Obrazowanie mitochondrialnego stanu redoks w neuronach pierwotnych za pomocą wskaźnika ratiometrycznego

Streszczenie

Źródło: Katsalifis, A., et al. Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film pokazuje obrazowanie mitochondrialnego stanu redoks w neuronach pierwotnych przy użyciu ratiometrycznego wskaźnika fluorescencyjnego. Stosując dwie długości fal wzbudzenia pod mikroskopem fluorescencyjnym, mierzy się współczynnik intensywności fluorescencji w celu oceny utleniania mitochondriów. Protokół obejmuje stymulację N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) w celu indukowania napływu wapnia i produkcji reaktywnych form tlenu (ROS), a następnie kalibrację przy użyciu środków utleniających i redukujących w celu ilościowego określenia utleniania mitochondriów wywołanego przez NMDA.

Protokół

1. Ładowanie ogniw nadchloranem estru estru etylowego tetrametylorodaminy (TMRE)

UWAGA: W tym protokole TMRE jest używany w trybie bez wygaszania przy końcowym stężeniu 20 nM. Ogólnie rzecz biorąc, należy stosować najniższe możliwe stężenie TMRE, które nadal zapewnia wystarczającą intensywność sygnału pod wybranym mikroskopem. Ze względu na nierównomierne parowanie objętość podłoża w różnych studniach może się różnić w długoterminowych kulturach pierwotnych. Aby zapewnić stałe stężenie TMRE we wszystkich studzienkach, nie należy dodawać TMRE bezpośrednio do studzienek. Zamiast tego należy zastąpić pożywkę w każdym dołku taką samą ilością pożywki zawierającej TMRE. Poniższy protokół jest przeznaczony dla neuronów pierwotnych w 24-dołkowych płytkach zawierających ~ 1 ml pożywki na dołek.

1. Pracując w okapie z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych, zbierz 500 μl pożywki z każdej studzienki do jednej stożkowej probówki.
2. Na dołek dodać 0,5 μl 20 μM wywaru TMRE do stożkowej probówki (np. 12 μL na 24 dołki).
3. Ostrożnie odessać pozostałą pożywkę z pierwszego dołka i zastąpić ją 500 μl pożywki zawierającej TMRE. Kontynuuj, dobrze po klęsce, z pozostałymi studzienkami.
   UWAGA: Uważaj, aby nie dopuścić do wyschnięcia komórek i nie przeszkadzać komórkom.
4. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze i odczekaj co najmniej 60 minut na wyrównanie barwnika.
   UWAGA: Czas ładowania można wydłużyć do kilku godzin bez negatywnych skutków.
5. Aby zapewnić stałe stężenie i równowagę TMRE podczas całego eksperymentu obrazowania, należy uwzględnić końcowe stężenie 20 nM TMRE w buforze obrazowania i wszystkich roztworach stymulacyjnych.

2. Optymalizacja ustawień skaningowego mikroskopu konfokalnego

UWAGA: Ten krok ma na celu znalezienie najlepszego kompromisu między jakością obrazu a żywotnością komórek podczas obrazowania na żywo. W tej sekcji opisano optymalizację ustawień obrazowania białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redukcję i utlenianie (roGFP). Jeśli przeprowadzane jest obrazowanie wieloparametryczne, należy przeprowadzić podobną optymalizację, w tym sprawdzenie, czy linia bazowa jest stabilna bez oznak bielenia lub fototoksyczności, w odniesieniu do dodatkowych wskaźników.

1. Uruchom mikroskop konfokalny i załaduj standardowe ustawienia do obrazowania GFP (wzbudzenie 488 nm, emisja 505 - 550 nm).
2. Ustaw detektor na 12 bitów lub 16 bitów. nuta: Zwykle 8 bitów nie wystarcza do obrazowania ilościowego.
3. Aktywuj tryb skanowania sekwencyjnego i dodaj drugą sekwencję/ścieżkę (wzbudzenie 405 nm, emisja 505 - 550 nm).
4. Dla obu kanałów wybierz tabelę wyszukiwania pseudokolorów, która wskazuje prześwietlone i niedoświetlone piksele (np. GLOW OU).
5. Wybierz obiektyw, który jest odpowiedni dla interesującego Cię obiektu.
   UWAGA: 10x-40x są odpowiednie do analizy pojedynczych komórek, 63x-100x są odpowiednie do analizy pojedynczych mitochondrionów.
6. Zamontuj szkiełko nakrywkowe z komórkami w komorze obrazowania, dodaj 1 ml buforu do obrazowania i umieść komorę na mikroskopie.
7. Użyj okularu i światła przechodzącego, aby ustawić ostrość komórek.
   UWAGA: Nie używaj światła epifluorescencyjnego do lokalizowania i skupiania komórek. Nawet przy niskiej mocy wpłynie to niekorzystnie na ogniwa.
8. Nagrywaj obrazy w różnych formatach pikseli. Na podstawie tych obrazów wybierz najniższą liczbę pikseli, która daje akceptowalną rozdzielczość interesującej Cię struktury.
   UWAGA: Zazwyczaj 512 x 512 pikseli dobrze sprawdza się w obrazowaniu pojedynczych komórek z obiektywami 20x i 40x, a piksele 1024 x 1024 lub 2048 x2048 zwykle dobrze sprawdzają się w obrazowaniu pojedynczych mitochondriów z obiektywem 63x.
9. Nagrywaj obrazy o różnych rozmiarach otworków. Na podstawie tych obrazów wybierz największy rozmiar otworka, który daje akceptowalną rozdzielczość interesującej Cię struktury.
   UWAGA: Zazwyczaj dobrze sprawdza się 3-7 przewiewnych jednostek.
10. Rejestruj obrazy o różnej intensywności lasera.
    1. Dostosuj odpowiednio wzmocnienie i próg detektora. Na podstawie tych obrazów wybierz najniższą intensywność lasera, która zapewnia akceptowalną intensywność sygnału i stosunek sygnału do tła.
       1. Aby określić stosunek sygnału do tła, zmierz intensywność sygnału w obszarze zainteresowania (ROI), który zawiera komórki lub mitochondria (ROI1) oraz w ROI bez komórek lub mitochondriów (ROI2). Następnie podziel intensywność ROI1 przez intensywność ROI2.
          >UWAGA: Celuj w stosunek sygnału do tła wynoszący >3 i intensywności sygnału poszczególnych ROI wynoszące 200-1,000 dla wzbudzenia 405 nm z 1-3% mocą lasera i intensywnością indywidualnych ROI 300-1,500 dla wzbudzenia 488 nm z 1% mocą lasera.
11. Rejestruj obrazy z różnymi prędkościami skanowania i średnią liczbą klatek. Nagraj 4-5 obrazów dla każdej kombinacji ustawień. Na podstawie tych serii obrazów wybierz najwyższą szybkość i najniższe średnie ustawienia, które zapewniają akceptowalny szum obrazu i zmienność między obrazami.
    UWAGA: Szybkość skanowania 600 Hz i 1-2 klatki do uśredniania sprawdzają się w większości przypadków.
12. Korzystając z nowego szkiełka nakrywkowego, nagraj serię poklatkową ze zoptymalizowanymi ustawieniami.
    UWAGA: Czas trwania i interwał obrazu serii powinny być podobne do tych z planowanych eksperymentów.
13. Na koniec serii filmów poklatkowych dodaj 1 ml 2x roztworu diamidu (DA) do komory nagraniowej. Obraz przez dodatkowe 2 minuty.
14. Odessać bufor obrazowania za pomocą pompy perystaltycznej lub pipety ręcznej. Dodać 1 ml 1x roztworu ditiotreitolu (DTT). Obraz przez dodatkowe 5 minut.
15. Przeanalizuj eksperyment poklatkowy.
    1. Sprawdź, czy żaden z dwóch kanałów nie jest nadmiernie lub niedostatecznie naświetlony podczas obróbki DA i DTT przy zoptymalizowanych ustawieniach.
    2. Upewnij się, że żaden z dwóch kanałów nie wykazuje znacznego wybielenia podczas nagrywania poklatkowego; dąż do utraty intensywności <2% między pierwszym a ostatnim obrazem.
    3. Sprawdź, czy stosunek 405:488 nie zmienia się znacząco podczas obrazowania.
16. Powtórz całą procedurę w sposób iteracyjny, używając kilku szkiełek nakrywkowych, aż zostaną zdefiniowane ustawienia, które konsekwentnie zapewniają akceptowalne wyniki.

3. Ocena podstawowego stanu redoks

1. Uruchom mikroskop i załaduj zoptymalizowane ustawienia z sekcji 2.
2. Ustaw średnią klatek na 3-5.
3. Zamontuj szkiełko nakrywkowe z komórkami w komorze obrazowania, dodaj 1 ml buforu do obrazowania i umieść komorę na mikroskopie.
4. Użyj okularu i światła przechodzącego, aby ustawić ostrość komórek.
   UWAGA: Nie używaj światła epifluorescencyjnego do lokalizowania i skupiania komórek. Nawet przy niskiej mocy wpłynie to niekorzystnie na ogniwa.
5. Przełącz się w tryb skanowania i użyj kanału 488 nm w podglądzie na żywo, aby ustawić ostrość i zlokalizować komórki do obrazowania.
6. Użyj funkcji wielopunktowej, aby wybrać 3-5 pól widzenia na szkiełku nakrywkowym.
7. Nagraj obraz linii bazowej.
8. Dodać 1 ml 2x roztworu DA do komory.
9. Po 1, 2 i 3 minutach użyj podglądu na żywo, aby potwierdzić/dostosować ostrość, a następnie nagraj obraz.
   UWAGA: Komórki są zwykle w pełni utlenione po 2 minutach.
10. Zastąp bufor w komorze obrazowania 1 ml roztworu 1x DTT.
11. Po 3 i 5 minutach użyj podglądu na żywo, aby potwierdzić/dostosować ostrość, a następnie nagraj obraz.
    UWAGA: Komórki są zwykle całkowicie redukowane po 4-5 minutach.

4. Obrazowanie na żywo ostrych terapii

UWAGA: Poniższy protokół opisuje obrazowanie odpowiedzi mitochondrialnej redoks na leczenie NMDA. Interwały między obrazami i czas trwania eksperymentu mogą wymagać dostosowania do innych metod leczenia.

1. Uruchom mikroskop i załaduj zoptymalizowane ustawienia z sekcji 3.
2. Ustaw interwał poklatkowy na 30 s, a czas trwania na 25 minut.
3. Zamontuj szkiełko nakrywkowe z komórkami w komorze obrazowania, dodaj 1 ml buforu do obrazowania i umieść komorę na mikroskopie.
   UWAGA: Aby uniknąć dryfu ostrości termicznej, pozostaw komórki na stoliku mikroskopu na 10-15 minut przed rozpoczęciem obrazowania poklatkowego.
4. Użyj okularu i światła przechodzącego, aby ustawić ostrość komórek.
   UWAGA: Nie używaj światła epifluorescencyjnego do lokalizowania i skupiania komórek. Nawet przy niskiej mocy wpłynie to niekorzystnie na ogniwa.
5. Przełącz się w tryb skanowania i użyj kanału 488 nm w podglądzie na żywo, aby ustawić ostrość i zlokalizować komórki do obrazowania.
6. Opcjonalnie: Aby zwiększyć liczbę rejestrowanych komórek w przebiegu, użyj funkcji wielopunktowej, aby zobrazować 2-3 pola widzenia na szkiełko nakrywkowe.
7. Rozpocznij akwizycję poklatkową i zapisz 5 zdjęć jako 2-minutowe nagranie bazowe.
8. Dodaj 500 μL 3x roztworu NMDA do komory (końcowe stężenie 30 μM) i zapisz dodatkowe 20 obrazów jako 10-minutową odpowiedź NMDA.
   UWAGA: Neurony są bardzo wrażliwe na zmiany osmolarności. Dlatego należy zminimalizować parowanie bufora obrazowania. W przypadku dłuższych zabiegów komora obrazowania powinna być przykryta pokrywą.
9. Dodaj 500 μL roztworu 4x DA do komory i zapisz 6 dodatkowych obrazów (maksymalna kalibracja 3 minuty).
10. Odessać bufor z komory obrazowania i zastąpić go 1 ml 1x roztworu naziemnej telewizji cyfrowej. Zarejestruj jeszcze 10 obrazów (minimalna kalibracja 5 minut).
11. Zakończ nagrywanie i zapisz serię obrazów.

Materiały