Ukierunkowane dostarczanie siRNA do neuronów w celu wyciszenia białek prionowych za pomocą kompleksów liposomalnych

Streszczenie

Źródło: Bender, H. R., et.al. Dostarczanie terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje ukierunkowane dostarczanie siRNA białka prionowego (PrP) do neuronów za pomocą liposomalnych kompleksów siRNA-peptyd (LSPC). Liposomy kationowe wiążą elektrostatycznie siRNA ukierunkowane na PrP, które jest dodatkowo stabilizowane przez peptyd RVG-9r do transportu za pośrednictwem receptora przez barierę krew-mózg. Po dostaniu się do mózgu LSPC przechodzą endocytozę w neuronach, uwalniając siRNA w celu zainicjowania interferencji RNA, zmniejszając ekspresję PrP i przerywając postęp choroby prionowej.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie LSPC

1. Użyj stosunku cholesterolu DOTAP (1,2-dioleoilo-3-trimetyloamonowo-propanowy) 1:1 dla LSPC. W przypadku preparatu liposomu o stężeniu 4 nmoli należy wymieszać 2 nmoli DOTAP i 2 nmoli cholesterolu z 10 ml roztworu chloroformu:metanolu w proporcji 1:1 w kolbie.
2. Odparować 9 ml roztworu chloroformu:metanol przy użyciu gazu_N2 w dygestorium. Odparować ostatni 1 ml rozpuszczalnika w dygestorium przez noc bez użycia gazu. Obserwować cienką warstwę lipidową na dnie kolby.
3. Podgrzać 10 ml 10% roztworu sacharozy do temperatury 55 °C.
4. Podgrzany 10% roztwór sacharozy wlewać na cienki film lipidowy powoli, tj. 1 ml/min, delikatnie obracając kolbą. Utrzymać 10% sacharozę i kolbę z lipidami w temperaturze 55 °C, tak aby cząsteczki lipidów pozostały w fazie żelowo-ciekłej. Rehydratacja powoduje tworzenie się pęcherzyków wielopłytkowych (MLV).
5. Pozwól lipidom na ponowne nawodnienie w temperaturze 55 °C przez co najmniej jedną godzinę przed doborem wielkości liposomów.
6. Zmontuj wytłaczarkę zgodnie z instrukcjami producenta z filtrami 1.0 μm lub użyj filtrów strzykawkowych 1.0 μm do wymiarowania.
7. Dodać 1 ml podgrzanej zawiesiny liposomowej do jednej ze strzykawek na ekstruderze i przepuścić zawiesinę między dwiema strzykawkami 11 razy. Upewnić się, że zawiesina znajduje się w przeciwnej strzykawce niż strzykawka początkowa po 11 przejściach.
8. Ponownie przepuść liposomy przez filtry 0,45 μm, a następnie 0,2 μm, aby wygenerować duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUV). Utrzymuj zawiesinę liposomową w cieple, aby ułatwić dobór rozmiaru.
9. Inkubować 20 μl zawiesiny liposomów 4 nmol (200 μM) z 200 μl 20 μM (łącznie 4 nmol) podstawowego roztworu siRNA przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
10. Inkubować 80 μl 500 μM (łącznie 40 nmol) podstawowego roztworu RVG-9r z roztworem siRNA/liposomu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. LSPC należy użyć tak szybko, jak to możliwe, ale można je zużyć do kilku godzin po przygotowaniu. Przechowywać LSPC w temperaturze 4 °C przez kilka godzin po przygotowaniu.

2. Wstrzykiwanie myszom LSPC

1. Wystaw myszy na 5-10 minut na działanie lampy grzewczej, aby rozszerzyć naczynia krwionośne.
2. Znieczulić mysz przepływem 2-3% izofluoranu/tlenu 5-10 minut przed wstrzyknięciem i w trakcie wstrzyknięcia. Potwierdź znieczulenie, gdy zwierzę nie jest już w ruchu, a oddechy zwolniły, wykonując szczypanie palca u nogi. Umieść mysz na plecach lub boku, aby uzyskać dostęp do żyły ogonowej. Użyj maści weterynaryjnej na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
3. Wytrzyj/spryskaj ogon 70% EtOH i wstrzyknij 300 μl LSPC w żyłę ogonową myszy za pomocą strzykawki insulinowej 26 G. Wstrzyknąć dystalnie do żyły ogonowej i poruszać się proksymalnie, jeśli żyła zapadnie się lub pęknie.
4. Umieść mysz w czystej klatce, aż utrzyma pozycję leżącą mostka. Nie umieszczaj myszy z innymi kolegami z klatki, dopóki w pełni nie dojdzie do siebie. Myszy powinny wyzdrowieć w ciągu 5 do 15 minut. Można je umieścić na poduszce grzewczej lub pod lampą grzewczą, aby utrzymać temperaturę ciała, jeśli rekonwalescencja trwa dłużej. Myszy powinny być ściśle monitorowane, aby zabezpieczyć się przed przegrzaniem.
5. Należy monitorować zwierzę kilka godzin po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że znieczulenie ustąpiło i nie wystąpiły żadne złe skutki leczenia. Pozwól LSPC krążyć przez co najmniej 24 godziny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DOTAP lipid	Avanti Lipids	890890
Cholesterol	Avanti Lipids	700000
Chloroform	Fisher Scientific	AC268320010
Metanol	EMD Millipore	113351
N₂ Gaz	AirGas
Sacharoza	Wytłaczarka Fisher Scientific	S5-500
	Avanti Lipids	610023
filtry 1,0, 0,4 i 0,2 μm	Avanti Lipids	610010, 610007, 610006