Synergiczny wpływ wewnątrzczaszkowego i dootrzewnowego podawania leków przeciwbólowych na termiczną reakcję bólową u szczura

Streszczenie

Źródło: Martinez, E., et al. Farmakoterapia wewnątrzczaszkowa i testy przeciwbólowe u gryzoni. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film pokazuje wewnątrzczaszkowe podawanie leku przeciwbólowego znieczulonemu szczurowi z wstępnie wszczepioną kaniulą prowadzącą w korze przedczołowej. Dodatkowy lek przeciwbólowy jest podawany jednocześnie dootrzewnowo. Po wyzdrowieniu reakcja termiczna szczura na ból jest oceniana za pomocą aparatu Hargreave'a, w którym mierzy się opóźnienie wycofania łapy w celu oceny działania przeciwbólowego podawanych leków.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Stereotaktyczna implantacja kaniuli

1. Użyj 10-12 tygodniowych samców szczurów Sprague-Dawley.
2. Znieczulić zwierzęta 1,5-2% izofluranem. Gdy zwierzę przestanie reagować na silne uszczypnięcie ostrymi kleszczami, wykonaj operację. Pamiętaj, aby autoklawować wszystkie narzędzia, używać sterylnych rękawiczek chirurgicznych i dodawać maść okulistyczną do oczu zwierzęcia, aby zapobiec uszkodzeniom.
3. Stereotaktycznie wszczepić obustronne kaniule prowadzące o rozmiarze 26 do kory przedczołowej (PFC) pod kątem 12,5 stopnia o współrzędnych przednio-tylnych (AP): +2,9 mm; przyśrodkowo-bocznych (ML): +/−1,6 mm; grzbietowo-brzusznych (DV): −2,1 mm. Aby wprowadzić kaniule, wywierć otwory w czaszce w żądanych współrzędnych, o średnicy otworu zgodnej z rozmiarem użytych kaniul.
   UWAGA: W tym przypadku PFC był badany jako potencjalny cel dla implantów wewnątrzczaszkowych ze względu na jego ważną rolę w przetwarzaniu bólu, co wykazano w wielu wcześniejszych badaniach. Aby zbadać funkcję innych określonych obszarów mózgu, naukowcy mogą użyć różnych współrzędnych zgodnie z atlasem mózgu.
4. Pozwól szczurom dojść do siebie po operacji przez co najmniej 1 tydzień. Po zabiegu chirurgicznym należy wstrzyknąć płyny podskórne przed rekonwalescencją, aby wspomóc wymagania metaboliczne, i zastosować miejscowo bupiwakainę w świeżo zamkniętym nacięciu. Umieść zwierzę na ciepłej podkładce, dopóki się nie obudzi, i monitoruj zwierzę po operacji przez 3 dni, aby zapewnić dobre zdrowie i prawidłową rekonwalescencję.
5. Gdy zwierzęta w pełni wyzdrowieją po operacji, należy rozpocząć wstrzykiwanie (następny krok).

2. Wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowe i dootrzewnowe

1. Do wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych należy użyć rurki PE-50 przymocowanej na jednym końcu do 10-μl strzykawek Hamilton z kaniulą iniektora o rozmiarze 33, która wystaje 1,0 mm poza wszczepione prowadnice.
2. Wstrzyknąć 0,5 μl (lub mniej, jeśli jest to pożądane) badanego leku lub soli fizjologicznej do PFC tych szczurów. Ponieważ PFC jest większym regionem u szczurów, jego ilość nie zostanie rozprzestrzeniona na inne regiony. Jednak w przypadku mniejszych obszarów mózgu lub myszy użyj mniejszej objętości. Ilość wstrzykniętego leku zależy od obszaru mózgu i gatunku zwierzęcia.
   UWAGA: Należy pamiętać, że sól fizjologiczna powinna być stosowana jako kontrola zamiast dimetylosulfotlenku (DMSO), ponieważ DMSO jest neurotoksyczny. Jednak bardzo mała ilość DMSO może być bezpieczna do infuzji, ponieważ badania wykazały, że mniej niż 50% DMSO (tj. mniej niż całkowita objętość 0,3 μl, jak w tym przypadku) może nie zakłócać badań behawioralnych.
3. Wstrzykiwać objętość obustronnie przez okres 100 s i trzymać kaniule iniektora na miejscu przez dodatkowe 60 s przed usunięciem, aby umożliwić powolną dyfuzję tego roztworu.
4. W przypadku badań synergicznych efektów farmakologicznych należy jednocześnie podawać inny lek metodami ogólnoustrojowymi. W takim przypadku należy wstrzyknąć żądany lek lub kontrolować doczaszkowo, a natychmiast po tym podać dodatkowy lek dootrzewnowo. Na przykład w tym badaniu zbadaliśmy synergiczne działanie przeciwbólowe morfiny i ampakiny, aby przetestować działanie addytywne. Podaliśmy AMPAkine doczaszkowo, w połączeniu z dootrzewnowym podawaniem 1 mg/kg morfiny (bezpieczna dawka ogólnoustrojowa).
   UWAGA: Zaleca się, aby najpierw wykonać wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowe, ponieważ są one trudniejsze do wykonania niż wstrzyknięcia dootrzewnowe.

3. Testy i ocena analgezji

1. Aby zbadać wpływ wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych na ostre zachowanie bólowe u szczurów, użyj testu podeszwowego (test Hargreavesa) do obliczenia opóźnienia wycofania w odpowiedzi na bodźce termiczne. Aparat Hargreavesa skupia wiązkę podczerwieni przez szklaną płaszczyznę na stopie szczura; Szczur stoi i swobodnie porusza się nad płaszczyzną szkła. Wykonując test Hargreavesa, skoncentruj wiązkę podczerwieni pod podeszwową częścią stopy szczura.
   1. Rozpocznij od wykonania podstawowych testów Hargreavesa przed wstrzyknięciami w celu ustalenia wartości wyjściowej do porównania.
2. Nie należy wstrzykiwać żadnego rodzaju leku przed ustaleniem wartości wyjściowej. Przeprowadź pięć dobrych prób w odstępie 5 minut. Dobrą próbą wskazuje wyraźne wycofanie, tj. gdy szczur zgina kolano i podnosi stopę w górę i do ciała.
   UWAGA: Upewnij się, że próby są oddalone od siebie o 5 minut, aby zapobiec uczuleniu szczura. Aparat Hargreavesa automatycznie rejestruje czas wycofania, po przerwaniu wiązki podczerwieni. W rezultacie, pamiętaj, aby pominąć próby z lokomocją, zmianą ciężaru itp. Jeśli dojdzie do przecenionej próby, odczekaj 5 minut i powtórz próbę.
3. Oblicz progi wycofania, biorąc pod uwagę średnią z pięciu badań.
4. Po uzyskaniu średniej wyjściowej rozpocznij eksperyment, aby uzyskać czasy odstawienia po infuzji leków. Testy Hargreavesa można wykonać 20-30 minut po wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym, chociaż dokładny czas może być zależny od farmakokinetyki konkretnych środków. Ma to na celu upewnienie się, że szczur wchłonął lek i doświadcza jego skutków. Przeprowadź ten eksperyment w taki sam sposób, jak w kroku 3.1.
5. Oblicz progi wypłaty, jak wspomniano w kroku 3.2.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sterotaksyjna kaniula	PlasticsOne	8I26GA8MMKIT
Cyfrowa strzykawka	Hamilton	8440
AMPAkine	Sigma Aldrich	C-271
Dimetylosulfotlenek	Sigma Aldrich	D4540
Aparat Hargreaves	Ugo Basile	37370
Samce szczurów Sprague-Dawley	Taconic Farms	NTac:SD
Sterylne rękawice chirurgiczne	Dynarex	6535