Transfer genów wspomagany elektroporacją osadzony w agarozie w progenitorach interneuronów kory myszy

Streszczenie

Źródło: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineerical Interneuron Pregenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film przedstawia procedurę wstrzykiwania wektora plazmidowego przenoszącego interesujący nas gen do progenitorów interneuronów w embrionalnym wycinku mózgu, a następnie elektroporacji w celu wejścia plazmidu i ekspresji genu. Te zmodyfikowane komórki progenitorowe mogą być później wykorzystane do leczenia zaburzeń mózgu.

Protokół

1. Focal DNA injections
   1. Przygotuj mieszaninę wektorów ekspresyjnych kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA): pCAGGs-IRES-GFP (wektor kontrolny) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, w stężeniu 1 μg/μL dla każdego wektora. Dodać szybki zielony roztwór (zapas 25 mg/ml) w rozcieńczeniu 1:10.
   2. Napełnij wyciągniętą szklaną mikropipetę (0,5 mm średnicy wewnętrznej i 1 mm średnicy zewnętrznej) 10 μl mieszaniny DNA i wstrzyknij niewielkie ilości (w zakresie 25-50 nL) do wybranego obszaru (Eminence przyśrodkowego zwoju lub MGE/Ganglionic Caudal Ganglionic lub CGE) wycinka (Rysunek 1 i Rysunek 2).
2. Ostra elektroporacja
   UWAGA: Elektroporację należy wykonać natychmiast po ogniskowym wstrzyknięciu DNA.
   1. Umieść mały blok agarozy na elektrodzie szalki Petriego i przymocuj kolumnę agarozową do ruchomej elektrody osłonowej za pomocą płaskiej mikroszpatułki.
   2. Przenieś plasterek wraz z membraną nośną na blok agarozy i umieść górną elektrodę z kolumną agarozową na wybranym obszarze (MGE/CGE) plasterka.
      UWAGA: Napięcie ładowania 125 V (dwa impulsy po 5 ms każdy, interwał 500 ms) zapewni pomyślną elektroporację (ilustracja 3).
3. Po elektroporacji umieścić plaster wraz z membraną podtrzymującą w naczyniu i przenieść go do inkubatora do hodowli tkankowych CO₂ w temperaturze 37 °C.

Wyniki

Rysunek 1: Reprezentatywne wycinki kresomózgowia używane do eksperymentów z ostrą elektroporacją. (A-C) Plastry kresomózgowia uzyskano na trzech różnych sekwencyjnych poziomach rostrocaudalnych, wybarwionych 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). LGE: wyniosło...

Materiały