Mikroiniekcja mózgu gryzoni za pomocą mikroigły kwarcowej

Streszczenie

Źródło: Paolone, G., et al. Spersonalizowane igły do mikroiniekcji w mózg gryzoni. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film przedstawia wstrzyknięcie mikroigłowe do mózgu gryzonia za pomocą mikroigły kwarcowej z otworami. Mikroigła jest podłączona do strzykawki i mikropompy w celu kontrolowania szybkości podawania. Igła z roztworem do wstrzykiwań jest wprowadzana do mózgu z prędkością podawania ustawioną na niską. Po ustawieniu zwiększa się szybkość dostawy. Igła jest wycofywana po krótkiej przerwie.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie igieł kwarcowych

1. Oczyść i wysterylizuj kapilary kwarcowe (patrz Tabela materiałów), umieszczając je na 5 minut w wodzie destylowanej, 5 minut w etanolu 99% i 5 minut w eterze dietylowym.
2. Pozostaw naczynka pod maską na co najmniej 1 godzinę, aby całkowicie wyschły.
3. Igły należy przygotować za pomocą ściągacza laserowego według parametrów pozwalających na wyprodukowanie odpowiednio długiej, odpowiednio cienkiej igły, w zależności od indywidualnych potrzeb.
   UWAGA: Używamy ściągacza laserowego (patrz Tabela Materiałów). Użyj programu dwuliniowego do ciągnięcia. Pierwsza linia wykorzystuje dużą moc, największą długość skanowania (odpowiadającą WARTOŚCI FILAMENTU) i nie wykorzystuje siły ciągnącej. Ta kombinacja parametrów prowadzi do stopienia największej części kapilary przy najmniejszej prędkości rozciągania, co pozwala na ukształtowanie długiej igły o dużym rozmiarze wewnętrznym/zewnętrznym i zredukowanym trzpieniu. W ten sposób igła zachowuje wysoką odporność mechaniczną i szeroką średnicę wewnętrzną, która umożliwia przejście komórek macierzystych lub cząstek wirusa bez zapychania. Prędkość i opóźnienie tej linii programu powinny zatrzymać wydłużenie kapilary, zanim końcówka stanie się zbyt mała i długa, tracąc wymagane właściwości mechaniczne i kształtowe. Druga linia programu ciągnącego jest wykonywana automatycznie po ostygnięciu kwarcu (5 s). Parametry mocy, filamentu i siły ciągnącej są funkcjonalne do cięcia końcówki o jak najkrótszej długości końcówki i stromym trzpieniu, unikając rozdzielenia dwóch igieł przy zerwaniu końcówki. Rutynowo, z naszym sprzętem, używamy: (a) Linia 1 = moc 990, żarnik 5, prędkość 130, opóźnienie 110, ciągnięcie 0; (b) Linia 2 = moc 970, żarnik 3, prędkość 0, opóźnienie 70, pociągnięcie 0.
4. Umieść igły na szalce Petriego uprzednio oczyszczonej 70% etanolem.
   1. Przykryj naczynie plastikową folią parafinową.
5. Przeciąć naczynia włosowate za pomocą mikro-dysektora.
   1. Podczas uruchamiania pozwól laserowi uruchomić proces autokalibracji, aby zweryfikować moc i dostarczaną energię. Następnie należy ustawić parametry cięcia.
      UWAGA: Używamy mikrodyssektora (patrz Tabela Materiałów) i następujących parametrów: energia impulsu mocy lasera (63 μJ), średnica wiązki laserowej 20% maksymalnej apertury (maksymalna apertura: 1,0 μm) oraz prędkość cięcia 10% maksymalnej prędkości (maksymalna prędkość: 30 μm/s).
   2. Mocno przymocuj igłę do stołu mikroskopu i umieść jej końcówkę na środku ekranu komputera.
   3. Na pasku menu kliknij ikonę ołówka i użyj jej, aby narysować znak do laserowego cięcia igły.
      UWAGA: Cięcie powinno odbywać się pod kątem około 45° w stosunku do powierzchni igły.
   4. Na pasku bocznym należy wybrać flagę zawierającą przycisk "START CUT", aby umożliwić laserowi przecięcie wcześniej zaznaczonego miejsca.
   5. W razie potrzeby należy wyciąć boczny otwór(y), powtarzając procedury opisane w ppkt 1.5.2-3; nie ma potrzeby zmiany położenia igły (Rysunek 1).
6. Czyszczenie po cięciu.
   1. Podłącz igłę do pompy próżniowej przez plastikową rurkę.
   2. Włącz pompę i ręcznie ustaw natężenie przepływu do przodu na umiarkowaną prędkość (3 μl/min).
   3. Najpierw odessaj 99% etanol, a następnie wodę destylowaną, aby usunąć zanieczyszczenia spowodowane cięciem.
   4. Ponownie odessaj 99% etanol, aby ułatwić suszenie.
      UWAGA: Każdy etap powinien trwać co najmniej 3 minuty.
7. Igły należy przechowywać na odpowiednio przykrytej szalce Petriego do dnia zabiegu.
8. Igły mogą być ponownie użyte; na koniec eksperymentu oczyścić je wybielaczem i etanolem, aby usunąć roztwór i ewentualne pozostałości tkanek. Aby uzyskać pełniejsze czyszczenie, umieść igły w słoiku do przechowywania mikropipet końcówką skierowaną w dół, napełnij słoik wodą destylowaną, aż końcówki zostaną przykryte, gotuj przez 1,5 minuty, aby usunąć resztki tkanki, a następnie umyj etanolem.

2. Procedura

1. Postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi pompy, wybierz menu ustawień, aby skalibrować pompę zgodnie ze średnicą/objętością strzykawki do mikroiniekcji i ustaw natężenie przepływu na 0,3 μl/min.
2. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml wyposażoną w igłę (np. igłę Hamiltona, 30 G) i krótką rurkę z politetrafluoroetylenu sterylną wodą i użyj jej do napełnienia strzykawki do mikroiniekcji (po bardzo ostrożnym wyjęciu tłoka) oraz zestawu części zespołu do wtrysku do ręcznej pompy do mikroiniekcji (MMP).
   UWAGA: Zestaw MMP służy do bezpiecznego zamocowania igły w ramce stereotaktycznej (Rysunek 2). Zestaw zawiera rurkę z politetrafluoroetylenu, złączkę typu luer-to-tubing, uchwyt na pipety oraz uszczelki do pipet o różnych średnicach zewnętrznych.
3. Podłączyć igłę do zestawu MMP.
   1. Przepłucz więcej wody przez strzykawkę 10 ml i sprawdź, czy woda wypływa z igły.
      UWAGA: Upewnij się, że usunąłeś wszelkie pęcherzyki powietrza z wnętrza systemu, powtarzając kroki napełniania.
4. Odłączyć strzykawkę o pojemności 10 ml od strzykawki do mikroiniekcji, powoli popychając tłok, aby pozostawić kroplę wody w górnej części strzykawki do mikroiniekcji. Włożyć tłok do strzykawki do mikroiniekcji.
5. Podłączyć strzykawkę do mikroiniekcji do pompy i ustawić natężenie przepływu na 0,3 μl/min.
   UWAGA: Poczekaj, aż kropla zacznie wyciekać z końcówki igły, a następnie pozwól jej puścić przez kolejne 3 minuty.
6. Ustaw przepływ na 0,1 μl/min i rozpocznij zabieg chirurgiczny. Pompa powinna być uruchomiona podczas wykonywania zabiegu.
   UWAGA: Do eksperymentów opisanych w tym artykule używamy samców szczurów Sprague Dawley o wadze 300 g (w wieku 3 miesięcy). Procedura ta ma jednak zastosowanie do innych gatunków, w szczególności myszy.
7. Znieczulenie ogólne należy wywołać metodą zatwierdzoną przez lokalne przepisy.
   UWAGA: Używamy mieszanki iniekcji dootrzewnowej (i.p.) 85 mg/kg ketaminy i 8 mg/kg ksylazyny przez 20-50 minut znieczulenia. Ważne jest, aby użyć szczypania ogona i/lub palców u nóg, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni uspokojone. Poziom znieczulenia i podstawowe parametry życiowe są oceniane przed rozpoczęciem operacji i monitorowane co 10 minut podczas wykonywania operacji. Temperatura ciała zwierzęcia jest utrzymywana na stałym poziomie przed, w trakcie i po zabiegach chirurgicznych za pomocą poduszki grzewczej z recyrkulacją wody. Zwierzęta są monitorowane do czasu całkowitego wyzdrowienia (np. są wyprostowane i chodzą w ruchu). Ponadto zwierzęta otrzymują leki przeciwbólowe (tramadol, 5–7 mg/kg i.p.) po operacji co 24 godziny przez trzy dni.
   1. Ogol głowę zwierzęcia i odpowiednio przygotuj miejsce operacji do aseptycznej operacji. Wykonaj dwuetapowy peeling roztworem na bazie jodu (Betadine), a następnie 70% etanolem. Ponadto, aby utrzymać aseptykę, owiń miejsce operacji serwetą chirurgiczną (w filmie zostało pominięte w celach demonstracyjnych).
8. Umieść szczura w ramce stereotaktycznej na kocu grzewczym z recyrkulacją wody. Aby zapewnić dodatkową ulgę w bólu, w miejscu zabiegu należy zastosować 0,5% roztwór lidokainy (nie przekraczać 7 mg/kg). Wstępnie wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą sterylizatora perełkowego lub płynnej dezynfekcji na zimno, zanurzając sprzęt w 2% aldehydzie glutarowym i 7,05% fenolu (sporodycynie lub Cidex), a następnie spłucz sterylną wodą lub solą fizjologiczną. Dezynfekcja musi być wykonywana nawet między zabiegami. Wykonaj podłużne nacięcie nad czaszką za pomocą wysterylizowanego skalpela. Bądź delikatny, aby uniknąć nadmiernego krwawienia. Otwórz skórę głowy za pomocą płaskiej szpatułki i przyłóż klipsy chirurgiczne do płatów skóry, aby pozostała otwarta. Bardzo delikatnie odłącz okostną, aby odsłonić bregmę i obszar czaszki, przez który zostanie wprowadzona igła.
9. Zamontuj ramię na ramie stereotaktycznej (podczas gdy przepływ jest w toku) i przesuń końcówkę igły dokładnie na wierzch bregmy, zwracając uwagę, aby nie złamać jej końcówki. Opisz współrzędne przednio-tylne i środkowo-boczne bregmy i przetłumacz na żądane współrzędne. Prowadzony przez stereomikroskop opuść igłę, aż jej końcówka prawie dotknie czaszki, zaznacz miejsce wiercenia po lekkim podniesieniu ramienia stereotaktycznego.
10. Wywierć (końcówka wiertła Ø: 0,8 mm; prędkość wiercenia: 1 000 obr./min) czaszkę w zaznaczonym miejscu. Należy uważać, aby nie przebić opony twardej podczas wiercenia. Podczas wiercenia należy wlać sterylną sól fizjologiczną, aby uniknąć uszkodzenia kości i martwicy.
11. Wytnij mały kawałek plastikowej folii parafinowej i umieść go na czaszce. Za pomocą pipety o pojemności 10 μl przygotować kroplę roztworu do wstrzyknięcia na plastikową folię parafinową. Zatrzymać pompę, lekko odsunąć popychacz pompy i wytworzyć mały pęcherzyk powietrza w kapilarze, delikatnie pociągając za tłok strzykawki do mikroiniekcji.
12. Opuść ramię stereotaktyczne, aż końcówka igły dotrze do kropli. Pobrać próbkę, pociągając (bardzo powoli) za tłok strzykawki do mikroiniekcji, unikając tworzenia się pęcherzyków. Wymienić popychacz pompy w kontakcie z tłokiem i włączyć pompę przy natężeniu przepływu 0,3 μl/min. Poczekaj, aż utworzy się kropla (kilka minut), zanim przejdziesz do następnego kroku.
    UWAGA: W niniejszym przykładowym eksperymencie sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) został wlany do prążkowia [AP (przednio-tylny): +1,5, ML (przyśrodkowo-boczny): ±2,7; DV (grzbietowo-brzuszne): -5,0] i w grzbietowym hipokampie (AP: -3,5, ML: ±2,1; DV: -3,5; w mm od opony twardej), 2 μl/miejsce. Aby ułatwić porównanie między dwiema metodami wstrzykiwania, każdy obszar mózgu podawano za pomocą igły kwarcowej w jednej półkuli i końcówki 26 G lub igły ze stali nierdzewnej ze skośną końcówką 30 G w drugiej.
13. Zmniejsz przepływ do 0,1 μl/min, nacinaj oponę twardą igłą ze skośną końcówką ze stali nierdzewnej i powoli opuść ramię stereotaktyczne na osi grzbietowo-brzusznej, wchodząc do tkanki mózgowej. Po osiągnięciu żądanej pozycji zejdź o dodatkowe 0,1 mm, zatrzymaj pompę, podnieś ramię stereotaktyczne o 0,1 mm i ponownie uruchom pompę przy przepływie do 0,3 μL/min.
    UWAGA: Powodem utrzymywania powolnego przepływu podczas opuszczania igły jest zapewnienie nadciśnienia, które pozwala uniknąć penetracji małych fragmentów tkanki w samej igle. Takie zdarzenie zablokowałoby końcówkę, pogarszając dostarczanie rozwiązania. Ponieważ natężenie przepływu jest bardzo małe podczas opuszczania igły, a prędkość obniżania wynosi około 10 s/mm, oznacza to, że ilości roztworu, które pozostają wzdłuż ścieżki igły, są znikome w porównaniu z tymi, które są wstrzykiwane w miejscu docelowym. Tego środka ostrożności można uniknąć w przypadku używania igieł z bocznymi otworami.
14. Uruchom timer i odczekaj wymagany czas w zależności od żądanej objętości do wstrzyknięcia (na przykład 6 min 40 s w przypadku wstrzykiwania 2 μl). Należy monitorować ruch pęcherzyków podczas wstrzykiwania. Na koniec zatrzymaj pompę i odczekaj 5 minut przed powolnym wyjęciem igły. Gdy igła kwarcowa zostanie całkowicie usunięta, ponownie uruchom pompę i sprawdź, czy na końcu igły nie tworzy się kropla.
15. Uszczelnij otwór w powierzchni czaszki woskiem kostnym, usuń klipsy hemostatyczne i zszyj skórę głowy, pokryj obszar wokół rany kremem z antybiotykiem (np. neosporyną) i wróć do klatki domowej.

Wyniki

Rysunek 1: Mikroskopijny obraz kwarcowej końcówki igły, pokazujący różne średnice końcówki i otwory używane do wstrzykiwania płynów. Obraz w małym powiększeniu w (A) i większym powiększeniu w (B) i (C). Igła może być przygotowana na różne spos...

Materiały