Resekcja guza mózgu u myszy przy użyciu minimalnie inwazyjnego systemu resekcji

Streszczenie

Źródło: Alomari, S., et al. Wdrożenie minimalnie inwazyjnej resekcji guza mózgu u gryzoni w celu pobrania tkanek o wysokiej żywotności. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film pokazuje zastosowanie minimalnie inwazyjnego systemu resekcji (MIRS) do wycięcia tkanki nowotworowej od znieczulonej myszy, której wszczepiono guz. Procedura polega na przymocowaniu myszy do ramy stereotaktycznej, ponownym otwarciu poprzedniego miejsca operowanego w celu uzyskania dostępu do mózgu i wprowadzeniu specjalistycznej kaniuli, która wykorzystuje ssanie i obracające się ostrze do usuwania sekcji guza. Po resekcji wyciętą tkankę pobiera się przez sterylne rurki, a ranę zamyka się, aby umożliwić rekonwalescencję.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Wstępna implantacja guza wewnątrzczaszkowego

1. W początkowej fazie badania należy wstrzyknąć doczaszkowo każdej myszy 100 000 komórek (linia komórkowa glejaka myszy GL261) zawieszonych w 4 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS) na głębokość 2,5 mm zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem.
2. Określ ilościowo sygnał guza u każdej myszy za pomocą systemu obrazowania in vivo 9 dni po implantacji guza.
   UWAGA: W razie potrzeby podziel myszy na dwie grupy w oparciu o obciążenie guza. W niniejszym badaniu dwie grupy to: (1) myszy o stosunkowo małym obciążeniu guzem (średni sygnał bioluminescencyjny = 5,5e+006 ± 0,1e+006 fotonów/s, n = 10) oraz (2) myszy o stosunkowo dużym obciążeniu guzem (średni sygnał bioluminescencyjny = 1,69e+007 ± 0,2e+007 fotonów/s, n = 10), (p < 0,05, test Manna-Whitneya).
3. Podziel każdą grupę na dwie porównywalne podgrupy.
   >UWAGA: W tym badaniu dwie podgrupy to: nieleczone myszy (n = 5) i myszy z guzami poddawanymi resekcji chirurgicznej przy użyciu MIRS (n = 5), (p > 0,05, test Manna-Whitneya).
4. Począwszy od dnia resekcji, śledź postęp guza za pomocą systemu obrazowania in vivo z częstotliwością opartą na wzorcu wzrostu guza.
   UWAGA: W przypadku linii komórkowej GL261 należy śledzić postęp guza w dniu resekcji, a następnie co 3-6 dni.

2. Resekcja guza za pomocą MIRS

1. Znieczulenie myszy za pomocą mieszaniny gazów izofluranu-O2 w komorze indukcyjnej lub dootrzewnowego wstrzyknięcia roztworu ksylazyny/ketaminy.
   1. W przypadku stosowania znieczulenia gazowego należy ustawić natężenie przepływu gazu na 1.0 ml/min, a parownik na 2.0% w celu indukcji znieczulenia, zwykle wymagając 3-5 minut w komorze (patrz Tabela materiałów).
   2. W przypadku stosowania środka znieczulającego do wstrzykiwań, znieczulenie myszy poprzez wstrzyknięcie 0,2 ml roztworu znieczulającego (80-100 mg/kg ketaminy i 10-12,5 mg/kg ksylazyny, patrz tabela materiałów) dootrzewnowo.
2. Oceń, czy zwierzę jest odpowiednio uspokojone, szczypiąc palec u nogi. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby uniknąć wysuszenia rogówki. Przed zabiegiem należy podać podskórnie lek przeciwbólowy (0,03-0,06 mg/kg buprenorfiny).
3. Umieść mysz na ramce stereotaktycznej (patrz Tabela materiałów) po potwierdzeniu pełnej sedacji.
   UWAGA: W przypadku stosowania znieczulenia gazowego należy umieścić nos myszy w stożku nosowym, gdzie będzie ona nadal otrzymywać mieszaninę izofluranu-O2 podczas zabiegu (1.5%).
4. Usuń poprzednią zszywkę, a następnie usuń włosy kremem do depilacji lub goleniem. Dezynfekuj skórę za pomocą naprzemiennych cykli peelingu na bazie chlorheksydyny/betadyny i alkoholu. Następnie za pomocą sterylnego skalpela wykonaj 1 cm podłużne nacięcie w linii środkowej wzdłuż poprzedniej blizny pooperacyjnej.
5. Przymocuj rękojeść MIRS do ramienia stereotaktycznego za pomocą stage adapter/uchwyt rękojeści, aby zwiększyć stabilność i precyzję.
6. Skonfiguruj urządzenie MIRS (patrz tabela materiałów), korzystając z następujących ustawień (Rysunek 1).
   1. Włóż zestaw przewodów zasilających na tylnym panelu do gniazda przewodu zasilającego. Włącz lub wyłącz zasilanie systemu, przełączając (1 = WŁ., 0 = WYŁ.).
   2. Włóż jeden koniec węża azotowego (dostarczonego z konsolą) do męskiej złączki na tylnym panelu konsoli. Obróć nakrętkę łączącą zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby dokręcić połączenie.
      UWAGA: Przeciwległy koniec węża musi być podłączony do źródła azotu.
   3. Przed podłączeniem węża do źródła azotu upewnij się, że ciśnienie zasilania nie przekracza 100 psig, co jest wejściowym ciśnieniem zasilania zalecanym dla konsoli.
      UWAGA: Konsola wygeneruje własną aspirację po aktywacji za pomocą pedału nożnego po dostarczeniu azotu do konsoli.
   4. Zabezpiecz pokrywę portu próżniowego i uszczelnij ją, aby uniknąć wycieków w układzie próżniowym. Wszelkie nieszczelności w systemie aspiracji wpłyną na wydajność konsoli MIRS.
   5. Jeśli aspiracja jest niższa niż 17 podczas konfiguracji lub zalewania, sprawdź, czy pokrętło zasysania z przodu konsoli jest ustawione na maksymalny poziom (100), upewnij się, że nie ma wycieków w systemie zasysania i potwierdź, że ciśnienie zasilania azotem jest prawidłowe.
   6. Aby podłączyć pedał nożny do konsoli, włóż szare złącze pedału nożnego do szarego gniazda, aż usłyszysz kliknięcie i znajdzie się na swoim miejscu.
      UWAGA: Złącze pedału nożnego łączy się z konsolą w jednej orientacji i jest wyposażone w klucz.
   7. Aby podłączyć rękojeść do konsoli, włóż niebieskie złącze rękojeści do niebieskiego gniazda, aż usłyszysz kliknięcie i znajdzie się na swoim miejscu.
      UWAGA: Złącze rękojeści łączy się z konsolą w jednej orientacji i jest wyposażone w klucz.
   8. Zalej każdą rękojeść przed użyciem systemu, zasysając sterylny płyn z małej miski do otworu, przez rurkę i rękojeść, a następnie do kanistra, aby upewnić się, że wnętrze rurki i rękojeści są nasmarowane w celu zmniejszenia niedrożności tkanek.
   9. Przygotuj się do aspiracji samej lub aspiracji z cięciem, wybierając odpowiedni tryb na przednim panelu konsoli. Rozpocznij za pomocą pedału nożnego.
7. Włóż kaniulę 23 G MIRS do otworu zadziorów na głębokość 2.5 mm.
8. Proces resekcji należy rozpocząć poprzez wciśnięcie pedału nożnego podłączonego do kaniuli. Wykonaj jeden pełny cykl (360°) lub więcej resekcji za pomocą pokrętła w rękojeści.
   UWAGA: Im więcej wykonanych cykli, tym większa objętość wyciętej tkanki nowotworowej.
9. Po zakończeniu procesu resekcji wyjmij kaniulę 23 G MIRS z otworu na zadziory i użyj 5 ml 1x PBS, aby przepłukać rurkę i usunąć wszelkie resztki zanieczyszczeń.
10. Wyjmij mysz z ramy stereotaktycznej i zamknij ranę zszywaczem lub materiałem do szycia 4-0 (patrz Tabela materiałów).
11. Umieść mysz na poduszce grzewczej lub pod ciepłym światłem podczas rekonwalescencji po znieczuleniu przed powrotem do klatki.
12. Po zakończeniu eksperymentu oczyść kaniulę poprzez przepłukanie. Na przemian ze schłodzonym podłożem i powietrzem, aby "wepchnąć" całą wyciętą tkankę z powrotem do pojemnika do pobierania. Wyjmij pojemnik zbiorczy z systemu i zakryj go dołączoną nasadką.
13. Po wykonaniu kroku 2.12 umieść dystalną końcówkę kaniuli w 3% H₂O₂ i zastosuj ssanie na poziomie 24-25 in Hg, aby napełnić przewód ssący z powrotem do pojemnika na ssący i odstawić na 60-90 s. Przepłukać sterylnym medium pulsującym powietrzem i mediami z przerwami.
14. Monitoruj myszy pod kątem wszelkich objawów neurologicznych (nieprawidłowych, nieregularnych ruchów lub drgawek) po zabiegu.

Wyniki

Rysunek 1: Konfiguracja systemu MIRS. (A) Minimalnie inwazyjny system resekcji (MIRS) dla guza mózgu w modelach gryzoni ze zintegrowaną tkanką system konserwacji. (B) Panel przedni konsoli MIRS. 1 = moc syst...

Materiały