$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie zwierzęcia do operacji
- Wykonuj zabiegi chirurgiczne w czystej, przeznaczonej do tego przestrzeni. Autoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i sterylizuj sterylizatorem szklanym przed zabiegiem.
UWAGA: W tym protokole należy używać myszy FVB w dniu poporodowym 10-12 (P10-12). Różne grupy wiekowe i szczepy myszy mogą być wykorzystane do zaspokojenia potrzeb konkretnego projektu. Myszy starsze niż P40 mogą być trudne, ponieważ kość bulla staje się twardsza. - Znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym mieszaniny chlorowodorku ketaminy (100 mg / kg), chlorowodorku ksylazyny (10 mg / kg) i acepromazyny (2 mg / kg). Przygotowanie chirurgiczne należy rozpocząć dopiero wtedy, gdy zwierzę przestanie reagować na bolesne bodźce, takie jak szczypanie palców. W razie potrzeby należy podać dawkę przypominającą (jedną piątą pierwotnej dawki) koktajlu znieczulającego, aby przywrócić pierwotną płaszczyznę znieczulającą.
UWAGA: Zachowaj ostrożność na tym etapie, ponieważ większość śmiertelności obserwowanej w tym wieku jest spowodowana przedawkowaniem środka znieczulającego. - Zakryj oczy zwierzęcia ochronną maścią okulistyczną, aby oczy były wilgotne podczas znieczulenia, tłumiąc odruch mrugania zwierzęcia.
- Aby zapobiec hipotermii po znieczuleniu, ustaw mysz z wyciągniętą szyją na poduszce grzewczej przez cały zabieg, aż całkowicie się obudzi.
- Ogol lewą okolicę zauszną maszynką do strzyżenia i zdezynfekuj 70% etanolem i jodowidonem przed manipulacją chirurgiczną.
2. Zabieg chirurgiczny i wstrzyknięcie wektora
- Zastosuj podejście zauszne, aby odsłonić pęcherz bębenkowy. Naciąć tkankę podskórną małymi nożyczkami, aby odsłonić mięsień zauszny. Po cofnięciu tkanki tłuszczowej do tylnej strony nacięcia należy oddzielić mięśnie po prawej i lewej stronie prostopadłej do nacięcia, aby odsłonić kość skroniową. Upewnij się, że to nacięcie jest wystarczająco długie, aby wygodnie pracować z odpowiednią wizualizacją.
- Przedziurawić błonę bębenkową za pomocą igły 25 G i w razie potrzeby rozszerzyć otwór za pomocą kleszczy, odrywając kość do tyłu, aby umożliwić dostęp do podstawnego zwoju ślimaka, a następnie poszerzyć na tyle, aby uwidocznić tętnicę strzemiączkową i okrągłą błonę okienną (RWM).
- Delikatnie nakłuj RWM w środku za pomocą bokrzemianowej pipety kapilarnej. W tym momencie obserwuj wypływ płynu przez RWM; To normalne. Poczekaj, aż wypływ się ustabilizuje (wypływ płynu ze ślimaka jest suszony sterylną bibułą filtracyjną).
UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas trzymania i przesuwania szklanej igły, aby perforacja RWM była jak najmniejsza. W zależności od używanego mikroskopu pipety należy trzymać za pomocą mikromanipulatora lub ręcznie za pomocą uchwytu na pipety. - Przygotować pipety do wstrzykiwań za pomocą ściągacza do pipet, w taki sam sposób, w jaki przygotowuje się pipety z zaciskiem krosowym. Upewnij się, że średnica końcówki jest duża (około 15 μm średnicy), aby pipetowanie wirusa było łatwe.
- Pobrać od 1 do 2 μl wirusów związanych z adenowirusem (AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP lub AAV2-GFP) do pipety iniekcyjnej. Po ustabilizowaniu wypływu (5 do 10 minut), należy wstrzyknąć tę stałą objętość do błony bębenkowej scala przez ten sam otwór, który wcześniej wykonano w RWM.