Opisano prostą i szybką metodę określania potencjału sacharyfikacji dla dużej liczby próbek biomasy roślinnej. Zautomatyzowana platforma do tej analizy obejmuje przygotowanie biomasy roślinnej do analizy w płytkach 96-dołkowych, a następnie przeprowadzenie obróbki wstępnej, hydrolizy oraz kwantyfikacji uwolnionych cukrów.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowy test sacharyfikacji materiałów lignocelulozowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Polisacharydy tworzące lignocelulozową biomasę roślinną mogą być rozkładane w celu wytworzenia szeregu cukrów, które następnie mogą zostać wykorzystane do stworzenia biorafinerii. Surowce te stanowiłyby nową platformę przemysłową, która byłaby zarówno zrównoważona, jak i neutralna pod względem emisji węgla, zastępując obecną zależność od paliw kopalnych. Odporność na dekonstrukcję obserwowana w materiałach lignocelulozowych wynika z kilku wewnętrznych właściwości ścian komórkowych roślin. Krystaliczna celuloza jest zatopiona w macierzy polisacharydowej, takiej jak ksylany i arabinoksylany, a cała struktura jest otoczona polimerem fenolowym – ligniną, która również jest trudna do strawienia 1. Aby poprawić strawność materiałów roślinnych, musimy zidentyfikować główne bariery w procesie sacharyfikacji ścian komórkowych, a także przeanalizować populacje mutantów i linie hodowlane w celu oceny zmienności sacharyfikacji 2. Zadania te wymagają podejścia wysokoprzepustowego, dlatego przedstawiamy tutaj platformę analityczną, która umożliwia przeprowadzenie analizy sacharyfikacji w formacie płytki 96-dołkowej. Platforma ta została opracowana w celu umożliwienia przesiewowej oceny strawności lignocelulozy w dużych populacjach różnych gatunków roślin. Zredukowaliśmy objętości reakcji dla łagodnego przygotowania wstępnego, częściowej hydrolizy enzymatycznej oraz oznaczania cukrów, aby umożliwić szybką ocenę dużych liczebności próbek w systemie zautomatyzowanym.
Ta zautomatyzowana platforma pracuje z miligramowymi ilościami biomasy, przeprowadzając mielenie kulowe w kontrolowanych warunkach, aby w sposób powtarzalny zredukować materiały roślinne do ustandaryzowanej wielkości cząstek. Po zmieleniu próbek zautomatyzowany robot formatujący dozuje określone i zapisane ilości materiału do odpowiednich dołków płytki głębokodotykowej 96-dołkowej (Rycina 1). Zazwyczaj dozujemy ten sam materiał do 4 dołków, aby uzyskać 4 powtórzenia do analizy. Gdy płytki zostaną wypełnione materiałem roślinnym zgodnie z pożądanym układem, są one przenoszone ręcznie do stacji obsługi cieczy (Rycina 2). W stacji tej próbki poddawane są łagodnej obróbce wstępnej za pomocą rozcieńczonego kwasu lub odczynnika alkalicznego i inkubowane w temperaturach do 90°C. Następnie roztwór do obróbki wstępnej jest usuwany, a próbki płukane buforem w celu przywrócenia pH odpowiedniego do hydrolizy. Próbki są następnie inkubowane z mieszaniną enzymów przez zmienny czas w temperaturze 50°C. Z hydrolizatu pobierana jest alykwoata, a zawartość cukrów redukujących jest automatycznie oznaczana kolorymetryczną metodą MBTH.
Protokół
1. Przygotowanie próbek
Zazwyczaj pracujemy z łodygami roślin zielnych lub zdrewniałych. W przypadku materiałów zielnych rośliny hoduje się do pełnej dojrzałości, a po wykształceniu się nasion zbiera suche łodygi po całkowitym zakończeniu procesu starzenia. Łodygi sieka się na segmenty o długości 4 mm i umieszcza w probówkach o pojemności 2 ml wraz z trzema kulkami mielącymi. W przypadku materiałów zdrewniałych próbki ściera się grubym tarnikiem do drewna do postaci gruboziarnistych trocin, a następnie umieszcza w młynku kulowym w celu dalszej obróbki.
Próbki umieszcza się w statywie w stacji mielenia i formatowania (Rysunek 1). Stacja ta sekwencyjnie mieli, miesza i waży każdą próbkę. Liczbę powtórzeń niezbędnych dla każdej próbki ustala się poprzez badanie zmielonego materiału w serii eksperymentów wstępnych, w których określa się zmienność wewnętrzną dla danej wielkości cząstek. Probówki o pojemności 2 mL są przebijane od spodu, a materiały są dozowane poprzez wibrację probówki nad wybranym dołkiem. Ramię wibrujące jest sterowane sygnałem zwrotnym z wagi, co pozwala na precyzyjne dozowanie proszku. Robot dozuje 4 mg/well w standardowej analizie, a w większości przypadków wymagane są 4 powtórzenia. Pozwala to na analizę 20 próbek roślin/płytkę.
2. Obróbka wstępna
Po sformatowaniu próbek, płytki 96-dołkowe są przetwarzane przez zautomatyzowany system do obsługi cieczy (Rycina 2). Na tym etapie przeprowadza się łagodne wstępne przygotowanie materiałów roślinnych poprzez dodanie 350 μL roztworów kwasowych lub zasadowych i ogrzewanie płytki w dostosowanym bloku. Aby uniknąć parowania podczas analizy, płytki 96-dołkowe uszczelnia się matą silikonową. Temperaturę i czas wstępnego przygotowania można modyfikować w zależności od badanych materiałów. Maksymalna temperatura wynosi jednak 100 °C. Alternatywną procedurą w przypadku testowania bardziej agresywnych metod wstępnego przygotowania jest opracowanie materiałów w trybie off-line i pominięcie etapu wstępnego przygotowania w głównym procesie.
3. Hydroliza
- Po wstępnej obróbce materiałów robot automatycznie usuwa roztwór do wstępnej obróbki i płucze wszystkie dołki 5 razy, używając 850 μL 25 mM buforu octanowego. Płukanie odbywa się poprzez dodawanie buforu do roztworu do wstępnej obróbki, a następnie usuwanie 50% całkowitej objętości po odczekaniu do osadzenia się substancji stałych w próbce. Wysokość aspiracji jest ustawiona na połowę masy cieczy, aby uniknąć aspiracji ciał stałych z dna dołka; przy zastosowaniu tej metody strata substancji stałych jest pomijalna. Po tych etapach płukania pH w dołku wynosi 4,5, a materiał jest gotowy do hydrolizy enzymatycznej.
- Robot dodaje mieszaninę enzymów zawierającą roztwór celulaz i hemicelulaz. Do każdego dołka dozowane jest 850 μL mieszaniny enzymów, a płytka jest przenoszona do inkubatora z wytrząsaniem w temperaturze 50 °C. Standardowa hydroliza trwa 8 h, jednak czas ten można dostosować do celu eksperymentu. Standardowe obciążenie enzymem stosowane dla traw wynosi 7 FPU/g materiału.
4. Wykrywanie cukrów redukujących
Oznaczenie cukrów redukujących uwolnionych po hydrolizie przeprowadzono przy użyciu zmodyfikowanej metody z wykorzystaniem hydrozonu 3-metylo-2-benzotiazolinonu (MTBH)3. Metodę MBTH wybrano jako najodpowiedniejszą, ponieważ była ona najłatwiejsza do zautomatyzowania i najmniej podatna na zakłócenia powodowane przez związki takie jak białka. Zmodyfikowaliśmy tę wysoce czułą metodę w celu zastosowania jej na platformie robotycznej, aby umożliwić dokładne oznaczanie ilości cukrów w stężeniach występujących w hydrolizatach biomasy, przy końcowej objętości 250 μL, która jest odpowiednia dla standardowej optycznej płytki 96-dołkowej. Wszystkie poniższe etapy są wykonywane automatycznie, a dla każdej reakcji sacharyfikacji przeprowadzono trzy niezależne oznaczenia cukrów redukujących.
- 30 μL hydrolizatu pobrano z płytki do głębokich studzienek i wymieszano z 45 μL 25 mM buforu octanu sodu w płytce PCR z 96 studzienkami i ramką.
- Dodano 25 μL 1N NaOH oraz 50 μl roztworu zawierającego 0,43 mg/ml MBTH i 0,14 mg/ml DTT.
- Po wymieszaniu płytkę PCR podgrzewano w temperaturze 60°C przez 20 min w termocyklerze lub podobnym urządzeniu, które dostarcza dokładnie taką samą ilość ciepła do wszystkich 96 studzienek.
- Uzyskaną mieszaninę reakcyjną przeniesiono na płytkę optyczną.
- Dodano 100 μl odczynnika utleniającego (0,2% FeNH4(SO4)2, 0,2% kwasu sulfaminowego i 0,1% HCl). Całość dokładnie wymieszano i pozostawiono do rozwoju koloru na co najmniej 1 h.
- Każda płytka powinna zawierać również reakcje wzorcowe z 50 nmol, 100 nmol i 150 nmol glukozy. Płytki optyczne odczytuje się przy 620 nm.
5. Reprezentatywne wyniki:
Przykłady różnych rodzajów analiz przedstawiono na rysunkach 3 i 4. Wszystkie wyniki uzyskano przy użyciu platformy zautomatyzowanej. Rysunek 3 przedstawia wzrost ilości uwalnianych cukrów redukujących podczas 8 h inkubacji zmielonej topoli przy zwiększających się ilościach enzymów celulolitycznych. Rysunek 4 prezentuje wpływ obróbki wstępnej w środowisku kwasowym i zasadowym na próbki topoli. Obróbka wstępna NaOH jest bardziej efektywna niż obróbka rozcieńczonym H2SO4 w ułatwianiu uwalniania cukrów podczas hydrolizy. Ilość cukrów zmierzona po hydrolizie maleje, gdy obróbka wstępna jest przeprowadzana przy stężeniach NaOH wyższych niż 1M.
Rycina 1. Stacja robotyczna do mielenia i formatowania biomasy do płytek 96-dołkowych
Rysunek 2. Stacja do dozowania cieczy w wysokoprzepustowej analizie sacharyfikacji
Rysunek 3. Wpływ różnych dawek enzymów na uwalnianie ekwiwalentów cukrów redukujących z próbek topoli
Rycina 4. Wpływ różnych obróbek wstępnych na sacharyfikację próbek topoli. A. Cukry uwolnione po obróbce wstępnej różnymi stężeniami H2SO4 w temperaturze 90°C przez 30 minut. B. Cukry uwolnione po obróbkach wstępnych NaOH w tej samej temperaturze i czasie, co w przypadku obróbki kwasowej.
Dyskusja
W tej samej platformie można zastosować modyfikacje standardowego protokołu sacharyfikacji w celu określenia aktywności enzymów celulolitycznych (np. poprzez zmianę stężeń enzymów stosowanych w płytce oraz wykorzystanie papieru jako substratu), porównania wydajności kilku mieszanin enzymatycznych na konkretnym materiale, opracowania przebiegu czasowego sacharyfikacji itd.
Standardowy protokół sacharyfikacji służący do porównania potencjału sacharyfikacji w różnych materiałach roślinnych obejmuje ośmiogodzinną hydrolizę (Ryc. 3 i 4). Większość analizowanych materiałów roślinnych wymaga czterech powtórzeń. W tych warunkach platforma może przetwarzać 80 próbek dziennie. Analiza ta jest wykorzystywana do przesiewania dużych populacji jęczmienia, kukurydzy i brachypodium w celu ustalenia zmienności potencjału sacharyfikacji oraz genów zaangażowanych w jego determinację4.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować A Viksø-Nielsen (Novozymes) za przekazanie enzymów celulolitycznych. Praca ta została sfinansowana przez FP7 RENEWAL oraz projekty BBSRC BB/G016178 i BB/G016194.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rozdrabnianie &robot ważący | Automatyzacja Labman | ||
| probówka mikrocentryfugowa 2 ml z zakrętkami | Sarstedt Ltd | 72.694 | |
| kulki ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| płytki do przechowywania Abgene z kwadratowymi dołkami o pojemności 1,2 ml | Fisher Scientific | TUL-050-050C | |
| Mata absorbująca Whatman do płytek 96-dołkowych o przekroju kwadratowym | Fisher Scientific | 7704-0104 | |
| Robot do pipetowania cieczy | Tecan Group Ltd. | Freedom Evo 200 | |
| Kwas siarkowy | Fisher Scientific | S/9231/PB17 | |
| Wodorotlenek sodu | Fisher Scientific | BPE359-500 | |
| Octan sodu | Sigma-Aldrich | S8750-500G | |
| Kwas octowy | Fisher Scientific | A/0420/PB17 | |
| Novozyme 188 | Novozyme | DCN00214 | |
| Celluclast 1,5 l | Novozyme | CCN03122 | |
| płytki PCR 96-dołkowe z pełnym obramowaniem | Sarstedt Ltd | 72.1980.202 | |
| D-glukoza | Fisher Scientific | G/0450/53 | |
| Hydrat chlorowodorku 3-metylo-2-benzotiazolinonu hydrazonu | Sigma-Aldrich | 129739-25G | |
| DL-ditiotreitol | Sigma-Aldrich | D9163-1G | |
| mikropłytka Corning 96-dołkowa z płaskim dnem | Fisher Scientific | TKT-521-050H | |
| Siarczan żelaza(III) i amonu dwunastowodny | Sigma-Aldrich | F1668-250G | |
| Kwas sulfaminowy | Sigma-Aldrich | 242772-500G | |
| Kwas solny | Fisher Scientific | 12462-0026 |
Bibliografia
- Carpita, N. C. Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).
- Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls. New Phytol. 178, 473-485 (2008).
- Anthon, G. E., Barrett, D. M. Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone. Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).
- Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials. Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).
Przedruki i uprawnienia
