Jest to metoda wizualizacji adhezji leukocytów do śródbłonka w pobranych naczyniach poddanym ciśnieniu. Technika ta umożliwia badanie adhezji naczyniowej w warunkach przepływu ścinającego przy różnych ciśnieniach wewnątrzświatłowych do 200 mmHg, co pozwala na naśladowanie patofizjologicznych warunków nadciśnienia tętniczego.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie adhezji leukocytów do śródbłonka naczyniowego przy wysokim ciśnieniu wewnątrzświatłowym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Na całym świecie nadciśnienie tętnicze występuje u około jednej czwartej populacji i jest głównym biomedycznym czynnikiem ryzyka zgonów. W układzie naczyniowym nadciśnienie wiąże się z dysfunkcją śródbłonka i zwiększonym stanem zapalnym, co prowadzi do miażdżycy oraz różnych stanów chorobowych, takich jak przewlekła choroba nerek2, udar3 i niewydolność serca4. Pierwszym krokiem w zapaleniu naczyń prowadzącym do aterogenezy jest kaskada adhezji, która obejmuje toczenie (rolling), kotwiczenie (tethering), przyleganie oraz następującą po nich transmigrację leukocytów przez śródbłonek. Rekrutacja i gromadzenie się leukocytów na śródbłonku są pośredniczone przez nadekspresję cząsteczek adhezyjnych, takich jak cząsteczka adhezyjna komórek naczyniowych-1 (VCAM-1), wewnątrzkomórkowa cząsteczka adhezyjna-1 (ICAM-1) i E-selektyna, a także przez wzrost uwalniania cytokin i chemokin oraz nadekspresję reaktywnych form tlenu5. Metody in vitro, takie jak statyczne testy adhezji, pomagają określić mechanizmy zaangażowane w adhezję komórka-komórka, a także w analizę cząsteczek adhezyjnych. Metody zastosowane w poprzednich badaniach in vitro wykazały, że gwałtowne wzrosty ciśnienia na śródbłonku mogą prowadzić do adhezji monocytów oraz nadekspresji cząsteczek adhezyjnych i markerów zapalnych6; jednak, podobnie jak w wielu testach in vitro, badania te nie były prowadzone w czasie rzeczywistym w fizjologicznych warunkach przepływu ani z użyciem krwi pełnej. Dlatego w modelach zwierzęcych coraz częściej wykorzystuje się testy in vivo do wykazania zapalenia naczyń i rozwoju blaszki miażdżycowej. Mikroskopia witalna jest obecnie szeroko stosowana do oceny adhezji, toczenia, migracji i transmigracji leukocytów7-9. W przypadku łączenia efektów ciśnienia z adhezją leukocytów do śródbłonka, badania in vivo są mniej liczne. Jedna z takich prac bada efekty przepływu i sił ścinania na wzrost i przebudowę tętnic w czasie rzeczywistym, lecz markery zapalne oceniano jedynie za pomocą immunohistochemii10. Przedstawiamy tutaj model rejestracji adhezji leukocytów w czasie rzeczywistym w nienaruszonych, poddanym ciśnieniu naczyniach krwionośnych z wykorzystaniem perfuzji krwi pełnej. Metodologia ta jest modyfikacją modelu perfuzji komory naczyniowej ex vivo9, która umożliwia analizę w czasie rzeczywistym interakcji adhezyjnych między leukocytami a śródbłonkiem w nienaruszonych naczyniach. Nasza modyfikacja pozwala na manipulację ciśnieniem wewnątrzświatłowym do 200 mmHg, co umożliwia badania nie tylko w fizjologicznych warunkach przepływu, ale także w różnych warunkach ciśnienia. Choć systemy mikrografii ciśnieniowej były wcześniej wykorzystywane do obserwacji ściany naczyń i średnicy światła11 oraz skurczu naczyń, jest to pierwszy raz, gdy wykazano interakcje leukocyt-śródbłonek w czasie rzeczywistym. Prezentujemy tę technikę z wykorzystaniem tętnic szyjnych pobranych od szczurów i kaniulowanych do wykonanej na zamówienie komory przepływowej sprzężonej z mikroskopem fluorescencyjnym. Komora naczyniowa jest wyposażona w duże szkiełko przykrywowe na dnie, co umożliwia zastosowanie obiektywu o dużej średnicy i krótkiej odległości roboczej do obrazowania naczynia. Ponadto można wykorzystać wybrane agonisty i/lub antagonisty, aby dalej badać mechanizmy kontrolujące adhezję komórkową. Zalety tej metody w stosunku do mikroskopii witalnej obejmują brak konieczności przeprowadzania inwazyjnego zabiegu chirurgicznego, co pozwala na uzyskanie większej przepustowości badań. Metoda ta umożliwia również zastosowanie miejscowej terapii inhibitorami w wybranym naczyniu, podczas gdy metoda witalna umożliwia jedynie systemowe podanie inhibitora.
Protokół
1. Izolacja tętnic szyjnych
- Uśmierć 10-tygodniowe szczury Sprague Dawley poprzez uduszenie CO2/O2.
- Wypreparuj lewą i prawą tętnicę szyjną wspólną wraz z aortą i sercem, dbając o minimalne rozciąganie naczyń.
- W lodowatym buforze Krebsa oddziel tętnice szyjne od aorty i serca, a następnie przeprowadź precyzyjną dyssekcję.
- Przechowuj wyizolowane naczynia w buforze Krebsa w lodzie przed montażem.
Przybliżony czas = 45 min
2. Przygotowanie komory naczynia
- Przez proksymalny i dystalny konektor komory naczyniowej przepłucz bufor Krebsa, utrzymując fizjologiczne pH poprzez infuzję karbogenu (95% O2; 5% CO2) do bufora w temperaturze 37°C.
- Upewnij się, że rurki i kaniule zostały całkowicie przepłukane i są odpowiednio wyrównane.
- Przepłucz buforem Krebsa przetworniki P1 (proksymalny) i P2 (dystalny). Zamknij kurki, aby upewnić się, że w przetwornikach nie ma pęcherzyków powietrza.
- Podłącz przetworniki do odpowiadających im konektorów i ponownie przepłucz buforem Krebsa, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Zamknij kurki prowadzące do komory.
Przybliżony czas = 15 min
3. Pressuryzacja komory naczynia
- Włącz urządzenie do generowania ciśnienia: serwomechanizm ciśnienia, monitor ciśnienia oraz pompę perystaltyczną (Rysunek 1).
- Przy włączonej pompie perystaltycznej i serwomechanizmie ciśnienia ustawionym na tryb automatyczny, przepuść bufor Krebsa przez dren przy ciśnieniu 20 mmHg (pokrętło na pozycji 1), upewniając się, że w układzie nie ma pęcherzyków powietrza.
- Podłącz dren do zamkniętego przetwornika P2. Ciśnienie powinno się ustabilizować.
- Otwórz kran P2 prowadzący do komory naczynia, aby wypłukać pęcherzyki powietrza, a następnie go zamknij.
- Napełnij kąpiel buforem Krebsa (5 - 7 mL).
Oryż. czas = 10 mins
4. Montaż naczynia
- Pod mikroskopem stereoskopowym nałóż czarne opaski poliestrowe na każdą kaniulę (Rysunek 2).
- Rozsuń kaniule i uchwyty kaniul, a następnie zamocuj ¼ naczynia (koniec łuku aorty) na kaniuli P1. Należy uważać, aby nie przerwać naczynia.
- Za pomocą strzykawki wypełnionej buforem Krebsa delikatnie wypłucz nadmiar krwi z naczynia przez przetwornik P1. Zamknij dostęp z P1 do komory.
- Zabezpiecz naczynie na kaniuli P1 za pomocą opaski poliestrowej.
- Zbliż kaniule/uchwyty kaniul w celu zamocowania naczynia na kaniuli P2.
- Zamocuj koniec dystalny naczynia (~¼ długości) na kaniuli dystalnej. Zabezpiecz opaską poliestrową.
Orysz. czas = 20 min
5. Nadawanie ciśnienia w naczyniu
- Dostosuj uchwyty kaniul, aby upewnić się, że naczynie nie jest zgięte ani nadmiernie rozciągnięte.
- Przy zamkniętych zaworach P1 i P2 do komory przełącz serwomechanizm ciśnienia z trybu automatycznego na ręczny. Sprawdź na serwomechanizmie ciśnienia, czy w ciągu 10 sekund nie następuje ciągły spadek ciśnienia. Jeśli tak, występuje nieszczelność, a połączenia i przetworniki muszą zostać odpowiednio zabezpieczone.
- Przełącz serwomechanizm ciśnienia z powrotem w tryb automatyczny, a następnie otwórz zawór P2 do komory. Obserwując pod mikroskopem, zauważ rozszerzenie naczynia w momencie otwarcia zaworu do komory.
- Przełącz serwomechanizm ciśnienia w tryb ręczny. Ponownie sprawdź, czy w ciągu 10 sekund nie następuje ciągły spadek ciśnienia. Jeśli występuje nieszczelność, system nie jest szczelny ciśnieniowo, co prawdopodobnie oznacza dziurę w naczyniu.
- Przełącz z powrotem w tryb automatyczny i otwórz zawór P1 do komory. W ustawieniu ręcznym sprawdź, czy ciśnienie pozostaje stabilne.
- W przypadku braku nieszczelności, w ustawieniu ręcznym zwiększ wartość na pokrętle do 2 (40 mmHg).
- Ustaw tryb automatyczny i obserwuj naczynie pod mikroskopem. W razie potrzeby dostosuj uchwyt kaniuli, aby upewnić się, że naczynie nie jest zgięte. Sprawdź szczelność w ustawieniu ręcznym.
- Powtarzaj kroki 5.6 - 5.7, zwiększając wartość na pokrętle do 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) i kolejnych, aż do osiągnięcia pożądanego ciśnienia.
Oryż. czas = 15 - 30 min
6. Inkubacja naczynia ciśnieniowego
- Podłączyć kontroler temperatury ustawiony na 37°C.
- Za pomocą drugiej pompy perystaltycznej perfundować bufor Krebsa (1 mL/min) do kąpieli w komorze naczyniowej.
- Podłączyć aspirator do komory, upewniając się, że usuwana jest tylko górna warstwa kąpieli.
- Inkubować naczynie pod ciśnieniem w temperaturze 37°C przez 1 godzinę przy ustawieniu ciśnienia w trybie automatycznym.
- Okresowo sprawdzać szczelność układu pod względem wycieków ciśnienia (przełączając na tryb ręczny).
- Efekty różnych interwencji farmakologicznych można obserwować, po prostu dodając związek do kąpieli podczas inkubacji.
Czas trwania: ok. 1 godzina
7. Perfuzja naczynia pod ciśnieniem pełną krwią
- Podczas inkubacji należy uzyskać co najmniej 7,5 mL pełnej krwi ludzkiej na naczynie, pobranej do 40 U heparyny/mL krwi. Inkubować w probówce typu Falcon 50 ml w temperaturze 37°C.
- Na 10 minut przed zakończeniem inkubacji należy znakować krew barwnikiem VybrantDil (1:1000) przez 10 minut w temperaturze 37°C w ciemności.
- Po 10 minutach zebrać krew do strzykawki, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza, a następnie podłączyć ją do pompy strzykawkowej z osłoną grzewczą ustawioną na 37°C.
- Zamknąć przetwornik P1 prowadzący do komory/naczynia i podłączyć strzykawkę oraz przewód odpływowy.
- Przepłukać układ krwią z przepływem 1000 μL/min przez przewód odpływowy, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
- Otworzyć P1 do komory. Serwomechanizm ciśnienia automatycznie dostosuje parametry, aby utrzymać pożądane ciśnienie.
- Perfundować krew z przepływem 100 μL/min.
- Używając mikroskopu fluorescencyjnego sprzężonego z kamerą cyfrową, zarejestrować dwa pola perfundowanego naczynia przez 15 sekund w odstępach 1, 3, 5, 7,5 i 10 minut.
- Po perfuzji integralność i funkcję śródbłonka można ocenić za pomocą technik farmakologicznych, takich jak miograf, a ekspresję cząsteczek adhezyjnych można określić metodą immunohistochemii w celu dalszej walidacji odpowiedzi zapalnej.
Oryż. czas = 15 mins
8. Reprezentatywne wyniki:
Schematyczny rysunek układu komory ciśnieniowej przedstawiono na Rysunku 1. Dzięki zastosowaniu kamery cyfrowej sprzężonej z mikroskopem fluorescencyjnym wyniki można wizualizować natychmiastowo za pomocą nagrań wideo w czasie rzeczywistym. Reprezentatywne obrazy wideo widoczne są na Rysunku 3, gdzie leukocyty uznaje się za przylepione do śródbłonka, jeśli pozostają w bezruchu przez 10 sekund. Dzięki nagraniom wideo w pętli można obliczyć średnią liczbę przylepionych komórek na pole widzenia. Choć zarówno niskie (Rysunek 3A), jak i wysokie (Rysunek 3B) ciśnienie powodują pewien stopień adhezji, przy wyższym ciśnieniu wewnątrzświatłowym obserwuje się znaczący wzrost adhezji leukocytów, co zostało również wykazane ilościowo (Rysunek 4).
Rycina 1. Schemat komory naczyniowej do badań ex vivo pod ciśnieniem. Kaniulowane naczynie połączone z proksymalnym (P1) i dystalnym (P2) przetwornikiem, co umożliwia manipulację ciśnieniem krwi wewnątrz naczynia. Perfuzja odbywa się poprzez przetwornik P1, a ciśnienie jest utrzymywane za pomocą przetwornika P2.
Rysunek 2. Kanula z wiązaniami. Do każdej kanuli przymocowano czarne poliestrowe wiązania.
Rycina 3. Reprezentatywne obrazy wideo. Dynamiczna adhezja komórek (czerwona strzałka) w świetle fluorescencyjnym przy 80 mmHg (A) i 120 mmHg (B) po 10 minutach perfuzji.
Rysunek 4. Adhezja leukocytów w tętnicach szyjnych szczurów Sprague Dawley po 1 godzinie inkubacji przy niskim (80 mmHg) i wysokim ciśnieniu (120 mmHg). ***P<0.001, analizowane za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami (2-way repeated measures ANOVA) z zastosowaniem testu post hoc Bonferroniego.
Dyskusja
Jest to zmodyfikowana metoda badania adhezji leukocytów do śródbłonka w nienaruszonych, izolowanych naczyniach krwionośnych w czasie rzeczywistym, w warunkach ciśnieniowych. Sama perfuzja komory naczyniowej umożliwia szybką walidację prozapalnych szczepów dużych naczyń myszy i szczurów. Możliwość manipulacji ciśnieniem pozwala na obserwację dynamicznych interakcji komórkowych w zakresie od niskiego do bardzo wysokiego ciśnienia wewnątrzświatłowego, co lepiej odwzorowuje warunki fizjologiczne i patofizjologiczne. Za pomocą odpowiedniego programu do obrazowania komórek można również zmierzyć średnicę naczyń, a w konsekwencji określić i manipulować przepływem ścinającym oraz jego szybkością.
Dzięki możliwościom miograficznym, zastosowanie interwencji farmakologicznych w kąpieli wprowadza dodatkowy wymiar możliwych warunków eksperymentalnych w tym modelu, co umożliwia badania szlaków mechanistycznych i sygnalizacyjnych. Chociaż podczas manipulacji ciśnieniem nie można potwierdzić zachowania śródbłonka, odpowiedzi na ACh i PE można przeprowadzić po perfuzji9.
Należy zaznaczyć, że ta konfiguracja demonstruje wpływ ciśnienia wewnątrzświatłowego na oddziaływania międzykomórkowe, a nie efekty tętniącego przepływu krwi ani ciśnień skurczowych lub rozkurczowych. Ponadto, choć zaobserwowano wpływ gwałtownych zmian ciśnienia na adhezję leukocytów, układ ten może być również wykorzystany do badania przewlekłych efektów ciśnienia (np. poprzez wydłużenie czasu inkubacji i zastosowanie modelu zwierzęcego z przewlekłym nadciśnieniem). W tej konfiguracji zaprezentowano tętnice szyjne wspólne szczurów Sprague Dawley, jednak można zastosować inne linie i gatunki, odpowiednio dostosowując rozmiar kaniuli. W rzeczywistości istotne jest, aby zauważyć, że wiek i masa ciała zwierząt wpływają na rozmiar naczynia, a zatem konfiguracja musi być dostosowana indywidualnie do każdego naczynia. Staranna i dokładna dyssekcja tkanki łącznej może znacznie poprawić wizualizację leukocytów.
Oświadczenia
Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Alfred Medical Research and Education Precinct oraz Komisję Etyczną Alfred Hospital.
Podziękowania
Niniejsze badanie było częściowo finansowane przez program OIS rządu stanu Wiktoria, granty programowe i projektowe National Health and Medical Research Council of Australia (JPF Chin-Dusting) oraz stypendium doktoranckie (D Michell).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikroskop | Carl Zeiss, Inc. | SteREO Discovery V.20 | |
| Pompa strzykawkowa PHD 2000 | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
| Aparat cyfrowy i kontroler | Hamamatsu Corp. | C4742-95 | |
| System iluminacji fluorescencyjnej | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
| Komora naczyniowa | Instrumentacja systemów żywych | CH/1/SH | |
| Serwokontroler ciśnienia i pompa perystaltyczna | Aparatura do badania układów żywych | PS - 200 | |
| Monitor ciśnienia perfuzyjnego | Aparatura do badania systemów żywych | PM - 4 | |
| 2 x przetwornik ciśnienia | Instrumentacja systemów żywych | PT - F | |
| Regulator temperatury | Aparatura do badań systemów żywych | TC-01 | |
| Pompa perystaltyczna | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
| roztwór do znakowania komórek VybrantDil | Invitrogen | V-22885 | Stosować w rozcieńczeniu 1:1000 |
Bibliografia
- Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
- Szczech, L. A. Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension. Circulation. 121, 2183-2191 Forthcoming.
- Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke. Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).
- Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. JAMA. 275, 1557-1562 (1996).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Riou, S. High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall. Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).
- Ley, K., Gaehtgens, P. Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res. 69, 1034-1041 (1991).
- Bernhagen, J. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13, 587-596 (2007).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Eberth, J. F. Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling. J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).
- Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator. J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).
Przedruki i uprawnienia
