Obrazowanie in vivo transportu płynu mózgowo-rdzeniowego w mózgu myszy za pomocą makroskopii fluorescencyjnej

Streszczenie

Źródło: Sweeney, A. M., et al. Obrazowanie in vivo transportu płynu mózgowo-rdzeniowego przez nienaruszoną czaszkę myszy przy użyciu makroskopii fluorescencyjnej. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film przedstawia proces wizualizacji przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) w mózgu myszy za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Znacznik fluorescencyjny jest wstrzykiwany do cisterna magna (CM), umożliwiając śledzenie jego ruchu za pomocą płynu mózgowo-rdzeniowego przez przestrzenie podpajęczynówkowe i okołonaczyniowe. Obrazowanie poklatkowe rejestruje podróż znacznika, podkreślając jego dystrybucję do tkanki mózgowej przez tętniczki.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie kaniuli cisterna magna, płyty głowicy i uchwytu głowy

1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i płytki głowy przed operacją.
   UWAGA: Znaczniki fluorescencyjne są dostarczane bezpośrednio do płynu mózgowo-rdzeniowego za pośrednictwem kaniulacji cisterna magna.
2. Krótko, za pomocą wkrętaka do igieł, złamij końcówkę igły o wymiarach 30G x 12.7 mm (1/2 cala), 3/4 drogi w dół i umieść koniec igły w jednym końcu rurki z polietylenu 10 (PE10) (o długości około 45 cm). Upewnij się, że tylko skos wystaje z krawędzi rurki PE10.
3. Odłam 1/4 skośnego końca kolejnej igły 30G i umieść koniec pozostałej igły na drugim końcu rurki PE10, z nadal założonym plastikowym zamkiem Luer-lock.
4. Napełnij szklaną strzykawkę o pojemności 100 μl sterylnym, sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 10 mM glukozy i 26 mM NaHCO₃).
5. Przymocuj strzykawkę do końca żyłki i napełnij ją płynem CSF, aż dotrze do końcówki skośnej igły. Ważne jest, aby strzykawka była wypełniona płynem mózgowo-rdzeniowym, a nie powietrzem, ponieważ kolumna powietrzna jest bardziej podatna na zmienne objętości infuzji.
6. W przypadku eksperymentów przewlekłych pozostaw linię wypełnioną aCSF i pomiń krok 1.7.
7. W przypadku ostrych eksperymentów należy umieścić strzykawkę na pompie infuzyjnej i pobrać około 5 mm powietrza, co zapobiegnie mieszaniu. Następnie należy pobrać całkowitą objętość śladów pożądaną dla eksperymentu (zaleca się 20% więcej ze względu na straty martwej przestrzeni).
   UWAGA: Rurka PE10 powinna być wystarczająco długa, aby pęcherzyk powietrza nie dostał się do plastikowego mankietu szklanej strzykawki podczas ładowania znacznika. W typowym eksperymencie w protokole wykorzystuje się 10 μl albuminy surowicy bydlęcej sprzężonej z Alexa Fluor 647 (BSA-647) rozcieńczonej w CSF w stężeniu 0,5%.
8. Upewnij się, że płyta głowicy pasuje do uchwytu na głowę i że ma odpowiedni rozmiar dla używanej myszy. Znaczniki anatomiczne, które to zapewniają, to: górna granica okna wyrównuje się z linią międzygałkową, a tylna granica opada rostralnie do grzebienia potylicznego.
   UWAGA: Płyty głowicy ze stali nierdzewnej można sterylizować i ponownie używać. Większość mieszanin cyjanoakrylanu można usunąć roztworem acetonu.

2. Zabieg chirurgiczny

1. : Zważyć i znieczulić mysz (np. ketamina/ksylazyna; 100 mg/kg ketaminy, 10 mg/kg ksylazyny; i.p.).
2. Gdy mysz przestanie reagować na uszczypnięcie palca u nogi, zwilż szyję i głowę sterylną wodą i ogol się maszynką do strzyżenia. Po ogoleniu obszaru ponownie przetrzyj go wacikiem nasączonym alkoholem, aby usunąć wszelkie resztki włosów.
   UWAGA: Zwilżenie sierści przed strzyżeniem radykalnie zmniejsza ilość włosów w okienku obrazowania po nacięciu.
3. Umieść mysz w ramce stereotaktycznej na podkładce o kontrolowanej temperaturze i nałóż maść oftalmiczną z wazeliny na oczy myszy, aby upewnić się, że nie wyschną.
4. Oczyść odsłoniętą skórę wacikiem z chlorheksydyną. Po 2 minutach usuń chlorheksydynę wacikiem nasączonym alkoholem. Na koniec nałóż roztwór jodu, który można pozostawić do wyschnięcia.
5. Wstrzyknąć podskórnie środek przeciwbólowy (0,25% chlorowodorku bupiwakainy) w górną część czaszki i szyję.
6. Zaczynając od części szyi, która zakrywa grzebień potyliczny, wykonaj nacięcie linii środkowej w leżącej nad nią skórze i kontynuuj rostralnie w kierunku linii międzyoczodołowej. Naciąć bocznie do granicy, w której mięsień skroniowy wchodzi do czaszki. Usuń całą skórę z wrzecionowatego nacięcia, aby odsłonić zarówno kość czołową, jak i ciemieniową.
   UWAGA: Zatoka zadoczodołowa leży ogonowo do oczu, a duże gałęzie tylnej żyły twarzowej leżą rostralnie do małżowiny usznej. Zachowaj ostrożność podczas wykonywania nacięcia, aby oszczędzić te struktury. Jeśli tak się stanie, zatrzymaj krwawienie, utrzymując hemostazę sterylnym wacikiem przez kilka minut i kontynuuj.
7. Przepłucz czaszkę sterylną solą fizjologiczną i oczyść powierzchnię za pomocą bawełnianych wacików, aby była wolna od zanieczyszczeń i włosów, ponieważ będą one zakłócać jakość obrazu. Przezroczystość czaszki jest najlepiej zachowana, pozostawiając okostną i leżącą nad nią powięź nienaruszoną.
   UWAGA: Jeśli te struktury zostaną przypadkowo usunięte, czaszka może z czasem stać się sucha i nieprzezroczysta. Ponownie zwilżyć płynem mózgowo-rdzeniowym lub użyć mieszaniny oleju parafinowego i glicerolu, aby zmniejszyć współczynnik odbicia czaszki w ostrych eksperymentach.
8. Przystąp do wkładania kaniuli cisterna magna.
9. Po wprowadzeniu kaniuli CM nałóż mieszaninę cementu dentystycznego z klejem cyjanoakrylowym na brzuszną stronę płytki głowy wokół granicy i umieść ją na czaszce tak, aby przednia granica płytki głowy zrównała się z tylnym końcem kości nosowej, a tylna granica wyrównała się z przednią częścią kości międzyciemieniowej, upewniając się, że szew strzałkowy (linia środkowa) jest wyśrodkowany i prosty w stosunku do okna (ryc. 1B).
10. Napraw położenie płyty czołowej za pomocą kilku kropli akceleratora kleju. Wypełnij wszelkie pozostałe szczeliny mieszanką cementową i utwardź ją akceleratorem.
    UWAGA: Upewnij się, że cyjanoakrylan nie styka się z oczami myszy ani nie blokuje okna obrazowania.
11. Przyklej kaniulę CM do płyty głównej, aby upewnić się, że nie odczepią się one podczas transportu lub gdy mysz się obudzi.
12. W przypadku ostrych eksperymentów przejdź do kroku 2.16.
13. W przypadku eksperymentów przewlekłych nałóż cienką warstwę schnącego kleju cyjanoakrylowego na odsłoniętą czaszkę, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków, ponieważ będą one zakłócać obrazowanie. Klej zapewnia ochronę czaszki i nie zakłóca obrazowania. Upewnij się, że klej pokrywa odsłoniętą czaszkę aż do skóry na granicy nacięcia.
14. Użyj hemostatu clamp, aby przytrzymać rurkę PE10 wypełnioną CSF w odległości 2-3 cm od CM i przeciąć linię za pomocą końcówki kauteryzującej o wysokiej temperaturze. Po oddzieleniu spłaszcz stopioną rurkę PE10, aby uszczelnić kaniulę.
    UWAGA: Upewnij się, że nie zwalniasz zacisku, dopóki kaniula nie zostanie uszczelniona i upewnij się, że nie ma wycieków w rurce, aby zapobiec przetoce płynu mózgowo-rdzeniowego.
15. Podawać karprofen (5 mg/kg mc. co 24 godziny przez 3 dni; dootrzewnowo [i.p.] lub podskórnie [s.c.]) i umieścić mysz z powrotem w jednoosobowej klatce o kontrolowanej temperaturze i pozwolić jej dojść do siebie przez co najmniej 24 godziny przed obrazowaniem. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać leżący mostek. Nienaruszone okna czaszki pozostają stabilne przez kilka tygodni. UWAGA: Przewlekły eksperyment można tutaj wstrzymać.
    UWAGA: Niektóre powikłania pooperacyjne to: głowo-krwiak/krwiak podgalealny, przetoka płynu mózgowo-rdzeniowego i infekcja.
16. W przypadku ostrych eksperymentów umieść mysz w uchwycie na głowę za pomocą płytki na głowę, tak aby czaszka znajdowała się w ustalonej pozycji. Upewnij się, że sprawdziłeś poziom znieczulenia i umieść poduszkę grzewczą pod myszką. Mysz jest teraz gotowa do zabrania do makroskopu.
    UWAGA: Ostrożnie przewieźć mysz wraz z pompą infuzyjną na wózku. Jeśli kaniulacja CM zostanie przemieszczona, spowoduje to spadek ciśnienia śródczaszkowego, a wszelkie nieszczelności płynu mózgowo-rdzeniowego zmienią wyniki eksperymentalne.

3. Przygotowanie myszy do obrazowania

UWAGA: Protokół różni się w zależności od tego, czy eksperyment obrazowania zostanie przeprowadzony na znieczulonej (początek kroku 3.1) czy na jawie (początek kroku 3.2) myszy.

1. Znieczulone myszy
   1. Umieść uchwyt głowy na stoliku makroskopu, upewniając się, że nie ma załamań w linii od pompy strzykawkowej do kaniuli CM i że nie jest napięty, ponieważ może to wpłynąć na infuzję znacznika.
   2. Obserwuj częstość oddechów i różowe zabarwienie błon śluzowych, co wskazuje na dobre natlenienie. W razie potrzeby wstrzyknąć sól fizjologiczną podskórnie, aby zapewnić poziom nawodnienia. Sprawdź, czy zwierzę jest wystarczająco znieczulone i w razie potrzeby ponownie dozuj.
   3. Włącz kamerę makroskopową i diodę elektroluminescencyjną (LED) i uruchom tryb LIVE.
   4. Potwierdź powiększenie pola obrazowania tak, aby szew nosowo-czołowy w górnej części pola i szew lambdoidalny na dole mogły być wyraźnie uwidocznione, przy czym szew strzałkowy jest równoległy i wyśrodkowany do środka obrazu (ryc. 1C). Po umieszczeniu na miejscu przymocuj uchwyt głowicy do stolika makroskopu za pomocą taśmy.
   5. Ustaw ostroskop makroskopu na odsłoniętej czaszce. Pomimo tego, że makroskopy mają stosunkowo dużą głębię ostrości, krzywizna czaszki myszy pozwala na ustawienie ostrości tylko na określonym obszarze. Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy płaszczyzna ogniskowa znajduje się po bocznych stronach kości ciemieniowych za szwami koronalnymi.
      UWAGA: Jest to lokalizacja tętnic środkowych mózgu (MCA), w której występuje większość napływu płynu mózgowo-rdzeniowego (ryc. 1D, E).
2. Awake Mice
   1. Przed sesją obrazowania pozwól zwierzętom dojść do siebie przez co najmniej 24 godziny po operacji płytki głowy. Zalecane są również dłuższe okresy rekonwalescencji (5-7 dni). W tym czasie trenuj mysz tak, aby była zamocowana na stoliku w rurze przytrzymującej przez 0,5-1 godziny dziennie przez cały okres rekonwalescencji.
      UWAGA: Habituacja pozwala na przymocowanie myszy do uchwytu głowy bez znieczulenia i zmniejsza stres i niepokój podczas właściwego eksperymentu. Jeśli nie jest to wykonalne, a znieczulenie nie przeszkadza w eksperymencie, można użyć dawki indukcyjnej wziewnego środka znieczulającego (np. izofluranu 2% przy szybkości przepływu 1-2 l/min O2) w celu szybkiego przymocowania myszy do stopnia głównego.
   2. Po przymocowaniu myszy do uchwytu na głowę i w rurze przytrzymującej wykonaj kroki 3.1.1-3.1.5.

4. Infuzja fluorescencyjnych znaczników płynu mózgowo-rdzeniowego

1. Ostra kaniulacja CM
   1. Ponieważ znacznik został już załadowany do kaniuli przed umieszczeniem go w cisterna magna w kroku 1.6, ustaw pompę infuzyjną na żądaną szybkość i objętość. Rutynowo stosowane paradygmaty infuzji to 5-10 μl przy 1-2 μl/min, ale parametry te można dostosować w zależności od konkretnego eksperymentu lub wielkości i wieku zwierzęcia.
2. Przewlekła kaniulacja CM
   1. Przed rozpoczęciem sesji obrazowania postępuj zgodnie z krokami 1.2-1.7 dla ostrych eksperymentów, aby przygotować linię infuzyjną do dostarczenia znaczników.
   2. Po przygotowaniu linii, za pomocą zacisku hemostatu odetnij uszczelniony koniec przewlekłej kaniuli CM. Weź igłę z żyłki przygotowanej w kroku 4.2.1 i delikatnie włóż ją do kaniuli. Zwolnij zacisk i za pomocą pompy strzykawkowej przesuwaj znacznik płynu mózgowo-rdzeniowego z żądaną szybkością infuzji (np. 2 μL/min) do eksperymentu, aż znacznik dotrze do wszczepionej igły w CM.
      UWAGA: Jeśli igła przebije się przez rurkę podczas podłączania linii, wyjmij igłę, odetnij przebity segment i powtórz ten krok. Każde rozdarcie rurki PE10 spowoduje nieszczelność i wpłynie na wyniki eksperymentu.

5. Konfiguracja sesji obrazowania

1. Na podstawie podawanego znacznika fluorescencyjnego określ długość fali wzbudzenia i czas ekspozycji dla każdego kanału. Wybierz najkrótszy czas naświetlania niezbędny do wizualizacji znacznika, aby zmaksymalizować rozdzielczość czasową obrazowania poklatkowego. Ten czas ekspozycji będzie używany we wszystkich kolejnych eksperymentach mających na celu porównanie transportu płynu mózgowo-rdzeniowego między różnymi zwierzętami.
   UWAGA: Jedną wskazówką jest użycie znacznika w linii CM w celu dostosowania czasu ekspozycji. Chociaż jest to przydatne pierwsze podejście, z czasem powinno zostać zoptymalizowane.
2. Wybierz czas trwania eksperymentu i interwały, w których obrazy będą rejestrowane. Eksperymenty trwają zwykle od 30 do 60 minut, w zależności od tego, jaka faza transportu glimfatycznego jest przedmiotem zainteresowania. Liczba klatek na sekundę wynosząca 1 klatkę/min i większa jest wystarczająca w przypadku większości eksperymentów.
3. Ustaw nazwę pliku i katalog zapisu.
4. Jeśli obrazowanie będzie pobierane oprócz jednoczesnego pozyskiwania innych zmiennych (np. elektrokardiogramu, ciśnienia tętniczego krwi, elektrofizjologii), makroskop i pompę można zaprogramować tak, aby uruchamiały się za pomocą oprogramowania do akwizycji danych. Sprawdź, czy funkcja wyzwalania w makroskopie jest poprawna przed przejściem do następnego kroku.

6. Eksperyment przezczaszkowego obrazowania optycznego

1. Rozpocznij infuzję znacznika i obrazowanie w tym samym czasie.
2. Rutynowo sprawdzaj kaniulę CM i rurkę PE10 pod kątem oznak wycieku. Jeśli w CM wycieka znacznik, wyniki tego eksperymentu muszą zostać wykluczone.
   UWAGA: Jeśli znacznik zaczyna gromadzić się w móżdżku i nie przemieszcza się szlakiem limfatycznym tętnic środkowych mózgu (MCA), jest prawdopodobne, że kaniula CM została wstrzyknięta do móżdżku. Dane te nie powinny być uwzględniane.
3. W przypadku ostrych eksperymentów, po zakończeniu eksperymentu, wyjmij mysz z mikroskopu i sprawdź, czy jest nadal odpowiednio znieczulona. Szybko odetnij głowę myszy i zbierz tkankę mózgową. Zanurz mózg w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez noc w temperaturze 4 °C.
   1. W przypadku eksperymentów przewlekłych, po zakończeniu obrazowania, usuń linię CM z kaniuli, przepłucz sterylnym aCSF i ponownie uszczelnij kaniulę CM za pomocą końcówki kauteryzującej o wysokiej temperaturze. Zdejmij mysz ze statywu i umieść ją z powrotem w klatce. Powtarzaj ten proces, aż dalsze obrazowanie nie będzie wymagane, a następnie postępuj zgodnie z krokiem 6.3.

Wyniki

Rysunek 1. Przezczaszkowe obrazowanie makroskopowe. (A) Schemat konfiguracji obrazowania makroskopowego. (B) Widok grzbietowy położenia płytki głowy na czaszce. Kość międzyciemieniowa oraz kości nosowe, czoł...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,25% Bupiwakaine HCl			University of Rochester Wiwarium
100 μL Gazszczelna strzykawka Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81020
AM Systems Cement dentystyczny w proszku	Fisher Scientific	NC9991371
Carprofen			University of Rochester Wiwarium
Chlorheksydyna	Prevantics	B10800
Kamera CMOS	Hammamatsu	ORCA Flash 4.0
Płyta czołowa	University of Rochester	Brak katalogu #	Wykonane na zamówienie w warsztacie mechanicznym na Uniwersytecie w Rochester
Kauteryzacja wysokotemperaturowa	Bovie Medical Corporation	AA01
Akcelerator Insta-set	Bob Smith Industries	BSI-151
Izofluran - Fluriso	Vet One	502017	University of Rochester Wiwarium
Ketamina			Strong Memorial Hospital Apteka
Krazy Glue	Elmer's Products, Inc	Brak katalogu #, patrz link w komentarzach	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Taśma chirurgiczna Micropore	Fisher Scientific	19-027-761
Paraformaldehyd	Sigma-aldrich	P6148
PE10 - Polietylen .011" x .024" na stopę, 100 stóp ciągły	Braintree Scientific	PE10 100 FT
Pump 11 Elite Infusion Only Podwójna strzykawka	Aparat Harvard	70-4501
PURALUBE MAŚĆ WETERYNARYJNA	Dechra
Puritan PurSwab Bawełniane patyczki do czyszczenia	Fisher Scientific	22-029-553
Mikroskop badawczy z zoomem makro	Olympus	MVX10
Prosta płyta mocująca głowę (dla myszy)	Narishige International USA Inc	MAG-1
Igły jednorazowego użytku, BD Medical	VWR	BD305106
Sterylne wkładki nasączone alkoholem	Fisher Scientific	22-363-750
Przestrajalna dioda LED	PRIOR Lumen 1600-LED
Ksylazyna			Wiwarium Uniwersytetu w Rochester