Koherentna spektroskopia Ramana antystokesa do wizualizacji mielinizowanych neuronów w tkance mózgowej myszy

Streszczenie

Źródło: McCullagh, E. A., et al. Koherentna spektroskopia Ramana Antystokesa (CARS) do obrazowania mielinizacji w wycinkach mózgu. J. Vis. Exp. (2022)

Film demonstruje obrazowanie fluorescencyjne i koherentną spektroskopię Ramana antystokesa (CARS) w celu wizualizacji architektury neuronalnej w tkance mózgowej gryzoni. Barwienie Nissl znakuje ciała komórkowe poprzez wiązanie się z rybosomalnym RNA, podczas gdy obrazowanie CARS celuje w mielinę bogatą w lipidy za pomocą sygnałów indukowanych laserem. Nałożenie na siebie obrazów fluorescencyjnych i CARS zapewnia szczegółowy widok ciał komórkowych i mielinizowanych aksonów.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Barwienie

1. Sekcje bez barwników pływających dla Nissl, do wizualizacji ciał komórkowych (1:100), w pożywce z przeciwciałami (pożywka AB: 0,1 M bufor fosforanowy (PB: 50 mM KH2PO4, 150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)) przez 30 minut w temperaturze pokojowej na standardowym wytrząsarce laboratoryjnej.
   1. Chroń sekcje przed światłem za pomocą folii aluminiowej i/lub osłony. Długości fal 550 nm lub niższe są zgodne z obrazowaniem CARS (rysunek 1).
      UWAGA: Chociaż nie spodziewamy się, aby Triton-X lub inne odczynniki miały wpływ na obrazowanie lipidów metodą CARS, uzasadnione mogą być dodatkowe kontrole z użyciem określonych pożywek z przeciwciałami.
2. PUNKT PAUZY: Swobodnie pływające sekcje (chronione przed światłem) należy przechowywać w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) do czasu obrazowania. Po przeprowadzeniu sekcji zobrazuj skrawki mózgu w ciągu 2 tygodni.

2. Obrazowanie

UWAGA: Zestaw laserowy CARS zawiera laser światłowodowy, który zapewnia zegar 80 MHz, oraz laser OPO (Optical Parametric Oscillator) o przestrajalnym zakresie 770-990 nm z wiązką Stokesa ustaloną na 1031 nm, które są potrzebne do zbierania sygnału CARS. Dla obu belek jest jeden otwór.

1. Przed dostarczeniem próbek do mikroskopu włącz i rozgrzej laser CARS przez co najmniej 1 godzinę, ustaw laser CARS i Koehlera optykę kondensora i przysłonę mikroskopu do obrazowania CARS do przodu.UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego działania mikroskopii CARS.
   1. Aby przestrzenne wyrównanie dwóch wiązek laserowych (pompa i stokes), uzyskaj dostęp do dwóch wewnętrznych PSD (detektorów czułych na położenie) za pośrednictwem CARS laser GUI (graficzny interfejs użytkownika).
   2. Osiągnij wyrównanie czasowe za pomocą funkcji opóźnienia w graficznym interfejsie użytkownika lasera CARS, która może pomóc w nakładaniu się impulsów dwóch laserów (pompy i stoków), które mają różne dyspersje ze względu na różne długości fal. W związku z tym zarówno czasowe, jak i przestrzenne nakładanie się belek pompy i stokesów odbywa się przy udziale użytkownika za pośrednictwem graficznego interfejsu użytkownika.
   3. Wyreguluj zewnętrzny peryskop (dwa ostatnie zwierciadła konfiguracji), aby wyśrodkować przestrzennie nakładające się dwa lasery na lustra głowicy skanującej mikroskopu.
   4. Aby uzyskać najlepszą detekcję CARS bez detekcji do przodu, upewnij się, że kondensator jest kondensator Koehlera (co oznacza, że kondensator jest wyśrodkowany i skupiony na membranie, aby uzyskać równomierne oświetlenie)
2. W przypadku immunofluorescencyjnego obrazowania konfokalnego i obrazowania CARS należy wyposażyć laser CARS zarówno w detektory niedeskanowane (NDD) do przodu, jak i epi CARS, poprzez włączenie mikroskopu konfokalnego wyposażonego w widzialne lasery do obrazowania fluorescencyjnego (ryc. 2).
3. Umieść skrawki w naczyniu hodowlanym ze szkiełkiem nakrywkowym (do mikroskopii odwróconej), PBS, aby uniknąć wysychania tkanki, i szklanym ciężarkiem, aby utrzymać tkankę w pobliżu szkiełka nakrywkowego.
4. Wykonuj stosy z lub pojedyncze zdjęcia za pomocą obiektywu wodnego z korekcją podczerwieni 60X, apertury numerycznej 1,2 (NA), który służy do zbierania sygnału CARS w kierunku epi i przez kondensator 0,55 NA w kierunku do przodu do obrazowania obszarów mózgu, takich jak jądro przyśrodkowe ciała trapezowego (MNTB).
   1. Wykonaj obrazy CARS przy pompie/sondzie o mocy około 600 mW i Stokesie 300 mW, korzystając z laserowego interfejsu użytkownika CARS. Te wartości mocy lasera są mierzone wewnętrznie przez system. Moc obu laserów w miejscu pobrania próbki jest mniejsza niż 25 mW i jest bezpieczna dla próbki tkanki.
   2. Załóż na siebie pompę i belki Stokesa przestrzennie i czasowo. Dostrój OPO do 797.2 nm. Daje to długość fali CARS 650 nm. Ze względu na wyższy poziom energii, wynikający z tego powrót do stanu podstawowego jest anty-Stokesem (przesunięty na niebiesko) do wzbudzenia.
   3. Przechwyć sygnał CARS w detektorach epi lub forward non-descanned za pomocą filtrów pasmowoprzepustowych (640-680 nm), a następnie sekwencyjnie wykrywaj znacznik immunofluorescencji (w tym przypadku fluorescencyjnie znakowany Nissl). nuta: Marker somy neuronalnej Nissl nie jest wychwytywany przez filtr pasmowo-przepustowy CARS 640-680 nm, co pozwala na połączenie obrazowania fluorescencji i CARS na obrazach przedstawionych poniżej.
   4. CARS i fluorescencja nie dzielą PMT. Użyj tych ustawień, aby uzyskać optymalny sygnał lipidowy, aby selektywnie obrazować mielinizację w obszarze mózgu. ostrożność: Osłanianie użytkownika przed wiązką lasera
5. Zapisz obrazy jako pliki .oib, które można zaimportować do programu do analizy obrazu w celu dalszej oceny ilościowej (ilustracja 3).

Wyniki

Rysunek 1: Obrazowanie CARS można połączyć z obrazowaniem immunofluorescencyjnym. Wykresy pokazują, że obrazowanie CARS odbywa się w widmie sygnału czerwonego 660/640 nm. Ta długość fali jest wystarczająco oddalona od zakresu zielonego, nieb...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Barwienie:
AB Media:			1n 1,000 mL Milipore H2O
Fosforan buforowany (PB):
Fosforan potasu Monobase	Sigma	P5655
Sodium Phosohate Dibasic	Sigma	S7907
BSA (albumina surowicy bydlęcej)	Sigma life science	A2153-100g
Chlorek sodu	Fisher Chemical	s271-1
Triton X-100	Sigma - Aldrich	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
SAMOCHODY:
Laserowy pikoszmaragdowy laser APE	Angewandte Physik & Elektronik GmbH
filtr pasmowoprzepustowy (420-520 nm)	Filtr pasmowo-przepustowy Chroma Technology	HQ470/100m-2P
(500-530 nm)	Chroma Technology	HQ515/30m-2P
pasmowoprzepustowy Filtry (640-680 nm)	Chroma Technology	HQ660/40m-2P
Mikroskop konfokalny	Olympus	FV1000
Pipeta transferowa	Fisher	13-711-7M
dichroiczny długoprzepustowy 565 nm	Chroma Technology	565DCXR
Dichroiczny długoprzepustowy 585 nm	Technologia Chroma	585dcxr
dichroiczny krótki przepust 750 nm	Chroma Technology	T750spxrxt
szklane naczynie hodowlane	MatTek	P35G-0-10-C
waga szkła (pręt boro 10 mm x 10 mm)	Allen Scientific Glass Inc
wielofotonowy filtr emisji krótkoprzepustowej 680 nm	Technologia Chroma	ET680sp-2p8
PBS