Wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie metabolitów mikrobiologicznych pochodzących z jelit w modelu mysim

Streszczenie

Źródło: Liou, C. et al. Domózgowo-komorowe dostarczanie metabolitów mikrobiologicznych pochodzących z jelit u swobodnie poruszających się myszy. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film pokazuje wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) swobodnie poruszającej się myszy w celu zbadania ich wpływu na zachowanie za pośrednictwem mózgu. Kaniula iniektorowa jest wprowadzana do kaniuli prowadzącej wszczepionej do mózgu myszy. Po wyzdrowieniu mysz aklimatyzuje się w nowej klatce. Następnie podaje się SCFA i rejestruje zachowania lokomotoryczne.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie dla zwierzęcia doświadczalnego

1. : Zdobądź od sprzedawcy 6-8-tygodniowe samce myszy C57BL/6JNarl typu dzikiego.
2. Trzymaj myszy w standardowej klatce dla myszy ze standardową karmą dla myszy i wysterylizowaną wodą ad libitum.
   UWAGA: Warunki przetrzymywania w Centrum Zwierząt Laboratoryjnych to 22 ± 1 °C, wilgotność 55% ± 10% oraz cykl jasny/ciemny 13 godzin/11 godzin.

2. Chirurgia stereotaktyczna

1. Przygotuj i wysterylizuj instrument stereotaktyczny, narzędzia chirurgiczne i powiązane przedmioty.
   UWAGA: Wszystkie przedmioty, które będą bezpośrednio stykać się z miejscem operacji, należy wysterylizować, aby uniknąć infekcji.
2. Znieczul mysz, umieszczając ją w klatce z pleksiglasu z 1%-5% izofluranem w tlenie.
   UWAGA: Uważnie obserwuj mysz, aby upewnić się, że częstość oddechów jest utrzymywana na poziomie około jednego oddechu na sekundę.
3. Wyjmij mysz z komory anestezjologicznej. Ogolić miejsce operowane (głowę myszy) za pomocą trymera dla zwierząt. Umieść mysz na ramie stereotaktycznej, mocując siekacze myszy na drążku siekacza w stereotaktycznym uchwycie siekacza. Zakryj nos maską na nos
.
4. Znieczulij mysz 1%-2,5% izofluranem w tlenie podczas operacji stereotaktycznej. Oceń nocycepcję myszy za pomocą odruchu szczypania palca u nogi i upewnij się, że jest to stała częstość oddechów przed nacięciem pola operacyjnego.
5. Umieść poduszkę grzewczą (37.0 °C) pod myszą na ramie stereotaktycznej, aby utrzymać temperaturę ciała podczas operacji. Alternatywnie można utrzymać temperaturę rdzenia za pomocą doodbytniczej sondy termicznej łączącej zaprogramowany podgrzewacz z poduszką grzewczą.
6. Usuń przycięte futro na głowie za pomocą taśmy klejącej. Wstrzyknąć myszy przeciwbólowy ketoprofen (5 mg/kg) podskórnie w celu złagodzenia bólu. Nałóż maść na oczy, aby uniknąć suchości oczu.
7. Włóż spiczastą wkładkę douszną do kanału słuchowego, aby zamocować głowę.
8. Wyśrodkuj głowę, regulując skalę paska nausznika.
9. Dokręć nos clamp na uchwycie siekacza, aby uniknąć ruchu pionowego. Delikatnie dociśnij głowę, aby sprawdzić, czy głowa jest zamocowana i uniknąć poluzowania głowy podczas kolejnej operacji.
10. Zdezynfekuj skórę głowy trzema naprzemiennymi peelingami chlorheksydyny za pomocą bawełnianego wacika. Rozpocznij każde szorowanie od środka w kierunku zewnętrznej strony (od najbardziej zdezynfekowanego obszaru środkowego do najmniej zdezynfekowanego obszaru).
    UWAGA: Użycie fartuchów od środka na zewnątrz może pomóc naukowcom zminimalizować infekcje i zanieczyszczenia sierści. Zewnętrzna część znajduje się w pobliżu nieogolonej głowy, która nadal ma dużą ilość sierści i nie jest łatwa do dokładnej dezynfekcji.
11. Naciąć skórę głowy w sposób przedni/tylny (<1 cm) za pomocą ostrza chirurgicznego. Otwórz nacięcie i wytrzyj czaszkę bawełnianym wacikiem trzymanym przez kleszcze do mikropreparacji.
    UWAGA: Kleszcze do mikropreparacji, ostrze chirurgiczne i waciki bawełniane należy wysterylizować w autoklawie przed operacją. Podczas procesu chirurgicznego należy sterylizować cały sprzęt chirurgiczny za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi (150 °C) przez co najmniej 5 sekund przed i po każdym zwierzęciu. Przygotuj wysterylizowaną zlewkę do trzymania ostrza chirurgicznego i kleszczy podczas procesu chirurgicznego i między zwierzętami.
12. Zidentyfikuj Bregmę i Lambdę na czaszce. Użyj Bregmy jako odniesienia, aby zlokalizować interesujący Cię region.
    1. Opcjonalnie: Zamontuj wiertło stereotaktyczne na uchwycie wiertła stereotaktycznego i użyj końcówki wiertła, aby wskazać Bregmę jako odniesienie. Sterylizuj wiertło stereotaktyczne za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi (150 °C) przez co najmniej 5 sekund.
13. Skalibruj i wyrównaj płaską płaszczyznę poziomą czaszki w płaszczyźnie lewej/prawej i przedniej/tylnej za pomocą Bregma/Lambda.
    UWAGA: Jeśli nie znajduje się w prawidłowej płaszczyźnie poziomej, ponownie zamontuj mysz na przyrządzie stereotaktycznym.

3. Komercyjna implantacja kaniuli prowadzącej

1. Zidentyfikuj i oznacz położenie prawej komory bocznej na podstawie współrzędnych stereotaktycznych: Odległość do Bregma, przednia / tylna (A / P): 0,26 mm, przyśrodkowa / boczna (M / L): -1,0 mm, grzbietowa / brzuszna (D / V): -2,0 mm.
   UWAGA: Współrzędne można modyfikować w zależności od obszaru zainteresowania. Współrzędne komory bocznej oparto na dorosłych myszach C57BL/6J o wadze 26-30 g.
2. Wywierć otwór (średnica = 1,5 mm) przez czaszkę w oznaczonym miejscu za pomocą wiertła stereotaktycznego do wszczepienia komercyjnej kaniuli prowadzącej.
3. Wywierć jeszcze dwa do czterech otworów (średnica = 1,5 mm) w czaszce za pomocą wiertła stereotaktycznego do montażu ze stali nierdzewnej.
   UWAGA: Sterylizuj wiertło stereotaktyczne za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi (150 °C) przez co najmniej 5 sekund przed i po każdym zwierzęciu.
4. Wytrzyj skrawki kości i zatamuj krwawienie bawełnianym wacikiem.
5. Przetrzyj czaszkę lidokainą (1 mg/kg) za pomocą bawełnianego wacika, aby uzyskać działanie znieczulające miejscowo, przeciwświądowe i przeciwbólowe. Jeśli krwawienie nie ustanie po wierceniu, delikatnie umieść bawełniany wacik na otworze do hemostazy.
6. Zamontuj dwie do czterech ze stali nierdzewnej na otworach, aby zapewnić kotwy do akrylu dentystycznego.
7. Umieść komercyjną kaniulę prowadzącą na stereotaktycznym uchwycie kaniuli i zdezynfekuj ją za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi (150 °C).
   UWAGA: Komercyjna kaniula prowadząca, komercyjny manekin i komercyjny wtryskiwacz (rysunek 1A) zostały dostosowane do specyfikacji przedstawionych w Tabeli materiałów.
8. Przesuń stereotaktyczny uchwyt kaniuli do otworu wywierconego dla komory bocznej i powoli włóż komercyjną kaniulę prowadzącą do otworu, aż do żądanej głębokości (2.5 mm).
   UWAGA: Współrzędną grzbietową/brzuszną można zdefiniować, ustawiając końcówkę komercyjnej kaniuli prowadzącej jako odniesienie, gdy końcówka jest ledwo włożona do otworu.
9. Nałożyć 10 μl kleju cyjanoakrylanu n-butylu (klej tkankowy), aby zamocować komercyjną kaniulę prowadzącą w wywierconym otworze i odczekać 3-4 minuty. Delikatnie zwolnij komercyjną kaniulę prowadzącą z uchwytu kaniuli stereotaktycznej i odsuń uchwyt.
10. Nałóż akryl dentystyczny na naciętą skórę głowy, aby zamocować komercyjną kaniulę prowadzącą i odczekaj co najmniej 5 minut. Wszczep komercyjny manekin do komercyjnej kaniuli prowadzącej, aby uniknąć zatkania kaniuli przez krew lub płyn ustrojowy (ryc. 1B).
11. Zwolnij pasek douszny z kanału słuchowego i wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej.
12. Umieść mysz w nowej klatce z poduszką grzewczą pod spodem, aby odzyskać siły po znieczuleniu i stale obserwuj, aż mysz całkowicie się obudzi.
    UWAGA: Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Zwierzę, które przeszło operację, nie powinno wracać do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
13. Umieść mysz w pomieszczeniu jednoosobowym lub grupowym, w zależności od protokołu Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) i projektu eksperymentalnego. W przypadku trzymania grupowego upewnij się, że mniej myszy jest trzymanych w klatce, aby zminimalizować niepożądane obrażenia lub odłączenie kaniuli.
14. Podawać ibuprofen (0,2 mg/ml) w wodzie do picia przez co najmniej 3 dni w celu opieki pooperacyjnej i monitorować dwa razy dziennie pod kątem objawów bólu i niepokoju przez co najmniej 3 dni.
    1. Podczas opieki pooperacyjnej nałóż maść z roksytromycyną na skórę, aby zapobiec stanom zapalnym i infekcjom u myszy.
    2. Monitoruj stan zwierzęcia i w odpowiednim czasie wstrzyknij dootrzewnowo 5% glukozy i/lub 0,9% chlorku sodu, aby zapewnić wystarczającą ilość energii.
    3. Jeśli stan bólu, niepokoju lub infekcji stale się pogarsza, poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO₂ .
15. Poczekaj 1 tydzień po operacji, aby mysz była gotowa do domózgowo-komorowego dostarczania krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) i testów behawioralnych.

4. Przygotowanie SCFA

1. Rozpuść octan sodu, maślan sodu i propionian sodu w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF) (patrz tabela materiałów).
2. Upewnij się, że chemikalia są całkowicie rozpuszczone, a następnie dostosuj pH do 7,4 i przefiltruj mieszaninę SCFA przez filtr 0,22 μm w celu sterylizacji.

5. Skonfiguruj system infuzyjny do domózgowo-komorowego dostarczania SCFA podczas testów behawioralnych

1. Zamontuj kamerę sufitową, aby zarejestrować zachowanie. Podłącz kamerę do komputera, aby sterować oprogramowaniem do nagrywania wideo (Rysunek 2).
2. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 μl wodą destylowaną.
   UWAGA: Unikać pęcherzyków powietrza w strzykawce mikrolitrowej.
3. Podłączyć pompę do mikroiniekcji ze sterownikiem mikroiniekcji.
4. Zamontować strzykawkę o pojemności mikrolitrów na pompie do mikroiniekcji. Aby zainstalować strzykawkę, naciśnij przycisk, aby poluzować zacisk i zainstalować strzykawkę w odpowiedniej pozycji. Zamknij zacisk i dokręć mocującą tłok na pompie mikrowtrysku (Rysunek 3A).
5. Włóż komercyjny wtryskiwacz do rurki polietylenowej (Rysunek 1A).
6. Zawieś rurkę polietylenową na kamerze sufitowej nad areną testową.
7. Napełnij rurkę polietylenową wodą destylowaną za pomocą strzykawki insulinowej. Podłącz strzykawkę o pojemności mikrolitrów do wiszącej rurki polietylenowej.
   UWAGA: Upewnij się, że rurka z polietylenu jest wystarczająco długa, aby mysz mogła swobodnie poruszać się po arenie testowej.

6. Ustawienia systemowe kontrolera mikroiniekcji

1. Włącz kontroler mikroiniekcji i naciśnij przycisk Wyświetl wszystkie kanały, aby uzyskać dostęp do ekranu poleceń (Rysunek 3C). Naciśnij przycisk Konfiguracja i ustaw docelowy wolumin na 9,800 nL z szybkością dostarczania na 100 nL/s. Wlej 9,800 nl wody destylowanej z rurki polietylenowej podłączonej do strzykawki mikrolitrowej (naciśnij Kierunek, aby przejść do trybu zaparzania i naciśnij URUCHOM) (patrz czerwone kwadraty na ekranie poleceń na rysunku 3C).
2. Naciśnij przycisk Konfiguracja i ustaw docelowy wolumin na 3,000 nL z szybkością dostarczania na 100 nL/s. Wyjmij 3,000 nL oleju mineralnego (naciśnij Kierunek, aby przejść do trybu wypłaty i naciśnij URUCHOM) (patrz czerwone kwadraty na ekranie poleceń na rysunku 3C).
   UWAGA: Na rurce polietylenowej należy przestrzegać wyraźnej separacji faz olej-woda.
3. Zdemontuj rurkę polietylenową z mikrolitrowej igły strzykawki. Wypluj 3,000 nL wody destylowanej z mikrolitrowej igły strzykawki (naciśnij Kierunek, aby przejść do trybu zaparzania i naciśnij URUCHOM).
4. Włóż strzykawkę o pojemności mikrolitrów z powrotem do rurki polietylenowej. Naciśnij przycisk Konfiguracja i ustaw docelowy wolumin na 9,500 nL z szybkością dostarczania 100 nL/s. Wycofaj 9,500 nL SCFA (naciśnij Kierunek, aby przejść do trybu wypłaty i naciśnij URUCHOM). Oznacz fazę olej-SCFA, aby sprawdzić, czy SCFA są pomyślnie podawane.
5. Naciśnij przycisk Configuration (Konfiguracja) i ustaw żądaną objętość docelową z szybkością podawania na 7 nL/s. Naciśnij przycisk Direction, aby przełączyć się w tryb zaparzania (patrz czerwone kwadraty na ekranie poleceń na rysunku 3C).
   UWAGA: Określ objętość na podstawie czasu infuzji. Na przykład, jeśli czas infuzji wynosi 3 minuty przy szybkości podawania 7 nL/s, objętość docelowa = 1,260 nL.
6. Naciśnij RUN, aby wlać mikrolitrową strzykawkę do przodu, aż płyn wypłynie z przodu komercyjnego wtryskiwacza przed włożeniem wtryskiwacza do kaniuli w celu wstrzyknięcia SCFA.

7. Wlew SCFA do komory bocznej przez komercyjną kaniulę prowadzącą w swobodnie poruszającej się myszy

1. Znieczulij mysz, umieszczając ją w klatce z pleksiglasu z 1%-5% izofluranem w tlenie.
   UWAGA: Uważnie obserwuj mysz, aby upewnić się, że częstość oddechów jest utrzymywana na poziomie około jednego oddechu na sekundę.
2. Zabezpiecz mysz i włóż komercyjny wstrzykiwacz do komercyjnej kaniuli prowadzącej (Rysunek 3B).
   UWAGA: Jeśli komercyjna kaniula prowadnicy jest zatkana krwią lub płynem ustrojowym, delikatnie odblokuj ją pęsetą.
3. Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu przez 15 minut w klatce przed testami behawioralnymi.
4. W podstawowym teście lokomocji umieść mysz w nowej klatce i pozwól jej swobodnie eksplorować przez 35 minut. Zainfuzuj SCFA, używając szybkości dostarczania 7 nL/s dla docelowej objętości 2,100 nL w ciągu pierwszych 5 minut (naciśnij Kierunek, aby przejść do trybu zaparzania i naciśnij RUN).
   UWAGA: Lokomocja w nowej klatce może być analizowana za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo zachowania zwierząt.
5. Znieczulij mysz (powtarzając krok 7.1) i wyjmij komercyjny wstrzykiwacz z komercyjnej kaniuli prowadzącej.
   UWAGA: Myszowi można wielokrotnie wstrzykiwać różne kontrole/metabolity po zapewnieniu odpowiedniego czasu na wypłukanie poprzedniego wstrzyknięcia. Tak długo, jak kaniula jest przymocowana do głowy myszy, mysz może być wielokrotnie testowana z różnymi metabolitami.

8. Przywrócenie systemu mikroiniekcji

1. Zdemontuj rurkę polietylenową ze strzykawki mikrolitrowej.
2. Wstrzyknąć powietrze do rurki za pomocą strzykawki insulinowej, aby wyrzucić wodę destylowaną z rurki polietylenowej. Opróżnij strzykawkę z mikrolitrem.
3. Naciśnij przycisk Reset Pos na ekranie konfiguracji, aby otworzyć ekran definicji figurki zatrzymania strzykawki (Rysunek 3C).
4. Naciskaj przycisk wycofywania, aż rozlegnie się sygnał dźwiękowy, aby zresetować pompę mikrowtrysku do całkowicie wycofanej pozycji (Rysunek 3C).
5. Wróć do ekranu poleceń i wyłącz kontroler mikroiniekcji, jeśli na tym ekranie pojawi się znak **OSIĄGNIĘTO KONIEC** (Rysunek 3C).

Wyniki

Rysunek 1: Implantacja komercyjnej kaniuli prowadzącej u myszy. (A) Reprezentatywny obraz komercyjnej kaniuli prowadzącej, manekina i wstrzykiwacza. (B) Reprezentatywny obraz komercyjnej kaniuli prowadzącej i manekina wszczepionych do mózgu ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiał:
Advil Liqui-Gels Solubilizowany ibuprofen A2:D41	Pfizer	n/a
Butelkowy filtr próżniowy, 500 mL, 0,22 μm, PES, sterylny	NEST	121921LA01
CaCl₂	Sigma-Aldrich	C1016	ACSF: 0,14 g/L
Peeling chlorheksydynowy 2%	Phoenix	NDC 57319-611-09
Roztwór chlorheksydyny	Phoenix	NDC 57319-599-09
Manekin handlowy	RWD Life Science	62004	Single_OD 0,20 mm/ M3,5/G = 0,5 mm
Komercyjna kaniula prowadząca	RWD Life Science	62104	Single_OD 0,41 mm-27G/ M3,5/C = 2,5 mm
Komercyjny wtryskiwacz	RWD Life Science	62204	Single_OD 0,21 mm-33G/ Pasuje do M3,5/C = 3,5 mm/G = 0,5 mm
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	ACSF: 0,61 g/L
Akryl dentystyczny	HYGENIC	n/a
mocujące	RWD Life Science	62521
Surowica dla koni	ThermoFisher Scientific	16050130
Strzykawki insulinowe	BBraun	XG-LBB-9151133S-1BX	1 ml
Isoflurane	Panion & BF biotech	DG-4900-250D
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	ACSF: 0,19 g/L
Ketoprofen	Swiss Pharmaceutical	n/a
Lidokaina	AstraZeneca	n/a
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Invitrogen	16520
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M8266	ACSF: 0,19 g/L
Szkiełka mikroskopowe	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001E
Olej mineralny light, biały NF	Macron Fine Chemicals	MA-6358-04
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	ACSF: 7,46 g/L
NaH₂PO₄	Sigma-Aldrich	S8282	ACSF: 0,18 g/L
NaHCO₃	Sigma-Aldrich	S5761	ACSF: 1,76 g/L
klej cyjanoakrylowy n-butylu (klej tkankowy)	3M	1469SB	3M Vetbond
Znacznik neuronowy	Santa Cruz	SC-358883	FluoroGold
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148
Rurka polietylenowa	RWD Life Science	62329	OD 1,50, ID 0,50 mm i OD 1,09, ID 0,38 mm
Puralube Vet (oko) Maść	Dechra	12920060
Octan sodu	Sigma-Aldrich	S2889	SCFA: 13,5 mM
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	S2002
Maślan sodu	Sigma-Aldrich	B5887	SCFA: 8 mM
Propionian sodu	Sigma-Aldrich	P1880	SCFA: 5,18 mM
Kaniula prowadząca ze stali nierdzewnej	Chun Ta przedsiębiorstwo ze stali nierdzewnej CO., LTD.	nie dotyczy	średnicy zewnętrznej 0,63 mm; Lokalny sprzedawca
Wtryskiwacz ze stali nierdzewnej	Chun Ta przedsiębiorstwo ze stali nierdzewnej CO., LTD.	brak	średnicy zewnętrznej 0,3 mm; manekin wykonany jest z wtryskiwacza; lokalny sprzedawca
Superglue	Krazy Glue	KG94548R
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
Sprzęt
Uchwyt kaniuli	RWD Life Science	B485-68217
Kamera sufitowa	FOSCAM	R2
Cyfrowe instrumenty stereotaktyczne	Stoelting	51730D
Mikroskop preparacyjny	INNOVIEW	SEM-HT/TW
Sterylizator szklanych kulek	RWD Life Science	RS1501
Poduszka grzewcza	Stoelting	53800M
Mikro kleszcze preparacyjne	ROBOZ	RS-5136	ząbkowana, lekka krzywizna; Ekstra delikatny; 0.5mm Szerokość końcówki;
Nożyczki do mikroiniekcji	ROBOZ	RS-5918	4,5-calowy kątowy
kontroler mikroiniekcji	World Precision Instruments (WPI)	MICRO2T	Kontroler SMARTouch Pompa
strzykawkowa do mikroiniekcji	World Precision Instruments (WPI)	UMP3T-1	UltraMicroPump3
Strzykawka mikrolitrowa	Hamilton	80014	10 μL
Światłowód Zimne światło z podwójnym krokiem		światłowodowym LGY-150	Lokalny sprzedawca
Trymer dla zwierząt WAHL		09962-2018
Oprogramowanie
Oprogramowanie do śledzenia wideo zachowania zwierząt	Noldus	EthoVision	Wersja: 15.0.1416

o długości 4 "