Podczas procesu infekcji kluczowym etapem jest adhezja patogenów do komórek gospodarza. W większości przypadków etap adhezji ten zachodzi w obecności stresu mechanicznego generowanego przez przepływającą ciecz. Opisujemy technikę, która wprowadza naprężenie ścinające jako istotny parametr w badaniu adhezji bakteryjnej.
Artykuł metodologiczny
Wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Podczas infekcji bakteryjnych dochodzi do sekwencji oddziaływań między patogenem a jego gospodarzem. Adhezja bakterii do powierzchni komórki gospodarza jest często początkowym i decydującym etapem patogenezy. Choć w badaniach eksperymentalnych adhezję analizuje się głównie w warunkach statycznych, w rzeczywistości zachodzi ona w obecności płynącego cieczy. Pierwsze spotkania bakterii z gospodarzem często następują na poziomie błon śluzowych: w jamie ustnej, płucach, jelitach, oczach itp., gdzie śluz przepływa wzdłuż powierzchni komórek nabłonkowych. W późniejszym stadium infekcji patogeny czasem przedostają się do krwiobiegu, wywołując zagrażające życiu schorzenia, takie jak sepsa, posocznica i zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Cechą charakterystyczną tych infekcji jest zdolność patogenów do oddziaływania z komórkami śródbłonka w obecności krążącej krwi. Obecność płynącej cieczy, na przykład śluzu lub krwi, determinuje adhezję, ponieważ generuje ona siłę mechaniczną działającą na patogen. Aby scharakteryzować efekt płynącej cieczy, zazwyczaj odwołuje się do pojęcia naprężenia ścinającego, którym jest siła styczna wywierana na jednostkę powierzchni przez płyn poruszający się w pobliżu stacjonarnej ściany, wyrażona w dynes/cm2. Intensywność naprężenia ścinającego znacznie różni się w zależności od typu naczyń, ich wielkości, organu, lokalizacji itp. (0-100 dynes/cm2). Krążenie w naczyniach włosowatych może osiągać bardzo niskie wartości naprężenia ścinającego, a nawet tymczasowo ustawać w okresach trwających od kilku sekund do kilku minut 1. Z drugiej strony spektrum naprężenie ścinające w tętniczkach może osiągać 100 dynes/cm2 2. Wpływ naprężenia ścinającego na różne procesy biologiczne został wyraźnie wykazany, na przykład podczas oddziaływania leukocytów ze śródbłonkiem 3. Aby uwzględnić ten parametr mechaniczny w procesie adhezji bakteryjnej, wykorzystaliśmy procedurę eksperymentalną opartą na zastosowaniu jednorazowej komory przepływowej 4. Komórki gospodarza są hodowane w komorze przepływowej, a fluorescencyjne bakterie są wprowadzane do przepływu sterowanego za pomocą pompy strzykawkowej. Wstępnie skupiliśmy nasze badania na patogenie bakteryjnym Neisseria meningitidis, bakterii Gram-ujemnej odpowiedzialnej za posocznicę i zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Opisana tutaj procedura pozwoliła nam zbadać wpływ naprężenia ścinającego na zdolność bakterii do: adhezji do komórek 1, proliferacji na powierzchni komórek 5 oraz odrywania się w celu kolonizacji nowych miejsc 6 (Rysunek 1). Uzupełniające informacje techniczne znajdują się w odniesieniu 7. Przedstawione tutaj wartości naprężenia ścinającego zostały dobrane w oparciu o nasze wcześniejsze doświadczenia1 oraz tak, aby reprezentowały wartości znalezione w literaturze. Protokół powinien być możliwy do zastosowania dla szerokiego zakresu patogenów, z odpowiednimi modyfikacjami w zależności od celów badania.
Protokół
1. Hodowla ludzkich komórek gospodarza i bakterii
- Hodować HUVEC w przejściach od 1 do 9 w 37° w inkubatorze z nawilżeniem i zawartością 5% (v/v) CO22Przeszczepić komórki, gdy osiągną 80% konfluencji, używając trypsyny/EDTA, w celu prowadzenia kultur podtrzymujących na naczyniach o powierzchni 75 cm².2 kolby hodowlane i kultury eksperymentalne w jednorazowych komorach przepływowych (μ-preparaty VI).
- Odessać pożywkę z kolb przeznaczonych do pasażowania, przemyć komórki 10 ml PBS, odessać go i zastąpić 1,5 ml trypsyny/EDTA. Pozostawić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowej na 5 minut w temperaturze 37°C.
- Zebrać komórki wraz z 10 ml pożywki hodowlanej do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Osadzić komórki poprzez wirowanie przez 5 minut (przy 20 g) w temperaturze pokojowej. Resuspender komórki w 4 ml pożywki Endo-SFM uzupełnionej o 10% (v/v) FBS i policzyć je za pomocą komory Malasseza zgodnie z instrukcją producenta.
- Wprowadzenie 30 μl o stężeniu 1x106 komórek HUVEC na ml zawiesiny do kanału (3x104 (łącznie) i pozostawić komórki do adhezji na 3 godziny w 37° w inkubatorze z nawilżeniem i atmosferą zawierającą 5% (v/v) CO22Dodać dodatkową objętość 120 μl medium Endo-SFM w celu wypełnienia dołków. Komórki powinny tworzyć subkonfluencyjną warstwę jednowarstwową (Rysunek 2).
- Hodowla *N. meningitidis* wyrażającym GFP (w tym przypadku szczep 8013 wyrażający GFP pod kontrolą promotora indukowalnego przez IPTG), na płytkach z agarem GCB z dodatkami Kellogg's i 5 μg/ml chloramphenikolu w stężeniu 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% (v/v) CO22 przez 16 godzin.
2. Wstępna adhezja pojedynczych bakterii do komórek gospodarza
- Dostosować stężenie bakterii wyhodowanych na płytkach z agarem GCB do wartości OD600 wynoszącej 0,05, używając uprzednio ogrzanego medium Endo-SFM zawierającego 10% (v/v) FBS, a następnie inkubować przez 120 minut w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% (v/v) CO2, przy łagodnym wstrząsaniu (130 rpm). Indukować ekspresję GFP poprzez dodanie 1 mM IPTG do pożywki przez cały okres inkubacji.
- Umieścić jednorazową kasetkę μ-Slide na stole mikroskopu odwróconego wyposażonego w platformę grzewczą w celu utrzymania temperatury próbki na poziomie 37°C.
- Nalać uprzednio ogrzane Endo-SFM uzupełnione o 2% (v/v) FBS do sterylnego zlewki szklanej i napełnić tym medium sterylną strzykawkę 50 ml. Podłączyć przewód „wejściowy” do strzykawki i napełnić go, wprowadzając medium.
- Ostrożnie połączyć przewód „wejściowy” z kasetką μ-Slide, aby uniknąć wprowadzenia powietrza do komory. Następnie przymocować przewód „wyjściowy” do drugiego końca i ostrożnie napełnić kanał medium do odległości około 1 cm od „wyjścia” komory.
- Zmierzyć OD60 bakterii i dostosować do poziomu 0,15 w Endo-SFM zawierającym 2% (v/v) FBS. Aby móc obserwować pojedyncze bakterie, wszelkie agregaty należy rozbić poprzez intensywne mieszanie próbki bakteryjnej na wortexie.
- Wprowadzić 10 μl medium Endo-SFM uzupełnionego o 2% (v/v) FBS do zbiornika, a następnie dodać 100 μl roztworu bakteryjnego pobranego z górnej warstwy roztworu po wortexowaniu, aby uniknąć pobrania pozostałych agregatów bakteryjnych.
- Ostrożnie wprowadzić objętość 20 μl do kasetki μ-Slide, przekręcając kurek, aby wstrzyknąć bakterie do komory.
- Wprowadzić do komory Endo-SFM zawierające 2% (v/v) FBS, utrzymywane w temperaturze 37°C za pomocą platformy grzewczej, przy użyciu pompy strzykawkowej z naprężeniem ścinającym zgodnym z adhezją wynoszącym 0,04 dynes/cm2 przez 15 minut.
Patrz na przykład wideo 1 lub rycinę 3. Po tym kroku przejdź do sekcji 3, 4 lub 6.
3. Ilościowe oznaczenie początkowej adhezji pojedynczych bakterii do komórek gospodarza
- Po wstępnej adhezji trwającej 15 minut, należy obrazować dziesięć randomly wybranych pól w czasie, gdy ciecz wciąż krąży.
- Nabyte obrazy analizuje się przy użyciu oprogramowania ImageJ 8 w celu wyznaczenia średniej liczby przytwierdzonych bakterii na pole. Procedura przebiega następująco: najpierw każdy obraz poddaje się progowaniu za pomocą okna „Threshold” w menu „Image”, aby uwydatnić poszczególne przytwierdzone fluorescencyjne bakterie, minimalizując jednocześnie tło pochodzące od komórek. Następnie każdą pojedynczą bakterię przelicza się, korzystając z wtyczki „Cell Counter” (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). Dane dla każdego obrazu zapisuje się w arkuszu Excel, a następnie wyciąga z nich średnią, aby określić średnią liczbę przytwierdzonych bakterii na pole.
4. Pomiar oporu przeciwko przepływowi pojedynczych bakterii przylegających do komórek gospodarza
- Zaprogramuj zestaw pompy strzykawkowej tak, aby generował naprężenie ścinające w zakresie od 3 do 10 dynes/cm2 przez 5 minut.
- Po upływie 5 minut wykonaj akwizycję dziesięciu pól wybranych losowo zgodnie z opisem w kroku 3.1, jednak z zatrzymaniem przepływu przed rozpoczęciem akwizycji.
- Przeanalizuj pozyskane obrazy zgodnie z opisem w kroku 3.2 i określ średnią liczbę pozostałych bakterii na pole.
5. Pomiar wzrostu wyizolowanej bakterii przylegającej do mikrokolonii
- Wprowadź do komory medium Endo-SFM zawierające 10% (v/v) FBS, utrzymywane w temperaturze 37°C za pomocą grzewczej platformy, wykorzystując pompę strzykawkową z wybranym naprężeniem ścinającym przez kilka godzin. Rejestruj obrazy do wideomikroskopii w czasie rzeczywistym w odstępach 5 minut między klatkami.
- Po zakończeniu wideomikroskopii przerwij działanie naprężenia ścinającego, wyłączając pompę strzykawkową, wykonaj 2-3 dodatkowe zdjęcia, a następnie zatrzymaj sekwencję akwizycji obrazów w oprogramowaniu. Przykład proliferacji bakterii można zobaczyć na wideo 2.
6. Pomiar oporu przeciwko przepływowi przylegających mikrokolonii bakteryjnych
- Po utworzeniu się dużych mikrokolonii na powierzchni komórkowej (krok 5.2) należy wykonać 2-3 obrazy zarówno komórek (w kontraście fazowym), jak i bakterii (w fluorescencji GFP) przed zastosowaniem przepływu. W dalszej części eksperymentu protokół akwizycji będzie monitorował wyłącznie fluorescencję.
- Zastosować wysoki naprężenie ścinające przez 5 minut (3-10 dynes/cm2), rejestrując obrazy w odstępach 5 sekund na klatkę.
- Zatrzymać naprężenie ścinające poprzez wyłączenie pompy strzykawkowej, wykonać 2-3 dodatkowe obrazy, a następnie przerwać sekwencję akwizycji obrazów w oprogramowaniu.
- Następnie należy najpierw usunąć przewód wylotowy („exit”), czyniąc to ostrożnie, aby uniknąć opróżnienia kanału, a następnie dodać podgrzane świeże medium do wypełnienia studni przed usunięciem przewodu wlotowego („entry”).
- Aby ilościowo określić wpływ naprężenia ścinającego na oporność bakterii, można przeprowadzić test posiewowy w następujący sposób: zebrać pozostałe medium i dwukrotnie przemyć μ-Slide 120 μl PBS, co usunie pozostałe medium z kanału (oba płukany roztwory są również zbierane).
- Odczepić zainfekowane komórki po dodaniu 50 μl trypsyny/EDTA przez 5 minut w temperaturze 37° i zmieszać tę odczepioną próbkę z zawiesiną zebraną w poprzednim kroku.
- Wykonać rozcieńczenia seryjne w PBS i nanieść frakcję 10 μl na agarowe płytki GCB, w trzech powtórzeniach, aby następnego dnia określić liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) po inkubacji płytek w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% (v/v) CO2.
Filmy 3 i 4 porównują szczep typu dzikiego z mutantem pilV.
7. Odczepianie się bakterii z mikrokolonii
- Zainfekuj komórki w komorze przepływowej, powtarzając kroki od 2.1 do 2.8, i pozostaw je na 30 minut w celu przeprowadzenia infekcji.
- Usuń niezwiązane bakterie, zwiększając przepływ do 10 dynes/cm2 na okres 2 minut, a następnie pozwól infekcji trwać przez kolejne 2h.
- Zredukuj przepływ do 0,15 dynes/cm2.
- Co godzinę pobieraj kroplę medium wypływającego z komory przepływowej.
- Wykonaj rozcieńczenia seryjne próbek i wyseij je na płytki z agarem GCB.
- Następnego dnia określ liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) po inkubacji płytek w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% (v/v) CO2.
8. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1: Różne etapy tworzenia monowarstwy komórkowej, które można obserwować i pomiarować w obecności przepływu w ramach procedury.
Rysunek 2: Monowarstwa komórek śródbłonka w komorze przepływowej na początku eksperymentu (brak naprężenia ścinającego). Około 50 komórek śródbłonka tworzy subkonfluentną monowarstwę.
Rysunek 3: Graficzna reprezentacja początkowej adhezji bakterii na powierzchni komórkowej. Wskazano wartości dla trzech pól, aby zobrazować oczekiwaną zmienność między polami (0,04 dynes/cm2).
Wideo 1. Wizualizacja początkowej adhezji bakterii do monowarstwy komórkowej w funkcji czasu (0,044 dynes/cm2). Bakterie wykazujące ekspresję GFP poruszają się zgodnie z kierunkiem przepływu medium. Film został przyspieszony 60-krotnie, rzeczywisty czas trwania nagrania wynosi 10 minut.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.
Wideo 2. Po wstępnej adhezji bakteriom pozwolono na proliferację na powierzchni komórkowej przez okres 7 godzin (przyspieszone 10-krotnie).
Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.
Wideo 3. Po proliferacji na powierzchni komórkowej przetestowano odporność mechaniczną mikrokolonii poprzez zwiększenie poziomu naprężenia ścinającego do 10 dynes/cm2 przez 5 minut, jednak mikrokolonie typu dzikiego wykazują 60-krotnie większą odporność.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.
Wideo 4. Mikrokolonie utworzone przez mutant pilV ulegają rozbiciu pod wpływem zwiększenia przepływu (10 dyn/cm²)2). Mutant ten nie indukuje przebudowy błony plazmatycznej pod mikrokoloniami, przez co wykazuje większą wrażliwość na zwiększone naprężenie ścinające (wideo zostało przyspieszone 60-krotnie)5.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.
Dyskusja
Coraz częściej dostrzega się znaczenie naprężeń ścinających oraz ogólnie aspektów mechanicznych w biologii. Na przykład wysoce przystosowane właściwości adhezyjne białek z rodziny selektyn w procesie adhezji i toczenia się limfocytów po ścianie naczyniowej zostały rozpoznane poprzez wprowadzenie naprężeń ścinających do tego procesu. Opisana powyżej procedura została zastosowana w odniesieniu do bakterii Gram-ujemnych Neisseria meningitidis, lecz powinna być możliwa do zastosowania w szerokim zakresie patogenów. Znaczenie naprężeń ścinających wykazano również dla innych patogenów i innych miejsc zakażenia. Adhezja bakteryjna warunkowana naprężeniami ścinającymi została opisana w badaniu adhezyny FimH występującej u uropatogennych Escherichia coli (UPEC) 9. Podobnie jak w przypadku selektyn, wykazano, że oddziaływanie między FimH a receptorem komórki gospodarza jest wzmacniane przez indukowane ścinaniem siły mechaniczne 9, a doniesiono również, że adhezyna CfaE enterotoksygenej E.coli pośredniczy w adhezji do komórek nabłonka jelitowego poprzez mechanizm zależny od ścinania 10. Wykazaliśmy, stosując protokół badania w komorze przepływu laminarnego opisany w tym rozdziale, że pili Streptococcus agalactiae są niezbędne do przylegania tego patogenu do komórek nabłonkowych w warunkach przepływu 11. Takie badania potwierdzają, że nasz test z użyciem komory przepływu jest użytecznym narzędziem do badania oddziaływań między komórkami gospodarza a patogenami w warunkach naprężeń ścinających.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Emilie Mairey i Emmanuelowi Donnadieu za wstępne opracowanie procedury.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw do przepływu μ-Slide VI0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Strzykawka Plastipak 50 ml Luer-Lock | BD Biosciences | 300865 | |
| Przewód Tygon R3603 3.2 x 4.8mm | Fisher Scientific | R3603 | |
| Kurek trójdrożny, 2 żeńskie luer do męskiego luer | Bio-Rad | 7328103 | |
| Pompa strzykawkowa | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Mikroskop odwrócony, Nikon | Nikon Instruments | Eclipse Ti | |
| Kamera CCD | Hamamatsu Corp. | ORCA 285 CCD lub ORCA 3-CCD | |
| Oprogramowanie ImageJ | National Institutes of Health | Oprogramowanie bezpłatne (http://rsbweb.nih.gov/ij/) |
Bibliografia
- Mairey, E. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).
- Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Design Principles of Vascular Beds. Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16, 31-42 (2009).
- Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow. Biophys J. 61, 204-215 (1992).
- Mikaty, G. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).
- Chamot-Rooke, J. Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination. Science. 331, 778-782 (2011).
- Soyer, M., Dumínil, G. Bacterial adhesion under shear stress. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Christodoulides, M. , Humana Press Inc. New York. (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
- Tchesnokova, V. Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli. Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).
- Konto-Ghiorghi, Y. Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae. PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).
Przedruki i uprawnienia
