$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Przygotowanie
1. Drażnij każdy mięsień w małych wiązkach włókien o szerokości około 1 mm za pomocą dwóch drobno ząbkowanych kleszczyków.
UWAGA: Bardzo ważne jest, aby manipulować mięśniami za pomocą kleszczy, bez nadmiernej siły, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek podczas drażnienia.
1. Zdysocjuj mięsień piszczelowy przedni (TA) na 3 lub 4 wiązki, w zależności od jego wielkości.
2. W przypadku mięśnia brzuchatego łydki (GA) oddziel przyśrodkową i boczną część mięśnia, a następnie rozdziel każdą część na 4-5 wiązek w zależności od ich wielkości.
2. Barwienie immunologiczne
1. Kontynuuj przepuszczalność włókien mięśniowych: Przenieś wiązki mięśniowe na 24-dołkowe płytki zawierające 1% (v/v) Triton X-100 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i utrzymuj je pod delikatnym mieszaniem (50 obr./min) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub 5 godzin w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Podziel wiązki mięśni na dwie płytki, aby przeprowadzić oddzielne barwienie immunologiczne i zminimalizować ryzyko pomylenia przeciwciał. Nie dziel ich na więcej niż dwie studzienki (1 dołek / płytka); w przeciwnym razie liczba (N) połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ), które są reprezentatywne dla ich ogólnego stanu w analizowanym mięśniu, może być niewystarczająca.
2. Przemyć próbki 3x przez 5 minut z PBS w temperaturze RT i inkubować je z roztworem blokującym złożonym z 4% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS/Triton X-100 1% przez 4 godziny w temperaturze 4 °C, pod delikatnym mieszaniem (50 obr./min).
UWAGA: Nie używaj pompy do zasysania podczas etapów mycia, ale raczej odsysaj roztwór ręcznie za pomocą pipety 200 μL i małych końcówek (odniesienie jest wskazane w Tabeli Materiałów).
3. Inkubować próbki przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C pod delikatnym mieszaniem (50 obr./min) z roztworem blokującym wskazanym w kroku 2.2 zawierającym pierwszorzędowe przeciwciała monoklonalne przeciwko neurofilamentowi M (NF-M, 2H3, rozcieńczenie 1/200) lub glikoproteinie pęcherzyków synaptycznych 2 (SV2, rozcieńczenie 1/200) w celu oznakowania odpowiednio presynaptycznych końców aksonów lub stref aktywnych.
4. Następnego dnia umyj wiązki mięśni 3x przez 5 minut w PBS pod mieszaniem (50 rpm).
1. Do obrazowania konfokalnego: Inkubuj wiązki mięśniowe z drugorzędowymi przeciwciałami anty-mysim sprzężonymi z fluoroforem emitującym czerwień (F594) (rozcieńczenie 1/500) i α-bungarotoksyną sprzężoną z fluoroforem emitującym zieleń (α-BTX-F488) (rozcieńczenie 1/1000) w PBS przez 2 godziny w RT pod mieszaniem (50 rpm).
2. Do obrazowania stymulowanego zubożenia emisji (STED): Inkubuj wiązki mięśniowe z drugorzędowymi przeciwciałami anty-mysimi sprzężonymi z fluoroforem emitującym zieleń (F488) (rozcieńczenie 1/500) i α-bungarotoksyną sprzężoną z fluoroforem emitującym daleko czerwoną charakteryzującą się wysoką fotostabilnością (α-BTX-F633) (rozcieńczenie 1/1000) w PBS przez 2 godziny w RT pod mieszaniem (50 rpm).
UWAGA: Nie wystawiaj próbek na działanie światła podczas inkubacji, aby uniknąć fotowybielania.
5. Umyj oznaczone wiązki mięśni 3x przez 5 minut za pomocą PBS pod mieszaniem (50 rpm) i umieść je na szkiełku z podłożem montażowym.
UWAGA: Umieść maksymalnie 4 do 5 wiązek mięśni na szkiełku, aby umożliwić uszczelnienie.
6. Dodaj szkiełko nakrywkowe klasy #1.5 (lub #1.5H) (o grubości 0,17 mm) na górze i umieść cylindryczne magnesy po obu stronach szkiełka, aby wywrzeć nacisk i spłaszczyć mięśnie.
7. Chroń szkiełka przed światłem O/N w temperaturze 4°C. Uszczelnij slajdy na stałe lakierem do paznokci.
3. Akwizycja obrazu
1. Akwizycje za pomocą mikroskopu konfokalnego
UWAGA: Obrazy zostały zebrane za pomocą odwróconego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego przy użyciu obiektywu immersyjnego z olejkiem o jasności 63x (HCX Plan Apo CS, apertura numeryczna 1,4 (NA)).
1. W przypadku analizy zaślepionej, niech osoba niezaangażowana w analizę koduje każdy slajd z podaną liczbą. Pozostań zaślepiony dla grup eksperymentalnych do czasu zakończenia kwantyfikacji parametrów NMJ dla wszystkich próbek.
2. Uruchom oprogramowanie mikroskopu w trybie konfiguracji > >machine.xlhw.
3. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i znajdź płaszczyznę obserwacji w próbce, patrząc pod szerokokątne oświetlenie fluorescencyjne DAPI z zestawem filtrów DAPI.
4.Kliknij na Otwórz projekt > nowe projekty> i utwórz folder do przechowywania pozyskanych obrazów.
UWAGA: Utwórz nowy projekt dla każdego NMJ, aby ograniczyć rozmiar folderu i zapobiec problemom z pamięcią komputera.
5. Aby zarządzać parametrami akwizycji, kliknij na zakładkę Akwizycja i ustaw konfokalny otwór na jednostkę 1.0 Airy i moc lasera, aby zoptymalizować poziomy wzmocnienia i przesunięcia dla fluorescencji zielonej/F488 (α-BTX) za pomocą lasera 488 nm na płycie końcowej, która ma być zobrazowana (włączony tryb Live).
6. Następnie zoptymalizuj akwizycję fluorescencji czerwonej/F594 (NF-M lub SV2) za pomocą lasera przystosowanego do obserwacji F594. W tym badaniu wykorzystano laser o długości fali 552 nm (Live mode ON). Ustaw widmo emisji barwnika z następującymi zakresami dla każdego lasera: laser 405 (DAPI) od 414 do 483 nm, laser 488 (F488-α-BTX) od 506-531 nm i laser 552 (NFM/ SV2) od 622-650 nm.
7. Zbierz stosy obrazów połączeń nerwowo-mięśniowych w każdej grupie eksperymentalnej z tymi samymi ustawieniami: rozmiar obrazu 1024 x 1024 pikseli (73,7 x 73,7 μm) przy częstotliwości próbkowania 400 Hz, dwukierunkowy X włączony, współczynnik powiększenia 2,5, rozmiar kroku Z 0,5 μm w trybie Z-Wide.
UWAGA: Dla każdego NMJ liczba wycinków jest ustawiana tak, aby obejmowała całe połączenie. Opisane powyżej ustawienia akwizycji spełniają twierdzenie o próbkowaniu Nyquista-Shanona. Użytkownik może jednak kliknąć przycisk Optymalizuj format, znajdujący się we wszystkich najnowszych konfokalnych programach operacyjnych, aby upewnić się, że rozmiar piksela i krok Z spełniają idealną częstotliwość próbkowania Nyquista. To działanie pozwoli uniknąć nadpróbkowania lub niedostatecznego próbkowania obrazów, co spowoduje utratę dokładności pomiarów objętości.
8. Zapisz oryginalny plik (.lif) lub obrazy Z-stack (.tif) w folderze o nazwie zawierającej nazwę kodową slajdu, rodzaj barwienia i numer tabliczki końcowej.
UWAGA: Zbieraj sekwencyjnie (nie równocześnie) skany za pomocą laserów 488 nm i 552 nm (F488 i F594), aby uniknąć przesłuchów fluorescencji F488 do kanału F594 i odwrotnie (przebijanie). Ścieżkę wiązki można skonfigurować za pomocą Dye Assistant w oprogramowaniu mikroskopu.
9. Przejdź do następnego zakodowanego slajdu i powtórz kroki 3.1.3-3.1.8 dla każdego NMJ.
10. Na koniec sesji kliknij Otwórz w przeglądarce 3D i wybierz przedstawiciela NMJ z grupy eksperymentalnej, aby zwizualizować etykietowanie 3D.
UWAGA: Ten tryb widoku pomoże zweryfikować, czy parametry akwizycji były poprawne.
11. Zamknij oprogramowanie mikroskopu, wyczyść obiektywy za pomocą chusteczek do soczewek, a następnie wyłącz system.
2. Akwizycje za pomocą mikroskopii STED
UWAGA: Obrazy zostały zebrane za pomocą odwróconego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w bramkowany STED przy długości fali 775 nm przy użyciu 100-krotnego obiektywu immersyjnego z olejkiem (HC PL APO CS2 1.4 NA).
1. W przypadku analizy zaślepionej, niech osoba niezaangażowana w analizę koduje każdy slajd z podaną liczbą. Pozostań zaślepiony dla grup eksperymentalnych do czasu zakończenia kwantyfikacji parametrów NMJ dla wszystkich próbek.
2. Uruchom oprogramowanie mikroskopu w trybie konfiguracji > machine.xlhw i STED ON.
3. Kliknij na Otwórz projekt > Nowe projekty, aby utworzyć folder do przechowywania pozyskanych obrazów.
>UWAGA: Generuj nowy folder dla każdego slajdu, aby ograniczyć rozmiar folderu i zapobiec problemom z pamięcią komputera.
4. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i obejrzyj je w szerokim oświetleniu fluorescencyjnym za pomocą lasera 488 nm, aby znaleźć płaszczyznę obserwacyjną w próbce.
5. Szukaj NMJ znakowanego barwieniem neurofilamentem M (NFM) lub SV2 za pomocą lasera 488 nm z detekcją spektralną od 506 do 531 nm.
6. Gdy NMJ zostanie zidentyfikowany, kliknij na Aktywuj STED i rozpocznij pobieranie obrazów w obszarze, który zawiera kilka fałdów połączeniowych za pomocą lasera 635 nm z detekcją spektralną od 640-750 nm.
>UWAGA: Zwróć uwagę na tabelę wyszukiwania nasycenia podczas pozyskiwania obrazu i kliknij przycisk Szybka tablica LUT, aby uniknąć prześwietlenia (wartości szarości >255; dla 8 bitów).
7. Zbierz obrazy każdej grupy eksperymentalnej z tymi samymi ustawieniami: rozmiar obrazu 2048 x 2048 pikseli (38,75 x 38,75 μm) przy częstotliwości próbkowania 400 Hz.
UWAGA: Moc lasera zubożającego (STED) jest ustawiona na 65%.
8. Zapisz obrazy z nazwą pliku, która zawiera kod slajdu.
UWAGA: Możliwe jest kliknięcie na Optimized XY Format: Set Format, aby uzyskać najlepsze ustawienie akwizycji za pomocą obrazowania STED.
9. Przejdź do następnego zakodowanego slajdu i powtórz kroki 3.2.3-3.2.8. Powtórz tę procedurę dla wszystkich slajdów.
10. Na koniec sesji mikroskopowej STED przenieś pliki obrazów na inny komputer i zapisz oryginalne pliki (.lif) na zewnętrznym dysku lub serwerze.
11. Wyłącz oprogramowanie mikroskopu, wyczyść obiektywy chusteczkami do soczewek, a następnie wyłącz system.