Przeszczep komórek prekursorowych interneuronów pochodzenia ludzkiego do hipokampa szczeniaka myszy

Abstract

Źródło: Gonzalez-Ramos, A., et al., Transplantation of Human Stem Cell-Derived GABAergic Neurons into the Early Postnatal Mouse Hippocampus to Mitigate Disorders. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film pokazuje stereotaktyczne wstrzyknięcie komórek prekursorowych interneuronów pochodzenia ludzkiego do hipokampa genetycznie zmodyfikowanego szczeniaka myszy ze zmniejszonymi interneuronami hamującymi, mające na celu przywrócenie równowagi pobudzająco-hamującej.

Protocol

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przeszczepienie komórek do hipokampa

UWAGA: Wszystkie etapy opisane w tej sekcji są wykonywane poza kapturem hodowli komórkowej w obiekcie dla zwierząt. Wczesny postnatalny przeszczep komórek do mózgu przeprowadzono na P2, biorąc pod uwagę P0 w dniu urodzenia.

1. Przygotuj się do eksperymentu transplantacyjnego, wykonując poniższe czynności.
   1. Autoklawuj cały materiał chirurgiczny lub, jeśli nie jest to możliwe, sterylizuj inną zatwierdzoną metodą.
   2. Zamontować strzykawkę do wstrzykiwań w uchwycie bez szklanej kapilary. Przepłukać igłę wodą.
      UWAGA: Igła musi mieć 33 G.
   3. Odchylić pod kątem 90° końcówkę igły insulinowej 30 G.
   4. Stwórz domową scenę przypominającą Play-Doh, aby ustawić szczeniaka z płaską głową (Rysunek 1A).
   5. Przynieś klatkę dla myszy z matką i młodymi przed przygotowaniem czegokolwiek do operacji, aby umożliwić im aklimatyzację w nowym środowisku.
   6. Przygotuj tacę z mokrym lodem i pustą klatkę z odrobiną papieru na izofluran.
2. Znieczul szczeniaka myszy.
   1. Namocz kartkę papieru izofluranem (zobacz Tabelę Materiałów) i umieść ją w pustej klatce. Ostrożnie weź jedno szczenię i umieść je w klatce z papierem nasączonym izofluranem.
      UWAGA: Nigdy nie zostawiaj mniej niż trzech szczeniąt z mamą. Nie należy przekraczać 20-30 s znieczulenia izofluranem, w przeciwnym razie szczenię może umrzeć.
   2. Sprawdź efekt znieczulenia poprzez zaprzestanie ruchu.
   3. Natychmiast po znieczuleniu umieść szczeniaka na mokrej chusteczce na powierzchni mokrego lodu. Trzymaj zwierzę na lodzie przez 3 minuty, aż górne kończyny staną się białe (ryc. 1B, niebieska strzałka). Zwykle zajmuje to 2-3 minuty.
   4. Wykorzystaj ten czas, aby załadować strzykawkę z zawiesiną komórek. Wcześniej ostrożnie zawiesić komórki za pomocą pipety.
   5. Umieść szczeniaka na ramie stereotaktycznej. Użyj nauszników w przeciwnym kierunku (Rysunek 1A, purpurowe strzałki).
      UWAGA: Tylna strona nauszników jest mniej spiczasta, a ponieważ szczenięta P2 nie mają uszu, użyj bardziej płaskiej strony, aby uniknąć zranienia zwierzęcia.
   6. Z boku sprawdź, czy głowa jest prosta. Głowa musi być płaska; użyj sceny podobnej do Play-Doh, aby się do tego dostosować.
      UWAGA: Szczenięta w tym wieku nie otworzyły jeszcze oczu, więc nie trzeba podejmować żadnych dodatkowych kroków w tym zakresie. Szczenięta w tym wieku nie mają sierści, więc nie jest wymagane golenie tego obszaru. Nie stosuje się specjalnego leczenia bólu, ponieważ nie jest to otwarte nacięcie skóry i nie wymaga szycia.
   7. Trzymaj szczeniaka przykrytego lodem (na bibułce) przez cały czas trwania zabiegu.
      UWAGA: Nie umieszczaj lodu w bezpośrednim kontakcie ze skórą szczeniaka.
3. Wykonać wstrzyknięcie.
   1. Oczyść powierzchnię skóry za pomocą miękkiej chusteczki nasączonej etanolem.
   2. Zidentyfikuj lambdę i ustaw współrzędne na zero na cyfrowej konsoli wyświetlacza przyrządu stereotaktycznego (rysunek 1C, żółta przerywana linia). Szwy strzałkowe i lambdoidalne są łatwo widoczne dla oka, ponieważ są unaczynione jako czerwone linie.
      UWAGA: Jeśli masz trudności z wizualizacją lambdy, połóż mały kawałek lodu na skórze i poczekaj kilka minut, aż ostygnie. Następnie usuń kawałek lodu, a subtelne wybielenie skóry pozwoli Ci to na wizualizację.
   3. Przesunąć igłę iniekcji do żądanych współrzędnych. W opisanym protokole regionem docelowym był hipokamp, a współrzędne były następujące: przednio-tylny (AP) +0,85 i przyśrodkowo-boczny (ML) +1,35.
   4. Użyj igły insuliny wygiętej pod kątem 90°, aby przebić czaszkę i stworzyć mały otwór.
   5. Przyłożyć igłę do wstrzykiwań, aż przejdzie przez czaszkę, i wyzerować współrzędne grzbietowo-brzuszne (DV). Opuść igłę, aż do uzyskania żądanych współrzędnych DV. W opisanym protokole współrzędnymi były DV −1,1.
   6. Wstrzykiwać zgodnie z wcześniej ustalonymi odstępami czasu.
      UWAGA: W opisanym protokole dokładne czasy były następujące: (i) po zejściu do współrzędnej DV odczekaj 3 minuty, (ii) wstrzyknij 1 μL objętości przez 5 minut, oraz (iii) po wstrzyknięciu całej objętości odczekaj 3 minuty.
   7. Powoli wycofać igłę.
4. Zakończ procedurę.
   UWAGA: Operacja nie może trwać dłużej niż 15 minut, aby zapewnić przeżycie szczeniaka i uniknąć uszkodzeń spowodowanych znieczuleniem przez hipotermię.
   1. Rozgrzej szczeniaka rękami, aż zacznie się poruszać, zanim oddasz go matce.
   2. Podawać DOX w stężeniu 1 mg/ml w 0,5% roztworze sacharozy jako wodę pitną przez co najmniej 2 dni przed i 3 tygodnie po przeszczepie (PT), aby kontynuować różnicowanie komórek in vivo.

Results

Rysunek 1: Przeszczep S tereotaksji u nowonarodzonych młodych myszy w P2. (A) Scena przypominająca Play-Doh służy do utrzymywania ciała szczeniaka w odpowiedniej pozycji i odwróconych nauszników (purpurowe str...

Materials