Obrazowanie dynamiki wapnia w komórkach rzęsatych linii bocznej larw danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Łukasz, D., et al. Obrazowanie in vivo wapnia komórek rzęsatych linii bocznej u larw danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje obrazowanie na żywo napływu wapnia do komórek rzęsatych linii bocznej sparaliżowanej transgenicznej larwy danio pręgowanego przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Mechaniczna stymulacja wiązek włosów za pomocą impulsów płynu indukuje wnikanie wapnia przez kanały mechanotransdukcji i kanały bramkowane napięciem, co jest wizualizowane w czasie rzeczywistym za pomocą wskaźników fluorescencyjnych. Metoda ta uwypukla wierzchołkową i podstawową dynamikę wapnia w komórkach rzęsatych nerwu jastrowego, wyjaśniając ich rolę w wykrywaniu ruchu wody.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przypinanie i unieruchamianie larwy do komory obrazowania
   1. Kąp larwę Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) w około 1 ml buforu zarodka (E3) zawierającego 0,04% MS-222 przez 1–2 minuty na silikonowej powierzchni enkapsulantu komory obrazowania, aż larwa stanie się nieruchoma lub przestanie reagować na dotyk.
      1. Pod mikroskopem stereoskopowym umieść larwę na środku komory perfuzyjnej tak, aby leżała płasko na boku na silikonow....

Wyniki

Rysunek 1: Komora obrazowania, procedury montażu danio pręgowanego i iniekcji serca oraz igły. (A) Pokazana jest komora obrazowania z larwą (obrysowaną przerywanym prostokątem) przypiętą do środka na szczycie silikonowej obudowy. (B1).......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
α-Bungarotoxin	R&D Systems	2133	Do paraliżowania larw przed obrazowaniem
Komora obrazowania	Siskiyou	PC-R	Platforma do montażu larw do obrazowania
nr 1.5 Szkiełka nakrywkowe kwadratowe, 22*22 mm	VWR	48366-227	Do uszczelnienia komory obrazowania
Wysokopróżniowy smar silikonowy	Fischer Scientific	14-635-5D	Do mocowania szkiełka nakrywkowego do komory obrazowania
Silikonowa kapsułka przezroczysta 0,5 g zestaw	Ellsworth Adhesives	Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0,5 KG	Do wypełnienia komory obrazowania w celu stworzenia powierzchni do przypinania ryb
Stereoskop	Carl Zeiss Mikroskopia	Stemi 2000 z oświetleniem światłem przechodzącym	Do oświetlania drutu, kleszczyków i nożyczek do robienia szpilek
Kleszcze	precyzyjne Narzędzia do nauki	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Nr kat. 11295-10 Do	robienia szpilek
Cienkie nożyczki	Cole-Palmer	5,5", EW-10818-00	Do cięcia drutu tunsgten do robienia szpilek
Drut wolframowy, 0,035 mm	Goodfellow	W005131	Do szpilek na głowę do unieruchamiania larw
Drut wolframowy, 0,025 mm	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	Do sworzni ogonowych do unieruchamiania larw
Kapilary ze szkła borokrzemianowego bez włókna	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	Szkło do wciągania w igły do strumienia płynów w celu stymulacji komórek rzęsatych
Cienkie kleszcze	Fine Science Tools	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Nr kat. 11295-10	Do przypinania larw
Żel Wskazówki dotyczące ładowania	Eppendorf	5242956003	Do wypełniania igieł do wstrzykiwań serca
Mikroskop stereoskopowy	Carl Zeiss Mikroskopia	Stemi 2000 z oświetleniem w świetle przechodzącym Do	oświetlania larw podczas przypinania i iniekcji serca
Szklany uchwyt kapilarny/igły	WPI	MPH315	Do trzymania igieł do strumienia płynów
Mikromanipulator ręczny	Narishige	M-152	Do przytrzymywania i pozycjonowania uchwytu igły do wstrzykiwania α-bungarotoxin
Stojak magnetyczny	Narishige	GJ-1	Do trzymania ręcznego mikromanipulatora do wstrzykiwania α-bungarotoksyny
Wtryskiwacz ciśnieniowy	Eppendorf	Femtojet 4x	Do dostarczania α-bungarotoksyny
Mikroskop konfokalny	Bruker	Sweepfield/Opterra	Stały, pionowy mikroskop z optyką DIC i laserem 488 nm z odpowiednimi filtrami
Oprogramowanie mikroskopu	Bruker	Prairieview 5.3	Do koordynowania i sterowania mikroskopem, laserami, stolikiem, piezo-z, kamerami i strumieniem płynu
10-krotny obiektyw powietrzny	Nikon	MRH00101	Niskie powiększenie do pozycjonowania larw i strumienia płynu
Obiektyw wodny 60x	Nikon	MRF07620	Obiektyw z immerysonem wodnym o wysokim NA (1,0) i odpowiedniej odległości roboczej (2,0 mm)
Skaner obiektywowy Piezo-Z ze sterownikiem/sterownikiem	Physik Intruments instruments/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	Szybka akwizycja stosu Z z dokładnością 0,025um
Kamera EMCCD	QImaging	Rolera EM-C2 Kamera EMCCD	o małym rozmiarze piksela, która może rejestrować do 100 klatek na s
Adapter	komory okrągłejSiskiyou	PC-A Do	trzymania i obracania komory obrazowania na stoliku mikroskopu
Zmotoryzowany stolik Z-deck	Wcześniejszy	ZDN12MP	Stolik mikroskopowy, który może trzymać i przesuwać razem próbkę i mikromanipulator z igłą do strumienia płynu
Adapter do wkładki stopnia Z-deck	NIH Warsztat maszynowy	na zamówienie	Aby dopasować adapter komory okrągłej do stolika z pokładem Z-deck
Aparatura	do strumienia płynuALA scientific instruments	HSPC-1 Szybkoobrotowy zacisk ciśnieniowy z pompą PV Do	kontrolowania i dostarczania bodźca strumienia płynu
Masterflex Rurka silikonowa utwardzana nadtlenkiem (1 stopa)	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	Do podłączenia uchwytu igły do strumienia płynu do pompy ciśnieniowej
Mikromanipulator z napędem	Sutter Instrument Company	MP-225	Do trzymania i pozycjonowania uchwytu igły do płynu sterownik
mikromanipulatora	strumieniowego Sutter Instrument Company	MPC-200	Do sterowania manipulatorem igłowym ze strumieniem płynu
Końcówki do ładowania żelu	Eppendorf	5242956003	Do zasypywania igieł do strumienia płynu
Szklany uchwyt kapilarny/igły	WPI	MPH315	Do trzymania igieł do strumienia płynów
Manometr PSI	Sper Scientific	840081	Do pomiaru wyjście zaciskowe
ciśnienia Prism7	Graphpad	Prism7	Oprogramowanie do wykreślania zmian
FIJI	Schindelin, et., al.34	https://fiji.sc/ Oprogramowanie	do przetwarzania obrazów i tworzenia map sygnałów czasoprzestrzennych
Turboreg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	Wtyczka do rejestracji sekwencji obrazów GCaMP6 w FIJI
StackReg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/	Wtyczka do rejestracji sekwencji obrazów GCaMP6 w FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin	Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA	a href='https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html'>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html	Wtyczka do tworzenia wielu ROI w celu pomiaru zmian intensywności GCaMP6

naukowy silnikowym intensywności GCaMP6<