Obrazowanie dynamiki wapnia w komórkach rzęsatych linii bocznej larw danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Łukasz, D., et al. Obrazowanie in vivo wapnia komórek rzęsatych linii bocznej u larw danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje obrazowanie na żywo napływu wapnia do komórek rzęsatych linii bocznej sparaliżowanej transgenicznej larwy danio pręgowanego przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Mechaniczna stymulacja wiązek włosów za pomocą impulsów płynu indukuje wnikanie wapnia przez kanały mechanotransdukcji i kanały bramkowane napięciem, co jest wizualizowane w czasie rzeczywistym za pomocą wskaźników fluorescencyjnych. Metoda ta uwypukla wierzchołkową i podstawową dynamikę wapnia w komórkach rzęsatych nerwu jastrowego, wyjaśniając ich rolę w wykrywaniu ruchu wody.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przypinanie i unieruchamianie larwy do komory obrazowania
   1. Kąp larwę Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) w około 1 ml buforu zarodka (E3) zawierającego 0,04% MS-222 przez 1–2 minuty na silikonowej powierzchni enkapsulantu komory obrazowania, aż larwa stanie się nieruchoma lub przestanie reagować na dotyk.
      1. Pod mikroskopem stereoskopowym umieść larwę na środku komory perfuzyjnej tak, aby leżała płasko na boku na silikonowej otoczce.
         UWAGA: Aby zachować spójność, larwy należy zawsze montować po tej samej stronie (np. prawą stroną do dołu, lewą stroną do góry) (Rysunek 2B1).
   2. Za pomocą drobnych kleszczy przyłóż szpilkę o średnicy 0,035 mm prostopadle do larwy i komory. Włożyć szpilkę głowicy między oko a pęcherzyk uszny i w dół do kapsułki (rysunki 1B1 i 1B2). Użyj drugiego zestawu kleszczy, aby ustabilizować larwę wzdłuż jej grzbietowej lub brzusznej strony podczas przypinania. Upewnij się, że pozioma część szpilki styka się z larwą i nie wciska się do końca w kapsułkę. Szpilkę należy ustawić pod kątem brzusznym (ryc. 1B1) lub lekko skierowaną w stronę przedniej części ryby, aby uniknąć zakłóceń w późniejszym wstrzyknięciu serca i obrazowaniu komórek rzęsatych.
      1. Używając kleszczy, włóż szpilkę ogonową o średnicy 0,025 mm do struny grzbietowej jak najbliżej końca ogona (Rysunek 1B1).
         UWAGA: Uważaj, aby nie rozciągać larwy. Przypnij larwę płasko. Oczy powinny być nałożone na siebie (rysunek 2B1). Jest to bardzo ważne dla łatwości wstrzyknięcia serca (Rysunek 1B2-B2', krok 3), ułatwienia pożądanej płaszczyzny obrazowania (Figura 1B1-B2'', kroki 5) i ilościowego określenia intensywności bodźca strumienia płynu (Figura 3A3, krok 4).
2. Wstrzyknięcie α-bungarotoksyny do jamy serca w celu sparaliżowania larw

UWAGA: Podczas obchodzenia się z bungarotoksyną α nosić rękawice.

1. Odwiruj porcję α-bungarotoxin na krótko przed użyciem, aby zapobiec zatkaniu igły do wstrzykiwania serca.
   1. Wlać 3 μl roztworu α-bungarotoksyny do igły do wstrzykiwań serca za pomocą końcówki pipety z żelem. Załaduj roztwór równomiernie do końcówki, bez pęcherzyków powietrza.
   2. Włożyć igłę do wstrzykiwań serca do uchwytu na pipety podłączonego do ręcznego mikromanipulatora. Pod mikroskopem stereoskopowym ustaw igłę tak, aby była ustawiona prostopadle do osi AP przypinanych i znieczulonych larw, skierowanych w dół pod kątem ~30°.
   3. Podłącz uchwyt pipety do wtryskiwacza ciśnieniowego. Zastosuj następujące sugerowane ustawienia: Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0,5 s i Pcompensation = 5 hPa. Wstrzyknąć bolus do roztworu, aby sprawdzić, czy końcówka igły jest opatentowana.
   4. Poszukaj małego zaciągnięcia się czerwonym roztworem (z czerwieni fenolowej), aby opuścić końcówkę igły. Jeśli nie widać czerwonego koloru, bardzo delikatnie zeskrob końcówkę igły o krawędź szpilki i spróbuj ponownie, aż igła będzie opatentowana. Alternatywnie pociągnij igłę z większym otworem na końcówkę.
2. Przesuń igłę w kierunku serca, aż dotknie skóry na zewnątrz serca (Rysunek 1B2). Wciśnij igłę w larwę i poszukaj wgłębienia komórki barwnikowej na skórze przed sercem, aby upewnić się, że igła jest umieszczona we właściwej płaszczyźnie względem larwy (ryc. 1B2').
   1. Przesuwaj igłę dalej, aż przebije skórę i wejdzie do jamy serca. Lekko odciągnąć igłę do tyłu. Wstrzyknąć bolus α-bungarotoksyny do jamy serca. Zwróć uwagę na napompowanie jamy serca lub przedostanie się do jamy czerwonego barwnika.
3. Delikatnie spłucz larwę 3 razy 1 ml buforu neuronalnego (NB), aby usunąć resztki MS-222. Nigdy nie usuwaj całego płynu. Utrzymuj larwy w około 1 ml NB w komorze perfuzyjnej.
   UWAGA: Upewnij się, że bicie serca larw i przepływ krwi pozostają solidne po przypinaniu i wstrzyknięciu serca oraz przez cały eksperyment obrazowania.
4. Przygotowanie mikroskopu i konfiguracji strumienia płynu
   1. Złóż pionowy mikroskop konfokalny, korzystając z komponentów opisanych w Tabeli Materiałów: mikroskop konfokalny z laserem 488 nm i odpowiednimi filtrami, oprogramowanie mikroskopu do kontroli i koordynacji obrazowania i stymulacji, 10-krotny obiektyw powietrzny, 60-krotny obiektyw wodny, skaner obiektywów piezo-Z (dla stosów z), szybka kamera, okrągła komora adapter, zmotoryzowany stolik i adapter wkładki scenicznej.
   2. Zmontuj strumień płynu składający się z 3 głównych elementów: pompy próżniowej i ciśnieniowej, szybkoobrotowego zacisku ciśnieniowego i stopnia głowicy (opisanego również w Tabeli materiałów). Użyj szybkoobrotowego zacisku ciśnieniowego, aby kontrolować czas i czas trwania wypływu ciśnienia lub podciśnienia ze stopnia głowicy do pipety strumieniowej płynu.
      1. Podłącz wyjście stopnia głowicy do uchwytu pipety strumieniowej płynu za pomocą grubościennej silikonowej rurki.
5. Wyrównanie larwy i strumienia płynu

UWAGA: W obrębie każdego neuromastu znajdują się 3 płaszczyzny zainteresowania: (1) końcówki wiązek włosów (ryc. 3A3: kinocilia, używana do pomiaru intensywności bodźca); 2) płaszczyzna mechanotransdukcji pęczka włosa (MET) (rysunek 2B1-B1': podstawa wierzchołkowych wiązek włosów, w której wykrywane są sygnały wapnia zależne od kanału MET); oraz (3) płaszczyzna synaptyczna (ryc. 2B2-B2': gdzie presynaptyczne sygnały wapniowe są wykrywane u podstawy komórki rzęsastej). Płaszczyzny te przedstawiono na rysunku 2A.

1. Uzupełnij 10 μL NB do prawidłowo złamanej igły do strumienia płynu za pomocą końcówki do ładowania żelem. Załaduj roztwór równomiernie do końcówki, bez pęcherzyków powietrza. Włóż igłę do uchwytu na pipetę dołączonego do mikromanipulatora z napędem.
2. Umieść komorę perfuzyjną w okrągłym adapterze komory na stoliku mikroskopu. nuta: Aby zachować spójność, zawsze umieszczaj larwę w tej samej orientacji (np. komora zawierająca larwę z tyłem w kierunku strumienia płynu i stroną brzuszną skierowaną w stronę eksperymentatora).
   1. Przesuń zmotoryzowaną scenę tak, aby larwa znalazła się w centrum pola widzenia. Obrócić adapter komory okrągłej tak, aby przednio-tylna (AP) oś larwy była z grubsza wyrównana z trajektorią igły strumienia płynu.
   2. Korzystając ze światła przechodzącego i różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC), ustaw ostrość larwy i wyśrodkuj ją pod obiektywem 10x. Podnieś obiektyw 10x.
3. Za pomocą zmotoryzowanego mikromanipulatora przyłóż igłę do strumienia płynu w dół do środka pola widzenia, tak aby była oświetlona przez przechodzące światło i ledwo dotykała roztworu NB.
   1. Obniż cel 10x. Skoncentruj się na larwie, aby potwierdzić jej lokalizację. Ustaw ostrość w górę, aby znaleźć igłę do strumienia płynu. Przesuwać igłę do strumienia płynu z mikromanipulatorem w osiach x i y, aż znajdzie się w pozycji równoległej do grzbietowej strony ryby.
   2. Skoncentruj się z powrotem na larwie. Przesuń igłę w dół w osi z. Umieść igłę wzdłuż grzbietowej strony ryby i w odległości ~1 mm od ciała (Rysunek 3A1).
   3. Ostrożnie przesuń adapter okrągłej komory (jeśli to konieczne), aby upewnić się, że igła strumienia płynu jest wyrównana wzdłuż linii środkowej AP larwy (Rysunek 3A1).
   4. Przesuń zmotoryzowany stolik, aby umieścić interesujący nas neuromast w środku pola widzenia. Trzymaj końcówkę igły ze strumieniem płynu wzdłuż grzbietowej strony ryby. Nie dotykać końcówką igły do strumienia płynu do larwy lub powierzchni komory.
4. Przełącz się na obiektyw wodny 60x. Upewnij się, że obiektyw jest zanurzony w roztworze NB. Użyj precyzyjnego ogniskowania, aby zlokalizować neuromast za pomocą światła przechodzącego i optyki DIC.
   UWAGA: Ta konfiguracja jest przeznaczona do stymulacji neuromasztów wzdłuż pierwotnej tylnej linii bocznej. Komórki rzęsate w obrębie tych neuromastów reagują na przedni lub tylny skierowany przepływ płynu.
   1. Ustaw igłę strumienia płynu z mikromanipulatorem tak, aby znajdowała się 100 μm od zewnętrznej krawędzi neuromasztu (Rysunek 3A2).
      UWAGA: Wybierz neuromaszty, które oferują wyraźne widoki z góry (Rysunki 2B1'-B2' i Rysunek 3A3), a nie widoki z boku (Rysunek 2C1-C2). Wyraźny widok z góry pozwala na jednoczesne obrazowanie wszystkich wierzchołkowych wiązek włosów w jednej płaszczyźnie optycznej lub obrazowanie obszarów synaptycznych w mniejszej liczbie płaszczyzn optycznych (ryc. 3A3).
   2. Skoncentruj się na końcach wierzchołkowych wiązek włosów (kinocilia) (Ryc. 1A, Ryc. 3A2 i 3A3). Dolna część igły strumienia płynu powinna być zogniskowana w tej płaszczyźnie.
5. Ustaw szybki zacisk ciśnieniowy z trybu ręcznego na tryb zewnętrzny, aby otrzymywać dane wejściowe z oprogramowania do obrazowania.
   1. Wyzeruj zacisk szybkiego ciśnienia, naciskając przycisk "zero". Za pomocą pokrętła nastawy ustaw ciśnienie spoczynkowe lekko dodatnie (~2 mmHg). Potwierdź spoczynkową moc wyjściową szybkoobrotowego zacisku ciśnieniowego za pomocą manometru funta na cal kwadratowy (PSI) podłączonego do wyjścia stopnia głównego.
      UWAGA: Ustaw lekko dodatnie ciśnienie w spoczynku, aby uniknąć stopniowego wchłaniania płynu do igły strumienia płynu w czasie. Jeśli płyn dostanie się do rurki podłączonej do strumienia płynu i dotrze do stopnia głównego, może to spowodować uszkodzenie sprzętu.
   2. Określ ciśnienie potrzebne do stymulacji wiązek włosów. Użyj wejścia 0,125 i 0,25 V (6,25 i 12,5 mmHg) przez 200–500 ms, aby zastosować bodziec testowy (Rysunek 3A3-A3'').
      UWAGA: Szybkie ciśnienie clamp przekształca napięcie wejściowe (z oprogramowania lub innych urządzeń, które łączą się z portem Bayonet Neill-Concelman (BNC) na szybkim ciśnieniu clamp port poleceń) na ciśnienie, które jest odprowadzane ze stopnia głównego, i ostatecznie igła ze strumieniem płynu (1,0 V = 50 mmHg, podczas gdy -1,0 V = -50 mmHg). W tej konfiguracji (patrz krok 4.2) nadciśnienie (pchanie) odchyla wiązki włosów w kierunku przednim, a podciśnienie (ciągnie) odchyla wiązki włosów w kierunku tylnym.
   3. Używając światła przechodzącego i optyki DIC wraz z paskiem skali, zmierz odległość ugięcia pod wpływem bodźców 6,25 i 12,5 mmHg końcówek wiązek włosów, kinocilii (ryc. 2A i ryc. 3A3-3''). Wybierz ciśnienie, które przesuwa wiązki (jako 1 jednostkę spoistą) na odległość około 5 μm (Rysunek 3A3''). Upewnij się, że końcówki kinocilii pozostają ostre przez cały czas.
   4. Przesunąć strumień płynu ± 25 μm wzdłuż osi A-P larwy, aby znaleźć odległość i ciśnienie, które odchylają końcówki kinocilia o 5 μm.
      UWAGA: Stosując GCaMP6s u larw 3–7 dni po zapłodnieniu (dpf), odchylenie o 5 μm powinno osiągnąć bliskie nasycenia GCaMP6 sygnały wapniowe i nie powinno uszkodzić wierzchołkowych struktur wiązki włosów (Rysunek 3A3''). Mniejsze odległości przemieszczenia mogą być wykorzystane do dostarczania bodźców nienasyconych (ryc. 3A3'). Odległości przemieszczenia >10 μm są trudne do oszacowania (rysunek 3A3''') i mogą być szkodliwe w czasie. Wysycenie sygnału zależy od wieku neuromatu (i wysokości kinorzęskowej) oraz zastosowanego wskaźnika. Okresowo sprawdzaj drożność igły strumienia płynu w każdym kierunku (ciśnienie/pchanie i podciśnienie/ciągnięcie) podczas obrazowania. Igły strumienia płynu łatwo się zapychają i tracą drożność podciśnienia, ale utrzymują drożność ciśnienia resztkowego. Użyj optyki DIC i krótkiego bodźca testowego w każdym kierunku, aby sprawdzić drożność strumienia płynu.
   5. Skoncentruj próbkę na płaszczyźnie zainteresowania (np. podstawie wierzchołkowych wiązek włosów lub podstawie komórki rzęsatej w płaszczyźnie synaptycznej; Rysunek 2B1-B2').
6. Procedura akwizycji obrazowania: Akwizycja jednopłaszczyznowa

UWAGA: Wszystkie obrazowania opisane w tym protokole są wykonywane w temperaturze pokojowej (RT).

1. Ustaw oprogramowanie do obrazowania tak, aby uzyskiwało strumieniowe lub ciągłe pobieranie 80 klatek z przechwytywaniem co 100 ms w celu uzyskania częstotliwości odświeżania 10 Hz.
2. Ustaw wzmocnienie, przysłonę i moc lasera, aby zoptymalizować wykrywanie sygnału, ale unikaj nasycenia, fotowybielania i szumów. Przykładowe ustawienia dla Opterra/SFC są następujące: moc lasera 488 nm: 50 (płaszczyzna MET wiązki włosów), 75 (płaszczyzna synaptyczna); szczelina 35 μm; zysk = 2,7; Wzmocnienie EM = 3900.
   UWAGA: Zastosuj 2 X binning, jeśli sygnały są zbyt słabe lub zaszumione lub mają nadmierne fotowybielanie. Binning 2X poprawi wykrywanie sygnału kosztem rozdzielczości przestrzennej.
3. Wybierz bodziec, który ma być dostarczony podczas akwizycji 80 klatek (8 s) po klatce 30, po 3 s.
   UWAGA: Oto kilka przykładowych bodźców: 200 ms (+ lub - 0,25 V) do 2 s (+ lub - 0,25 V) krok w kierunku przednim lub tylnym, aby określić wrażliwość kierunkową każdej komórki rzęsatej; 2 s, Fala prostokątna 5 Hz (0,25 V przez 200 ms, -0,25 V przez 200 ms, powtórzone 5 razy) do stymulacji wszystkich komórek rzęsatych jednocześnie. Dodatnie ciśnienie (bodziec przedni) aktywuje połowę komórek rzęsatych. Podciśnienie (bodziec tylny) aktywuje drugą połowę komórek rzęsatych. Upewnij się, że oprogramowanie lub urządzenie sterujące bodźcem przywraca ciśnienie clamp z powrotem do 0 V po zakończeniu bodźca.
4. Zmierz mechanowrażliwe reakcje wapnia. Skoncentruj się na podstawie wierzchołkowych wiązek włosów (ryc. 2A i 2B1-B1') i rozpocznij akwizycję obrazu.
   UWAGA: Jeśli neuromast jest wyraźnie widziany od góry do dołu (ryc. 2B1-B1'), wszystkie wierzchołkowe wiązki włosów można obrazować jednocześnie w jednej płaszczyźnie.
5. Zmierz presynaptyczne odpowiedzi wapnia. Skoncentruj się na podstawie komórek rzęsatych (ryc. 2A i 2B2-B2') i rozpocznij akwizycję obrazu.
   UWAGA: Jeśli neuromast jest wyraźnie widziany od góry do dołu (ryc. 2B2-B2'), presynaptyczne płaszczyzny obrazowania wszystkich komórek rzęsatych można uzyskać w 2-3 płaszczyznach oddalonych od siebie o 2 μm. Transgeniczne ryby Tg[myo6b:ribeye-mcherry] mogą być używane do identyfikacji i lokalizacji wstęg presynaptycznych i miejsc wnikania wapnia.

Wyniki

Rysunek 1: Komora obrazowania, procedury montażu danio pręgowanego i iniekcji serca oraz igły. (A) Pokazana jest komora obrazowania z larwą (obrysowaną przerywanym prostokątem) przypiętą do środka na szczycie silikonowej obudowy. (B1)...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
α-Bungarotoxin	R&D Systems	2133	Do paraliżowania larw przed obrazowaniem
Komora obrazowania	Siskiyou	PC-R	Platforma do montażu larw do obrazowania
nr 1.5 Szkiełka nakrywkowe kwadratowe, 22*22 mm	VWR	48366-227	Do uszczelnienia komory obrazowania
Wysokopróżniowy smar silikonowy	Fischer Scientific	14-635-5D	Do mocowania szkiełka nakrywkowego do komory obrazowania
Silikonowa kapsułka przezroczysta 0,5 g zestaw	Ellsworth Adhesives	Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0,5 KG	Do wypełnienia komory obrazowania w celu stworzenia powierzchni do przypinania ryb
Stereoskop	Carl Zeiss Mikroskopia	Stemi 2000 z oświetleniem światłem przechodzącym	Do oświetlania drutu, kleszczyków i nożyczek do robienia szpilek
Kleszcze	precyzyjne Narzędzia do nauki	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Nr kat. 11295-10 Do	robienia szpilek
Cienkie nożyczki	Cole-Palmer	5,5", EW-10818-00	Do cięcia drutu tunsgten do robienia szpilek
Drut wolframowy, 0,035 mm	Goodfellow	W005131	Do szpilek na głowę do unieruchamiania larw
Drut wolframowy, 0,025 mm	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	Do sworzni ogonowych do unieruchamiania larw
Kapilary ze szkła borokrzemianowego bez włókna	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	Szkło do wciągania w igły do strumienia płynów w celu stymulacji komórek rzęsatych
Cienkie kleszcze	Fine Science Tools	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Nr kat. 11295-10	Do przypinania larw
Żel Wskazówki dotyczące ładowania	Eppendorf	5242956003	Do wypełniania igieł do wstrzykiwań serca
Mikroskop stereoskopowy	Carl Zeiss Mikroskopia	Stemi 2000 z oświetleniem w świetle przechodzącym Do	oświetlania larw podczas przypinania i iniekcji serca
Szklany uchwyt kapilarny/igły	WPI	MPH315	Do trzymania igieł do strumienia płynów
Mikromanipulator ręczny	Narishige	M-152	Do przytrzymywania i pozycjonowania uchwytu igły do wstrzykiwania α-bungarotoxin
Stojak magnetyczny	Narishige	GJ-1	Do trzymania ręcznego mikromanipulatora do wstrzykiwania α-bungarotoksyny
Wtryskiwacz ciśnieniowy	Eppendorf	Femtojet 4x	Do dostarczania α-bungarotoksyny
Mikroskop konfokalny	Bruker	Sweepfield/Opterra	Stały, pionowy mikroskop z optyką DIC i laserem 488 nm z odpowiednimi filtrami
Oprogramowanie mikroskopu	Bruker	Prairieview 5.3	Do koordynowania i sterowania mikroskopem, laserami, stolikiem, piezo-z, kamerami i strumieniem płynu
10-krotny obiektyw powietrzny	Nikon	MRH00101	Niskie powiększenie do pozycjonowania larw i strumienia płynu
Obiektyw wodny 60x	Nikon	MRF07620	Obiektyw z immerysonem wodnym o wysokim NA (1,0) i odpowiedniej odległości roboczej (2,0 mm)
Skaner obiektywowy Piezo-Z ze sterownikiem/sterownikiem	Physik Intruments instruments/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	Szybka akwizycja stosu Z z dokładnością 0,025um
Kamera EMCCD	QImaging	Rolera EM-C2 Kamera EMCCD	o małym rozmiarze piksela, która może rejestrować do 100 klatek na s
Adapter	komory okrągłejSiskiyou	PC-A Do	trzymania i obracania komory obrazowania na stoliku mikroskopu
Zmotoryzowany stolik Z-deck	Wcześniejszy	ZDN12MP	Stolik mikroskopowy, który może trzymać i przesuwać razem próbkę i mikromanipulator z igłą do strumienia płynu
Adapter do wkładki stopnia Z-deck	NIH Warsztat maszynowy	na zamówienie	Aby dopasować adapter komory okrągłej do stolika z pokładem Z-deck
Aparatura	do strumienia płynuALA scientific instruments	HSPC-1 Szybkoobrotowy zacisk ciśnieniowy z pompą PV Do	kontrolowania i dostarczania bodźca strumienia płynu
Masterflex Rurka silikonowa utwardzana nadtlenkiem (1 stopa)	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	Do podłączenia uchwytu igły do strumienia płynu do pompy ciśnieniowej
Mikromanipulator z napędem	Sutter Instrument Company	MP-225	Do trzymania i pozycjonowania uchwytu igły do płynu sterownik
mikromanipulatora	strumieniowego Sutter Instrument Company	MPC-200	Do sterowania manipulatorem igłowym ze strumieniem płynu
Końcówki do ładowania żelu	Eppendorf	5242956003	Do zasypywania igieł do strumienia płynu
Szklany uchwyt kapilarny/igły	WPI	MPH315	Do trzymania igieł do strumienia płynów
Manometr PSI	Sper Scientific	840081	Do pomiaru wyjście zaciskowe
ciśnienia Prism7	Graphpad	Prism7	Oprogramowanie do wykreślania zmian
FIJI	Schindelin, et., al.34	https://fiji.sc/ Oprogramowanie	do przetwarzania obrazów i tworzenia map sygnałów czasoprzestrzennych
Turboreg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	Wtyczka do rejestracji sekwencji obrazów GCaMP6 w FIJI
StackReg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/	Wtyczka do rejestracji sekwencji obrazów GCaMP6 w FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin	Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA	a href='https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html'>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html	Wtyczka do tworzenia wielu ROI w celu pomiaru zmian intensywności GCaMP6

naukowy silnikowym intensywności GCaMP6<