości
Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą odpowiedniego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego (patrz tabela materiałów) z liniami laserowymi o długości fali 405, 488, 561 i 633 nm w celu wzbudzenia fluoroforów w niebieskich, zielonych, pomarańczowych i czerwonych obszarach widma światła. Do robienia zdjęć należy używać obiektywu olejowego 63X o aperturze numerycznej 1,4.
W menu akwizycji oprogramowania sterującego mikroskopem ustaw parametry akwizycji obrazu. W menu "Rozmiar obrazu" wybierz wartość 1024 x 1024 pikseli. Zmodyfikuj rozmiar piksela do wartości od 200 do 300 nm, dostosowując wartość menu "Zoom"."
UWAGA: W przypadku analizy struktur wewnątrzkomórkowych zmniejsz rozmiar piksela do 75 nm. To ustawienie rozmiaru obrazu znacznie wydłuża czas akwizycji i można je zmniejszyć do 512 x 512 pikseli, aby skrócić czas akwizycji poprzez obrazowanie mniejszego pola widzenia.
W menu rozwijanym "Szybkość akwizycji" wybierz wartość 400 Hz, czyli 400 linii na sekundę. W menu "Ustawienia systemowe" wybierz menu rozwijane "Głębokość pikseli" i zmień wartość na 12 bitów.
W oprogramowaniu mikroskopu, w zakładce "Akwizycja", włącz opcję sekwencyjnej akwizycji klatek. Ustaw grubość przekroju optycznego na wartość od 0,75 do 1 μm dla każdego kanału, modyfikując wartość w menu "Otworek".
W panelu wzbudzenia fluorescencyjnego aktywuj laser wymagany do optymalnego wzbudzenia fluoroforów w próbce, na przykład linię laserową 488 nm dla fluoroforu emitującego zieleń.
UWAGA: Użyj przeglądarki widm fluoroforowych (patrz Tabela materiałów), aby wybrać odpowiedni laser wzbudzający.
W panelu detekcji fluorescencyjnej przesuń suwak, aby wybrać długości fal, które będą mierzone w każdym kanale, na przykład między 510 a 550 nm dla fluoroforu emitującego zieleń.
UWAGA: Użyj przeglądarki widm fluoroforowych (patrz Tabela materiałów), aby wybrać odpowiednie długości fal detekcji.
Dodaj kroplę olejku immersyjnego o współczynniku załamania światła 1,52 na wierzch szkiełka nakrywkowego z sekcją mózgu, aby dopasować współczynnik załamania szklanego szkiełka nakrywkowego i obiektywu. Umieść próbkę w mikroskopie i włącz lampę epifluorescencyjną, aby uwidocznić próbkę za pomocą lornetki mikroskopowej.
Za pomocą przycisków na statywie mikroskopu zmień koło filtra, aby wybrać filtr odpowiedni do wizualizacji jąder barwionych DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol). Użyj zgrubnej ostrości, aby ustawić ostrość sygnału z jąder barwionych DAPI.
Za pomocą przycisków na statywie mikroskopu zmień filtry, aby zobrazować sygnał z markerów naczyniowych (na przykład CollagenIV lub CD31) i wyśrodkować pole widzenia na pojedynczym segmencie naczyń włosowatych.
Naciśnij przycisk, aby uruchomić tryb skanowania na żywo. Podczas skanowania dostosuj wzmocnienie i intensywność lasera dla każdego kanału, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny obrazów i uniknąć nasycenia pikseli.
UWAGA: Użyj tabeli przeglądowej, która oznacza nasycone piksele, aby wizualnie ocenić przesycenie. Aby uniknąć przesycenia sygnału, dostosuj ustawienia dla próbki, która ma mieć najwyższy sygnał fluorescencyjny.
Ustaw wartość uśredniania linii na 2.
UWAGA: W przypadku korzystania z wyższych prędkości akwizycji zwiększ tę wartość, aby zmniejszyć szum.
Ustal sekcje początkowe i końcowe do wykonywania optycznych stosów z, które obejmują całą objętość kapilary. Użyj rozmiaru kroku 0,45 μm.
UWAGA: Jeśli obrazy będą używane do późniejszej kwantyfikacji, zachowaj te same ustawienia akwizycji dla całego zestawu danych.
W celu oceny ilościowej należy pobrać od 10 do 20 stosów z na sekcję od co najmniej trzech różnych myszy w celu porównań statystycznych.
UWAGA: Uzyskaj pełny zestaw danych podczas tej samej sesji, aby zmniejszyć zmienność wynikającą z bielenia próbki i wahań intensywności lasera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szczurzy klon przeciwciała monoklonalnego ER-MP12 przeciwko CD31/PECAM	Novus Biologicals	MCA2388	Etykiety Komórki śródbłonka mózguUżyj w rozcieńczeniu 1:100wykryć za pomocą poliklonalnej antyszczurzej IgG (H+L) osła w połączeniu z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanym w rozcieńczeniu 1:400
Szczurze przeciwciało monoklonalne przeciwko systemom	badawczo-rozwojowym	MAB1556	etykiety Światło naczyń włosowatychStosować w rozcieńczeniu 1:100wykryć poliklonalnym anty-szczurim IgG (H+L) osła w połączeniu z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanym w rozcieńczeniu 1:400
Przeciwciało poliklonalne królika przeciwko CollagenIV	Biotrend	BT21-5014-70	Etykiety Błona podstawna naczyń włosowatychStosować w rozcieńczeniu 1:100wykryć poliklonalnym anty-króliczym IgG (H+L) osła sprzężonym z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanym w rozcieńczeniu 1:400
Kozie przeciwciało poliklonalne przeciwko CD13	Systemy badawczo-rozwojowe	AF2335	Etykiety perycytyStosować w rozcieńczeniu 1:100wykryć za pomocą poliklonalnej anty-koziej IgG (H+L) osła w połączeniu z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanym w rozcieńczeniu 1:400
Mysi klon przeciwciała monoklonalnego G-A-5 przeciwko GFAP sprzężony z Cy3	Abcam	ab49874	Etykiety AstrocytyStosować w rozcieńczeniu 1:100
Przeciwciało poliklonalne królika przeciwko Iba-1	Wako	019-19741	Etykiety MicrogliaStosować w rozcieńczeniu 1:100wykryć poliklonalnym anty-szczurzym IgG (H + L) osła sprzężonym z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanym w rozcieńczeniu 1:400
Przeciwciało monoklonalne szczura ABL93 gainst LAMP2	Fitzgerald	10R-CD107BBMSP	Etykiety LizosomyStosować w rozcieńczeniu 1:100wykryć za pomocą poliklonalnej antyszczurzej IgG (H+L) osła sprzężonej z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanej w rozcieńczeniu 1:400
Przeciwciało poliklonalne osła przeciwko mysiej IgG (H+L) AlexaFluor594	LifeTechnologies	A21203	Stosować w rozcieńczeniu 1:400
Przeciwciało poliklonalne osła przeciwko mysiej IgG (H+L) AlexaFluor488	LifeTechnologies	A21202	Stosować w rozcieńczeniu 1:400
Kozie przeciwciało poliklonalne przeciwko mysim IgG (H+L) AlexaFluor555	LifeTechnologies	A21422	Stosować w rozcieńczeniu 1:400
Fluorescencyjne medium montażowe	Dako	S3023	Dako Fluorescencyjny nośnik montażowy Laserowy
skaningowy mikroskop konfokalny	Leica Microsystems	NA	Leica TCS SP8 X z detektorami HyD i laserem światła białego
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu	Leica Microsystems	NA	Leica Application Suite AF wersja 3.1.0 build 8587
Oprogramowanie do analizy obrazu	Bitplane scientific software	NA	Imaris wersja 7.6.5 build 31770 dla x64
Fluorescence SpectraViewer	ThermoFisher Scientific	NA	https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html

Podokaliksyna

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Powiązane artykuły