Podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu mysim

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Park, S. W., et al. Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy nabłonek barwnikowy siatkówki. J. Vis. Exp. (2015)

Film opisuje metodę podsiatkówkowego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) w modelu mysim. Szczegółowo opisano w nim procedurę, od znieczulenia i przygotowania oka po precyzyjne dostarczenie wektora lentiwirusowego, zapewniając integrację i ekspresję genów w RPE.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie zestawu do wstrzykiwań i wektorów wirusowych

Przygotuj mikrolitrową strzykawkę wyposażoną w igłę o sile 33 G, sterylizowaną przy użyciu gazowego tlenku etylenu. Rozcieńczyć wektory wirusowe w PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), aby uzyskać odpowiednie miano w mikroprobówce (tj. 1 x 10⁶ TU/μl). Przepłukać strzykawkę kilka razy wektorami wirusowymi, aby usunąć wszelkie martwe przestrzenie w strzykawce.

2. Podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych

Znieczulić dorosłe myszy (tj. w wieku 6-8 tygodni) za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny tiletaminy i zolazepamu (1:1, 2,25 mg/kg masy ciała) i chlorowodorku ksylazyny (0,7 mg/kg masy ciała) lub alternatywnego odpowiedniego schematu znieczulenia.
Rozszerz źrenice kroplą do oczu zawierającą fenylefrynę 0,5% i tropikamid 0,5%.
Przygotuj strzykawkę o pojemności mikrolitrów, ładując ją 1,5 - 2 μl wektorów wirusowych.
Otwórz powiekę i wysuń oko, aby odsłonić równik w celu wygodnego wstrzyknięcia. Skoncentruj się na nim pod mikroskopem operacyjnym. Należy utrzymać wysuniętą pozycję oka do momentu zakończenia wstrzyknięcia, w przeciwnym razie może dojść do przemieszczenia igły podczas wstrzyknięcia. Aby mocno przytrzymać gałkę oczną, umieść palce na zewnątrz krawędzi oczodołu.
Nałóż kroplę okulistycznego roztworu lepkosprężystego na powierzchnię rogówki.
Umieść mały okrągły szkiełko nakrywkowe na górze rogówki, aby uwidocznić siatkówkę.
Nakłuć mały otwór w lekkiej tylnej części rąbka za pomocą sterylnej igły 30 G 1/2 do dalszego wstrzykiwania podsiatkówkowego. Dla wygody otwór powinien być niższy dla prawego oka i górny dla lewego oka.
UWAGA: Jeśli otwór jest wykonany w okolicy skroniowej lub nosowej, trudno jest go zakryć powieką po wstrzyknięciu. Początkowe nakłucie powinno być wykonane nieco z tyłu rąbka, aby uniknąć naczyń rąbkowych, które biegną wzdłuż rąbka i mogą być łatwo rozpoznane. Uważaj, aby nie uderzyć soczewki igłą podczas wykonywania pierwszego nakłucia. Nie należy wkładać całego skosu igły, aby uniknąć przebicia soczewki.
Umieść igłę 33 G strzykawki mikrolitrowej przez wstępnie nakłuty otwór i zbliż igłę do przestrzeni podsiatkówkowej, aż poczujesz łagodny opór.
UWAGA: W przypadku wstrzyknięcia podsiatkówkowego najlepszy kąt podejścia igły wynosi około 45 stopni w stosunku do płaszczyzny tęczówki, a igłę należy popchnąć do tyłu w kierunku obszaru okołobrodawkowatego. Kropkowany kwadrat wskazuje sugerowaną drogę igły przez jamę ciała szklistego do wstrzyknięcia podsiatkówkowego na rycinie 1.
UWAGA: Podczas przekłuwania (lub przechodzenia) warstw siatkówki nie będzie odczuwalny żaden opór, ponieważ są one bardzo miękkie. Tak więc pierwsze uczucie łagodnego oporu wskazuje, że igła dotknęła już warstwy nabłonka RPE (nabłonek barwnika siatkówki) i należy przerwać wprowadzanie igły. Należy uważać, aby nie przeniknąć do tkanki twardówki z nadmiernym naciskiem, ponieważ igłę należy umieścić w potencjalnej przestrzeni podsiatkówkowej. Jeśli igła nakłuje tkankę twardówki przez nadmierną siłę, bez oporu wchodzi do przestrzeni oczodołu zewnątrzgałkowego. (Ten krok ma kluczowe znaczenie)
Wektory wirusowe należy delikatnie wstrzykiwać (np. 1 x 10⁶TU/μl) do przestrzeni podsiatkówkowej bez drżenia, aby uniknąć niepożądanego uszkodzenia tkanki. Następnie delikatnie wyjąć igłę. Podczas wstrzyknięcia należy mocno trzymać gałkę oczną, zgodnie z opisem w ppkt 2.4.
Pod mikroskopem operacyjnym należy obserwować powstawanie pęcherzyków podsiatkówkowych po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że nie ma krwawienia z siatkówki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1. Schemat ideowy wstrzyknięcia podsiatkówkowego. H&E (barwienie hematoksyliną i eozyną) barwiony H&E (barwienie hematoksyliną i eozyną) przekrój oka myszy przedstawiający struktury ze ścieżką igły do wstrzyknięcia podsiatków...