Charakterystyka genetycznie modyfikowanych mezenchymalnych komórek macierzystych do zastosowań neuroterapeutycznych

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Sharma, A. D., et.al. Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych w celu dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych. J. Vis. Exp. (2015)

Film ten pokazuje proces charakteryzowania transgenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych zaprojektowanych do ekspresji terapeutycznych czynników neurotroficznych. Przedstawiono w nim etapy związane z utrwalaniem, przepuszczalnością i barwieniem komórek za pomocą pierwszorzędowych i drugorzędowych przeciwciał ukierunkowanych na marker proliferacji komórek, a następnie analizę przy użyciu systemu przesiewowego o wysokiej zawartości w celu wychwycenia sygnałów fluorescencyjnych w jądrach. Zwiększona ekspresja markera proliferacji potwierdza przydatność komórek transgenicznych do zastosowań neuroterapeutycznych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Test proliferacji komórek Ki67

Test proliferacji komórek Ki67 (immunocytochemia)
1. Przepłukać kultury komórkowe buforem 0,1 M fosforanu (PO₄) przez jedną minutę dwa razy. Utrwal kulturę za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Usuń PFA i przepłucz studzienki PBS przez siedem minut trzy razy.
2. Po ostatnim płukaniu dodać 100 μl roztworu blokującego (sól fizjologiczna z buforu fosforanowego, 5% normalnej surowicy osła, 0....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
96 płytki dołkowe	Greiner Bio One	655090	96-dołkowe płytki wybrane do użycia w
albuminie surowicy bydlęcej ImageXpress (BSA)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	A9647
Przeciwciało anty-Ki67	królika Abcam ( Cambridge, MA)	Ab16667	1:200 rozcieńczenie
DAPI	Invitrogen (Carlsbad, CA)	D3571
Donkey anti-Rabbit Cy3	Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)	711-165-152	1:500 rozcieńczenie
MSCs myszy dorosłych myszy C57BL/6	Tulane Cent do terapii genowej (Nowy Orlean, LA)		Wyizolowany ze szpiku kostnego
Genetycznie zmodyfikowane MSC (GFP, BDNF, GDNF, BDNF / GDNF)	Komórki te uzyskano z naszego poprzedniego badania: Ye i wsp. (w przygotowaniu)
Normalna surowica osła (NDS)	Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)	017-000-121
Paraformaldehyd (PFA)	Fisher Scientific (Hampton, NH)	O4042	4% PFA w 0,1 M buforze PO4
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	P4417
Triton X-100	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	Urządzenia X100
ImageXpress Micro	Molecular (Sunnyvale, Kalifornia)	System badań przesiewowych	ImageXpress micro
MetaXpress 4.0	(Sunnyvale, Kalifornia)	Oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazu	MetaXpress 4.0
KH₂PO₄	Fisher Scientific (Hampton, NH)	P285	Dla bufora PO₄
K₂HPO₄	Fisher Scientific (Hampton, NH)	P288	Dla bufora PO₄

High ContentUrządzenia molekularne

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission