Wysokoprzepustowy test scukrzania dla materiałów lignocelulozowych

Summary

Opisana jest prosta, szybka metoda określania potencjału scukrzania dużej liczby próbek biomasy roślinnej. Zautomatyzowana platforma do tej analizy obejmuje przygotowanie biomasy roślinnej do analizy w 96 płytkach dołkowych, a następnie przeprowadzenie obróbki wstępnej, hydrolizy i kwantyfikacji uwolnionych cukrów.

Abstract

Polisacharydy, które tworzą biomasę lignocelulozową roślin, mogą być rozkładane na szereg cukrów, które następnie mogą być wykorzystany do budowy biorafinerii. Surowce te stanowiłyby nową platformę przemysłową, która jest zarówno zrównoważona, jak i neutralna pod względem emisji dwutlenku węgla, Obecne uzależnienie od paliw kopalnych. Oporność na dekonstrukcję obserwowana w materiałach lignocelulozowych wynika z kilku wewnętrznych właściwości ścian komórkowych roślin. Celuloza krystaliczna jest osadzona w polisacharydach matrycy, takich jak ksylany i arabinoksylany, a cała struktura jest otoczona przez Lignina polimerowa fenolowa, która jest również trudna do strawienia ¹. Aby poprawić strawność surowców roślinnych, musimy odkryć główne wąskie gardła do scukrzania ścian komórkowych, a także do badań przesiewowych populacji zmutowanych i hodowlanych w celu oceny zmienności scukrzania ². Zadania te wymagają Podejście o wysokiej przepustowości i tutaj prezentujemy platformę analityczną, która może przeprowadzać analizę scukrzania w formacie płytki 96-dołkowej. Ta platforma ma zostały opracowane, aby umożliwić badania przesiewowe strawności lignocelulozy dużych populacji z różnych gatunków roślin. Zmniejszyliśmy ilość reakcji Do delikatnej obróbki wstępnej, częściowej hydrolizy enzymatycznej i oznaczania cukru, aby umożliwić szybką ocenę dużych liczb w zautomatyzowanym systemie.

Ta zautomatyzowana platforma pracuje z miligramowymi ilościami biomasy, wykonując mielenie kulowe w kontrolowanych warunkach, aby zmniejszyć roślinność materiałów do znormalizowanej wielkości cząstek w powtarzalny sposób. Po zmieleniu próbek automatyczny robot formatujący dozuje określone i zarejestrowane ilości materiału do odpowiednich studzienek na płycie o głębokości 96 (rysunek 1). Zwykle dozujemy ten sam materiał do 4 dołków, aby mieć 4 powtórzenia analiza. Po napełnieniu płyt materiałem roślinnym w żądanym układzie, są one ręcznie przenoszone do stacji obsługi cieczy (rysunek 2). W tym kontekście stacji, próbki poddaje się łagodnej obróbce wstępnej rozcieńczonym kwasem lub zasadą i inkubuje w temperaturze do 90 °C. Roztwór do obróbki wstępnej jest następnie usuwany, a próbki przepłukuje się buforem w celu przywrócenia ich do odpowiedniego pH do hydrolizy. Próbki są następnie inkubowane z enzymem mieszaniny przez zmienny czas w temperaturze 50°C. Z hydrolizatu pobiera się podwielokrotność, a cukry redukujące są automatycznie oznaczane przez MBTH metoda kolorymetryczna.

Protocol

1. Przygotowanie próbek

Zazwyczaj pracujemy z łodygami roślin zielnych lub drzewiastych. W przypadku materiałów zielnych uprawiamy rośliny do dojrzałości, a po rozwinięciu nasion zbieramy suche łodygi po całkowitym starzeniu się. Łodygi są krojone na segmenty o średnicy 4 mm i umieszczane w fiolkach o pojemności 2 ml z trzema kulami mielącymi. W przypadku materiałów drzewnych próbki są mielone na grube trociny za pomocą pilnika do drewna, a następnie umieszczane w młynie kulowym w celu dalszej obróbki.

Próbki są umieszczane w stojaku w stacji mielenia/formatowania (Rysunek 1). Stacja ta sekwencyjnie miele, miesza i waży każdą próbkę. Liczbę powtórzeń potrzebnych do wykonania na próbkę ustala się poprzez badanie zmielonego materiału w serii wstępnych doświadczeń, w których określa się wewnętrzną zmienność dla określonej wielkości cząstek. Fiolki o pojemności 2 ml są nakłuwane od dołu, a materiały są dozowane poprzez wibracje fiolki nad wybranym dołkiem. Ramię wibracyjne jest sterowane przez sprzężenie zwrotne z wagi, co pozwala na dokładne dozowanie proszku. Robot dozuje 4 mg/studzienkę w standardowej analizie i w większości przypadków potrzebne są 4 powtórzenia. Pozwala to na analizę 20 próbek roślinnych na płytkę.

2. Obróbka wstępna

Po sformatowaniu próbek, 96-dołkowe płytki są przetwarzane przez automatyczny system obsługi cieczy (Rysunek 2). W tym przypadku na materiałach roślinnych przeprowadza się łagodną obróbkę wstępną, dodając 350 μl roztworów kwasowych lub zasadowych i podgrzewając płytkę na przystosowanym bloku. Aby uniknąć parowania podczas analizy, płytki 96-dołkowe są uszczelnione matą silikonową. Temperaturę i czas obróbki wstępnej można modyfikować w zależności od badanych materiałów. Maksymalna temperatura wynosi jednak 100 °C. Alternatywną procedurą testowania ostrzejszych metod obróbki wstępnej jest wstępna obróbka materiałów poza linią produkcyjną i wyeliminowanie z procesu obróbki wstępnej.

3. Hydroliza

1. Po wstępnej obróbce materiałów robot automatycznie usuwa roztwór do obróbki wstępnej i myje wszystkie studzienki 5 razy za pomocą buforu octanowego o pojemności 850 μl 25 mM. Przepłukiwanie przeprowadza się poprzez dodanie buforu do roztworu do obróbki wstępnej, a następnie usunięcie 50% całkowitej objętości po pozostawieniu ciał stałych w próbce. Wysokość aspiracji ustala się na połowie masy cieczy, aby uniknąć zasysania ciał stałych z dna studni; Przy takim podejściu utrata ciał stałych jest znikoma. Po tych płukaniach pH w studni wynosi 4,5, a materiał jest gotowy do hydrolizy enzymatycznej.
2. Mieszanina enzymów zawierająca roztwór celulaz i hemicelulaz jest dodawana przez robota. Do każdej studzienki dozuje się 850 μl mieszaniny enzymów, a płytkę przenosi się do inkubatora z wytrząsaniem o temperaturze 50 °C. Standardowa hydroliza wykonywana jest przez 8 godzin, ale czas ten może być dostosowany do celu eksperymentu. Standardowe obciążenie enzymem stosowane w przypadku traw wynosi 7 FPU/g materiału.

4. Wykrywanie cukrów redukujących

Oznaczanie cukrów redukujących uwalnianych po hydrolizie przeprowadzono przy użyciu zmodyfikowanej metody hydrostrefy 3-metylo-2-benzotiazolinonu (MTBH)³. MBTH została wybrana jako najbardziej odpowiednia metoda, ponieważ była najłatwiejsza do zautomatyzowania i najmniej podatna na zakłócenia ze strony związków, takich jak białka. Zmodyfikowaliśmy tę bardzo czułą metodę do zastosowania na platformie robotycznej, aby mogła dokładnie określić ilościowo cukry w stężeniach obecnych w hydrolizatach biomasy, z końcową objętością 250 μl, która jest odpowiednia dla standardowej płytki optycznej 96-dołkowej. Wszystkie poniższe kroki są wykonywane automatycznie, a dla każdej reakcji scukrzania przeprowadzono trzy niezależne oznaczenia cukrów redukujących.

1. 30 μl hydrolizatu pobrano z płytki głębokiej studzienki i zmieszano z 45 μl 25 mM buforu octanu sodu na płytki PCR 96 z osłoną.
2. Dodano 25 μl 1N NaOH i 50 μl roztworu zawierającego 0,43 mg/ml MBTH i 0,14 mg/ml DTT.
3. Po wymieszaniu płytka PCR była podgrzewana w temperaturze 60°C przez 20 minut w termocyklerze lub podobnym urządzeniu, które dostarcza dokładnie taką samą ilość ciepła do wszystkich 96 dołków.
4. Powstałą reakcję przeniesiono na płytkę optyczną.
5. Dodać 100 μl odczynnika utleniającego (0,2% FeNH4(SO4)2, 0,2% kwasu sulfamowego i 0,1% HCl). Dobrze wymieszaj i pozostaw do rozwoju na co najmniej 1 godzinę.
6. Każda płytka powinna również zawierać wzorcowe reakcje 50 nmol, 100 nmol i 150 nmol glukozy. Płytki optyczne są odczytywane przy długości fali 620 nm.

5. Reprezentatywne wyniki:

Przykłady różnych typów analiz są przedstawione na rysunkach 3 i 4. Wszystkie wyniki uzyskano przy użyciu zautomatyzowanej platformy. Rysunek 3 przedstawia wzrost cukrów redukujących uwalnianych w ciągu 8 godzin inkubacji z topoli mielonej przy rosnącej ilości enzymów celulolitycznych. Rysunek 4 przedstawia wpływ kwasowej i zasadowej obróbki wstępnej na próbki topoli. Obróbka wstępna NaOH jest bardziej wydajna niż rozcieńczona obróbka wstępna H2SO4 w ułatwianiu uwalniania cukrów podczas hydrolizy. Ilość cukrów mierzona po hydrolizie zmniejsza się, gdy obróbka wstępna jest wykonywana przy użyciu stężeń NaOH wyższych niż 1M.

Rysunek 1. Zrobotyzowane stanowisko do mielenia i formatowania biomasy w 96 dołkach

Rysunek 2. Stacja obsługi cieczy do wysokoprzepustowej analizy scukrzania

Rysunek 3. Wpływ różnych ładunków enzymatycznych na uwalnianie ekwiwalentów cukrów redukujących z próbek topoli

Rysunek 4. Wpływ różnych metod obróbki wstępnej na scukrzać próbki topoli. ZA. Cukry uwalniane po przygotowaniu z różnymi procentami H2SO4 w temperaturze 90°C przez 30 minut. Ur. Cukry uwolnione po wstępnej obróbce NaOH w tej samej temperaturze i czasie, co obróbka wstępna kwasem.

Discussion

Warianty standardowego protokołu scukrzania mogą być stosowane na tej samej platformie do oznaczania aktywności enzymów celulolitycznych (tj. poprzez zmianę stężeń enzymów stosowanych na płytce, a także przy użyciu papieru jako substratu); porównanie skuteczności kilku mieszanin enzymatycznych na określonym materiale; przebieg czasowy do scukrzania; itd.

Standardowy protokół scukrzania w celu porównania potencjału scukrzania w różnych materiałach roślinnych obejmuje ośmiogodzinną hydrolizę (ryc. 3 i 4). Większość analizowanych materiałów roślinnych wymaga czterech powtórzeń. W tych warunkach platforma może przetwarzać 80 próbek dziennie. Analiza ta jest wykorzystywana do badań przesiewowych dużych populacji jęczmienia, kukurydzy i brachypodium w celu ustalenia zmienności potencjału scukrzania i genów zaangażowanych w jego oznaczanie⁴.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Robot do mielenia i ważenia	Labman Automation
2 ml mikroprobówka z nakrętkami	Sarstedt Ltd	72.694
Koraliki ze stali nierdzewnej 5 mm	Qiagen	69989
1,2 ml Abgene kwadratowe płytki do przechowywania Fisher	Scientific	TUL-050-050C
Mata do nasadek Whatman na 96 płytek kwadratowych	Fisher Scientific	7704-0104
Robot do przenoszenia cieczy	Tecan Group Ltd.	Freedom Evo 200
Kwas siarkowy	Fisher Scientific	S/9231/PB17
Wodorotlenek sodu	Fisher Scientific	BPE359-500
Octan sodu	Sigma-Aldrich	S8750-500G
Kwas octowy	Fisher	Scientific A/0420/PB17
Novozyme 188	Novozyme	DCN00214
Celluclast 1,5 l	Novozyme	CCN03122
96-dołkowe płytki z pełną spódnicą do PCR	Sarstedt Ltd	72.1980.202
D-Glucose	Fisher Scientific	G/0450/53
Hydratyk hydrazonu 3-metylo-2-benzotiazolinonu	Sigma-Aldrich	129739-25G
DL-ditiotreitol	Sigma-Aldrich	D9163-1G
Corning microplate 96-dołkowa płaska denna	Fisher Scientific	TKT-521-050H
dwunastowodny siarczan amonu żelaza (III)	Sigma-Aldrich	F1668-250G
Kwas sulfamowy	Sigma-Aldrich	242772-500G
Kwas solny	Fisher Scientific	12462-0026