Trójwymiarowe obrazowanie astrocytów znakowanych immunologicznie za pomocą mikroskopii konfokalnej

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Zwierzęta, chirurgia i preparaty próbek

UWAGA: Przygotuj tkankę mózgową do trójwymiarowej (3D) konfokalnej analizy mikroskopowej.

1. Podziel zwierzęta losowo na dwie grupy: amyloid beta (Aβ)_1-40 – wstrzyknięcie (n = 8) i Aβ_1-40 – wstrzyknięcie z leczeniem genisteiną (n = 8); podawać genisteinę (10 mg/kg rozcieńczoną w podłożu, takim jak polietylenotlelonowany olej rycynowy) przez zgłębnik na 1 godzinę przed zabiegiem.
2. Znieczulić zwierzęta ketaminą (100 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg). Prawidłowe znieczulenie należy potwierdzić brakiem odruchu wycofania po uszczypnięciu palca u nogi. Podczas zabiegu należy stosować maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
3. Umieść zwierzęta w aparacie stereotaktycznym i ogol głowę. Zastosuj roztwór jodu, aby oczyścić skórę głowy przed nacięciem i utrzymuj miejsce operacji w sterylności podczas operacji, aby zmniejszyć ryzyko infekcji. Wstrzyknąć Aβ_1-40 stereotaktycznie (4 μl) w hipokamp na poziomie −3,5 mm za bregmą, ± 2 mm bocznie do linii środkowej i −2,8 mm poniżej opony twardej, zgodnie z atlasem mózgu szczura.
4. Zapewnić obserwację/opiekę pooperacyjną do momentu, gdy zwierzęta będą w pełni świadome, aby zapewnić im komfort. Utrzymuj zwierzęta w cieple podczas rekonwalescencji i nie umieszczaj ich z powrotem w klatce z innymi zwierzętami aż do pełnego wyzdrowienia. Zwróć uwagę na wszelkie oznaki infekcji u zwierząt po zabiegu.
5. Znieczulenie zwierząt należy dokładnie przeprowadzić za pomocą ketaminy (150 mg/kg) trzy tygodnie po zabiegu. Wykonać utrwalenie przezsercowe poprzez perfuzję zwierząt 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym soli fizjologicznej lub PBS (pH = 7,4), a następnie usunąć i naprawić mózg.
6. Po utrwaleniu mózgów w 4% paraformaldehydzie przez 2-3 dni w temperaturze 4 °C.
7. Osadź tkankę w blokach parafiny za pomocą sprzętu do zatapiania tkanek i unikaj niedopełniania lub przepełniania kasety, ponieważ może to zakłócać prawidłowe wyrównanie lub sekcję. Zwróć uwagę na orientację tkanki w bloku parafiny.
   UWAGA: Na przykład hipokamp szczura znajduje się blisko tylnej części półkuli mózgowej. Dlatego tkanka powinna być osadzona w taki sposób, aby sekcja zaczynała się w tylnej części mózgu. Użyj atlasu Paxinos jako przewodnika, aby osiągnąć pożądaną strukturę anatomiczną.
8. Umieść mikrotom z dala od przeciągów powietrza lub drzwi, ponieważ ruchy powietrza utrudniają przenoszenie sekcji.
9. Użyj przekrojów o grubości ≥20 μm, ponieważ ta głębokość będzie niezbędna do uzyskania obrazów Z-Stack kompletnych astrocytów. Nie używaj pierwszych kilku sekcji, ponieważ mogą mieć niepożądaną grubość ze względu na rozszerzalność cieplną.
10. Umieść sekcje na powierzchni ciepłej wody (5 ± 2 °C, poniżej temperatury topnienia parafiny) na tyle długo, aby spłaszczyć sekcje.
    UWAGA: Nadmierne rozszerzanie się sekcji może zaburzyć morfologię struktury. Użyj małego pędzla, aby ostrożnie przenieść sekcje. Zbierz od dwóch do trzech sekcji na każdym slajdzie.
11. Szkiełka należy przechowywać w pionowym stojaku i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze 37 °C przez kilka godzin lub na noc (O/N).

2. Immunohistochemia

1. Odparafinować skrawki w ksylenie, 2 x 10 min, i ponownie nawodnić przez gradient alkoholu (99,8%, 95% i 70%, 10 min każdy) i PBS.
2. Inkubować z przeciwciałami przeciwko kwaśnemu białku fibrylarnemu gleju (GFAP) rozcieńczonym w stosunku 1:1,500 w PBS zawierającym 0,25% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,25% Triton X-100 i 3,5% normalnej surowicy (O/N w 4 °C).
3. Myć sekcje w PBS przez 3 x 5 min.
4. Inkubować z drugorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi z fosforanami alkalicznymi przez 1 godzinę (1:100, 21°C, rozcieńczone w PBS).
5. Umyj skrawki w PBS przez 3 x 5 min.
   UWAGA: Ważne jest, aby prawidłowo umyć skrawki po wtórnych przeciwciałach, aby zminimalizować barwienie tła.
6. Inkubuj sekcje w ciemności z płynnym trwałym czerwonym chromogenem (15-20 min).
   Uwaga: Przygotuj roztwór nie później niż 30 minut przed użyciem.
7. Myć sekcje w PBS przez 3 x 5 min.
8. Na koniec wybarwić jądra 4-6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI; 1:500, rozcieńczony w PBS) przed pokryciem. Przechowuj szkiełka w lodówce przez 24-48 godzin przed mikroskopią.

3. Mikroskopia konfokalna

UWAGA: Do oceny ilościowej (patrz poniżej) wybierz astrocyt z wyraźnie widocznym jądrem barwionym DAPI z minimalną liczbą nakładających się na siebie gałęzi, aby zmniejszyć ryzyko błędów. Tworzenie obrazów Z-Stack jest czasochłonne. Uzbrój się w cierpliwość i nie zatrzymuj się podczas przetwarzania. Pionowy konfokalny laserowy mikroskop skaningowy służy do tworzenia obrazów 3D astrocytów.

1. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i wybierz obiektyw 63X.
2. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i kliknij Uruchom system. Kliknij kartę Zlokalizuj. Przejdź do opcji Przypisz i wybierz GFP, aby dostosować odpowiednie światło.
3. Otwórz migawkę, aby odbijać światło. Znajdź rewolwer reflektorowy po prawej stronie migawki i wybierz kolor, który ma być odbijany przez astrocyty (zielony, czerwony lub fioletowy); Użyto tutaj koloru czerwonego (FSet20 wf).
   UWAGA: Nie zapomnij ustawić ostrości obrazu bezpośrednio w oku mikroskopu.
4. Aby znaleźć najlepszą ostrość, kliknij Wszystkie zamknięte, umieść pinezkę mikroskopu w trybie ekranu i kliknij kartę Akwizycja.
5. Kliknij Smart Setup na karcie Akwizycja; otworzy się okno. Wybierz odpowiedni fluorofor (tj. DAPI i Alexa Fluor 555, w bieżącym projekcie) z listy. Kolor jest wybierany automatycznie.
6. Kliknij Najlepszy sygnał i zastosuj, a następnie kliknij Ustaw ekspozycję; komputer automatycznie ustawi parametry ekspozycji.
7. Aby zoptymalizować obraz, przejdź do okna Kanały. Odznacz Ścieżka2, podświetl Ścieżka1 i kliknij Na żywo. W razie potrzeby skoncentruj się na obrazie.
8. W oknie Channels (Kanały) dostosuj następujące; kliknij na 1AU, aby automatycznie zoptymalizować otwor. Bardzo ważne jest, aby wykonać ten krok, w przeciwnym razie obrazy konfokalne będą nieoptymalne. Dostosuj wzmocnienie, aby uzyskać najlepszą intensywność (utrzymuj to ustawienie poniżej 800, aby zredukować dodatkowy szum). Na koniec ustaw wzmocnienie cyfrowe między 2 a 3.
9. Odznacz Ścieżkę1, kliknij Ścieżkę2 i powtórz Krok 3.8 dla Ścieżki2. Następnie zatrzymaj transmisję na żywo.
10. Przejdź do okna Tryb pozyskiwania. Popraw obraz, optymalizując rozmiar klatki i uśrednianie. Aby zmienić rozmiar ramki, przejdź do X*Y i wybierz 1,024 x 1,024. Wybierz niską prędkość, aby uzyskać lepszy obraz.
11. Przejdź do sekcji Uśrednianie i wybierz liczbę ≥4. Ta wartość uśrednienia wskazuje liczbę skanów, które zostaną uśrednione w celu uzyskania uzyskanego obrazu. Teraz kliknij przycisk Snap i zapisz przechwycony obraz 2D.
12. W przypadku obrazowania 3D zaznacz element Z-Stack w Smart Setup, powodując otwarcie okna Z-Stack.
13. Ustaw pierwszą i ostatnią pozycję dla Z-Stack, tj. głębokość komórki. Najpierw kliknij Na żywo. Następnie użyj napędu ostrości mikroskopu, aby skupić się na najwyższym położeniu astrocytu w tkance, gdzie ma się rozpocząć Z-Stack. Kliknij Ustaw najpierw. Następnie skup się na najniższej pozycji astrocytu w tkance, gdzie skanowanie Z-Stack powinno zostać zatrzymane. Kliknij Ustaw ostatnie. Następnie zatrzymaj transmisję na żywo.
14. Wybierz interwał; w bieżącym badaniu stosuje się 1,01 μm; wyboru interwału można dokonać, klikając Optymalny, aby ustawić liczbę wycinków.
15. Kliknij Rozpocznij eksperyment. Zapisz obrazy po zakończeniu skanowania. Obraz ten zostanie wykorzystany do pomiaru następujących parametrów: powierzchni i objętości terytorium astrocytów, a także całego astrocytu, w tym gałęzi, ciała komórki i jądra.