Transfer genów wspomagany elektroporacją osadzony w agarozie w progenitorach interneuronów kory myszy

1. Focal DNA injections
   1. Przygotuj mieszaninę wektorów ekspresyjnych kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA): pCAGGs-IRES-GFP (wektor kontrolny) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, w stężeniu 1 μg/μL dla każdego wektora. Dodać szybki zielony roztwór (zapas 25 mg/ml) w rozcieńczeniu 1:10.
   2. Napełnij wyciągniętą szklaną mikropipetę (0,5 mm średnicy wewnętrznej i 1 mm średnicy zewnętrznej) 10 μl mieszaniny DNA i wstrzyknij niewielkie ilości (w zakresie 25-50 nL) do wybranego obszaru (Eminence przyśrodkowego zwoju lub MGE/Ganglionic Caudal Ganglionic lub CGE) wycinka (Rysunek 1 i Rysunek 2).
2. Ostra elektroporacja
   UWAGA: Elektroporację należy wykonać natychmiast po ogniskowym wstrzyknięciu DNA.
   1. Umieść mały blok agarozy na elektrodzie szalki Petriego i przymocuj kolumnę agarozową do ruchomej elektrody osłonowej za pomocą płaskiej mikroszpatułki.
   2. Przenieś plasterek wraz z membraną nośną na blok agarozy i umieść górną elektrodę z kolumną agarozową na wybranym obszarze (MGE/CGE) plasterka.
      UWAGA: Napięcie ładowania 125 V (dwa impulsy po 5 ms każdy, interwał 500 ms) zapewni pomyślną elektroporację (ilustracja 3).
3. Po elektroporacji umieścić plaster wraz z membraną podtrzymującą w naczyniu i przenieść go do inkubatora do hodowli tkankowych CO₂ w temperaturze 37 °C.

Rysunek 1: Reprezentatywne wycinki kresomózgowia używane do eksperymentów z ostrą elektroporacją. (A-C) Plastry kresomózgowia uzyskano na trzech różnych sekwencyjnych poziomach rostrocaudalnych, wybarwionych 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). LGE: wyniosłość zwoju bocznego; MGE: wyniosłość zwoju przyśrodkowego; CGE: wyniosłość zwoju ogonowego. Podziałka = 200 μm. Żółte gwiazdki wskazują miejsce elektroporacji w każdym plasterku. Biała linia wyznacza krawędź wyniosłości zwojowej.

Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie eksperymentalnego przepływu pracy. (A) Wycinki mózgu myszy są elektroporowane odpowiednimi konstruktami, a (B) po 12 godzinach zmodyfikowane prekursory interneuronów korowych (CI) są izolowane i (C) przeszczepiane do paliusza nowonarodzonych młodych myszy (P0−P2). W celu modyfikacji aktywności niedojrzałych implantów ślimakowych, szczeniętom P14, którym przeszczepiono komórki, wstrzyknięto CNO lub nośnik przez cztery dni konstytutywne zgodnie z przedstawionym protokołem. (A') Zdjęcie zestawu do elektroporacji ostrego wycinka mózgu myszy.

Rysunek 3: Reprezentatywny udany eksperyment z elektroporacją ostrego plastora. (A) Reprezentatywny wycinek koronalny z mózgu zarodka E14,5 transfekowany w CGE zarówno plazmidami pCAGGs-IRES-GFP (białko zielonej fluorescencji), jak i pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (białko czerwonej fluorescencji) i hodowany przez 12 godzin. Sekcja została wybarwiona immunologicznie w kierunku GFP (A, B, C) i RFP (A, B, D). Obszar ramki w panelu A jest powiększony w celu pokazania ekspresji zarówno reporterów fluorescencyjnych (B), GFP (C), jak i tylko RFP (D). Biała linia wyznacza krawędź wyniosłości zwojowej. B-D: to samo zdjęcie, różne kanały lub kombinacja dwóch różnych kanałów. Podziałka = 200 μm (A), 100 μm (B-D).