Wstrzykiwanie rekombinowanych wektorów związanych z adenowirusem w mysim modelu rdzeniowego i opuszkowego zaniku mięśni

Streszczenie

Źródło:
Pourshafie, N., et al. Ogólnoustrojowe dostarczanie mikroRNA przy użyciu rekombinowanego serotypu 9 wirusa związanego z adenowirusem w leczeniu chorób nerwowo-mięśniowych u gryzoni. J. Vis. Exp. (2018).

W tym filmie mysz z rdzeniowym i opuszkowym zanikiem mięśni lub dotknięta SBMA przechodzi wstrzyknięcie do żyły ogonowej rekombinowanych wektorów AAV (wektorów związanych z adeno) przenoszących plazmid kodujący terapeutyczne mikroRNA. Wektor wytwarza mikroRNA, które wiąże się ze zmutowanym AR (receptorem androgenowym)-mRNA (informacyjnym kwasem rybonukleinowym), wywołując jego degradację. Zmniejsza to akumulację toksycznych białek i pomaga poprawić funkcjonowanie układu nerwowo-mięśniowego.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Wstrzyknięcie plazmidu AAV-miRNA do żyły ogonowej

UWAGA: Ten krok wymaga dostosowania w zależności od genu docelowego oraz wieku i wagi myszy. Skorzystaj z wytycznych Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC), aby określić zakres dawek, objętość i najlepszą drogę podania w oparciu o wiek i wagę myszy. Oczekuje się, że sygnał fluorescencyjny GFP (zielone białko fluorescencyjne) i poziomy ekspresji miRNA w tkankach docelowych osiągną szczyt od 2 tygodni po wstrzyknięciu. Poniższy protokół odnosi się do samców myszy we wczesnej dorosłości. AAV powinien być traktowany jako zagrożenie biologiczne zgodnie z wytycznymi dotyczącymi poziomu bezpieczeństwa biologicznego 1.

1. Podzielić zapas plazmidu AAV-miRNA na 100-200 μl podwielokrotności zawierających miano wirusa 10^{10-10 11} genomów wirusowych na ml (vg / ml) za pomocą sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Do pracy z roztworem AAV należy stosować laboratoryjne środki ochrony indywidualnej stanowiące zagrożenie biologiczne.
   UWAGA: Po rozmrożeniu podwielokrotność można ją przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni. Zapas wirusów można przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
2. Ogranicz mysz w dostępnych na rynku ogranicznikach, takich jak plastikowa lub stożkowa rurka z folii z tworzywa sztucznego o odpowiednim rozmiarze.
3. Oczyść powierzchnię ogona chusteczkami nasączonymi 70% alkoholem.
4. Przytrzymaj ciepłą podkładkę (28-30 °C) pod ogonem przez 30 sekund, aby zwiększyć rozszerzenie naczyń krwionośnych. Alternatywnie ogrzej zwierzęta za pomocą czerwonej lampy grzewczej (w odległości 2-3 stóp) lub zanurzając ogon w ciepłej wodzie.
5. Zaczynając od dystalnej części ogona, wbij igłę (27-30 G) obciążoną podwielokrotnością wirusa, skosem do góry, 15° od ogona, do żyły. Przed wstrzyknięciem należy upewnić się, że igła została prawidłowo wkłuta.
   1. Jeśli podczas wstrzykiwania odczuwa się opór lub pod skórą pojawia się obrzęk, należy przerwać procedurę. Wyjąć igłę i ponownie umieścić ją powyżej poprzedniego miejsca wstrzyknięcia.
      UWAGA: Alternatywnie można to osiągnąć, delikatnie zasysając igłę i obserwując krew. Twarde aspiracje mogą spowodować zapadnięcie się żyły ogonowej. Jeśli żyła blednie podczas wstrzyknięcia, oznacza to, że igła jest wprowadzana prawidłowo.
6. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać kilka sekund przed podniesieniem igły.
7. Należy obserwować miejsce wstrzyknięcia pod kątem krwawienia. Wywieraj umiarkowany nacisk dwoma palcami na miejsce, aż krwawienie ustanie.
8. Umieść zwierzę z powrotem w klatce.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Scale	Pelouze	SP5
Nalgene Wiadro	Thermo Scientific	12014000	4000 mL
Probówka do mikrowirówek	USA Scientific	1615-5500
Mactated Ringer's Rozwiązanie	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini wirówka	Fisher Scientific	128101
Wirówka	Eppendorf	22624415
Folia laboratoryjna	Bemis	PM996
1-mL strzykawka	BD	309626	W zestawie dołączona igła 25g. Zastąp igłą do wstrzykiwań 27-30 g
Igła 30 g	BD	305106
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isoflurane USP 250 mL
Maska anestezjologiczna	Kopf Instruments	906
Gauze	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5cm x 5cm)
Końcówki do pipet	USA Scientific	1111-0816
Mikropipeta	Gilson	4642080
Waporyzator do znieczulenia gazowego	SurgiVet	4214322	Classic T3
Gazowy znieczulacz	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Poduszka grzewcza	Sears	17280
Podkładka stołowa	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/ Aparat Harvarda	76-0772	4 szczury / 4 myszy
70% etanolu	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 proof
70% izopropanol	VWR	89108-160