$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Test proliferacji komórek Ki67
- Test proliferacji komórek Ki67 (immunocytochemia)
- Przepłukać kultury komórkowe buforem 0,1 M fosforanu (PO4) przez jedną minutę dwa razy. Utrwal kulturę za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Usuń PFA i przepłucz studzienki PBS przez siedem minut trzy razy.
- Po ostatnim płukaniu dodać 100 μl roztworu blokującego (sól fizjologiczna z buforu fosforanowego, 5% normalnej surowicy osła, 0,4% surowicy albuminy bydlęcej i 0,2% Triton X-100) do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe, królicze przeciwciało anty-Ki67, rozcieńczając je w roztworze blokera w stosunku roboczym 1:200.
- Usuń roztwór blokujący i nałóż 100 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki. Przykryć 96-dołkową płytkę i inkubować próbki w temperaturze 4 °C przez noc.
- Następnego dnia usuń roztwór przeciwciał i płucz PBS przez 7 minut, 3 razy.
- Przygotować przeciwciało drugorzędowe, anty-królicze Cy3 osła w roztworze blokującym w stosunku roboczym 1:500. Dodać barwienie jądrowe DAPI do roztworu przeciwciała drugorzędowego w rozcieńczeniu 1:100. Po usunięciu ostatniego płukania PBS nanieść 100 μl roztworu przeciwciała wtórnego/DAPI do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 90 minut.
- Usuń wtórne przeciwciało/roztwór DAPI i płucz każdą studzienkę PBS przez 7 minut, 3 razy. Przykryć płytkę 96-dołkową i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazowania.
2. Zautomatyzowane obrazowanie i analiza punktacji na wielu długościach fal
- Załaduj 96-dołkową płytkę (wcześniej przetworzoną do znakowania immunologicznego Ki67) do systemu HCS i pozwól płytce zrównoważyć się przez 20 minut. Otwórz oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazu systemu HCS.
- Wybierz ustawienia akwizycji dla obiektywu 10X, korzystając z binowania kamery na 1 i ustawieniu wzmocnienia na 2. Znajdź płaszczyznę Z, w której znajdują się komórki, korzystając z funkcji automatycznej ekspozycji i oblicz przesunięcie dla każdej interesującej nas długości fali. Na potrzeby tej analizy uchwyć obrazy dla DAPI (W1), Cy3 (W2). Wybierz maksymalny poziom intensywności, przy którym studzienki kontroli ujemnej nie wykazują sygnału do akwizycji obrazu. Upewnij się, że to ustawienie jest odpowiednie dla dołków dodatnich.
- Zdobądź płytę. Przechwytuj obrazy i przechowuj je w bazie danych oprogramowania do akwizycji i analizy obrazów.
- Po uzyskaniu obrazów otwórz oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów w trybie offline i przejrzyj dane płyt z powyższych obrazów.
- Wybierz analizę punktacji dla wielu długości fali. Skonfiguruj minimalne i maksymalne natężenia dla każdej długości fali.
UWAGA: Wykrycie DAPI powinno oznaczać barwienie wokół każdego widocznego jądra. Cy3 powinien wykrywać dodatnie komórki o immunoreaktywności Ki67 (IR) i nie powinien wykrywać IR w kontrolach ujemnych. Dla Cy3 Ki67 IR przybliżona minimalna szerokość wynosiła 7 μm, przybliżona maksymalna szerokość wynosiła 30 μm, intensywność powyżej lokalnego tła wynosiła 150 poziomów szarości, a minimalny obszar barwiony wynosił 50μm2. - Przeprowadź analizę dla wszystkich pozycji. Wyeksportuj dane do wyświetlenia w arkuszu kalkulacyjnym.