$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Cewnikowanie dożylne gryzoni, dostarczanie wirusa i implantacja światłowodu
- Przygotuj zwierzęta do operacji.
- W pełni znieczulij szczury wybranym środkiem znieczulającym w oparciu o wytyczne instytucjonalne. Jedną z opcji jest chlorowodorek ketaminy (87,5-100 mg/kg, domięśniowo [i.m.]) i chlorowodorek ksylazyny (5 mg/kg, i.m.). Upewnij się, że szczur jest w pełni znieczulony, sprawdzając, czy nie ma odruchu szczypania palców u stóp.
UWAGA: Ketamina jest substancją kontrolowaną, z którą należy obchodzić się zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
UWAGA: W tym badaniu stosuje się domięśniowe wstrzyknięcia środków znieczulających, ponieważ powodują one szybszą i bardziej niezawodną indukcję znieczulenia niż wstrzyknięcie dootrzewnowe. Stale monitoruj oddech i reakcję szczura oraz zapewnij wsparcie termiczne przez cały czas trwania operacji. - Ogol duży obszar grzbietu szczura (górna część pleców od tuż nad łopatkami do środka pleców), a także obszar szyi pod prawą kończyną przednią i skórę głowy.
- Umieść szczura w obszarze operacyjnym i nałóż puralube (sztuczne łzy) na oczy. Wstrzyknąć objętość masy ciała karprofenu (środka przeciwbólowego) podskórnie (podskórnie [s.c.]) przez skórę górnej części pleców, a następnie wstrzyknąć 5 ml roztworu Ringera z mleczanami s.c. przez skórę dolnej części pleców.
- Zdezynfekuj wszystkie miejsca operowane, zwilżając kawałek sterylnej gazy betadyną i wycierając ją po ogolonym obszarze operacyjnym okrężnymi ruchami. Następnie powtórz proces z 70% etanolem. Powtórz ten naprzemienny cykl trzy razy.
- Wykonaj dożylną implantację cewnika zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami.
UWAGA: Podczas tej operacji nie używa się serwety chirurgicznej, aby uniknąć podrażnienia podczas implantacji cewnika. Wysterylizuj wszystkie instrumenty i sprzęt przed użyciem. Używaj sterylnych rękawiczek i zmieniaj rękawice, jeśli dojdzie do kontaktu z jakąkolwiek niesterylną powierzchnią. - Bezpośrednio po implantacji cewnika zabezpiecz szczura w ramce stereotaktycznej w celu wykonania zastrzyków z wirusa związanego z adenowirusem (AAV).
- Dostarczyć podskórne (s.c.) wstrzyknięcie 2% lidokainy (0,2-0,3 ml) do skóry głowy jako środek znieczulający miejscowo.
UWAGA: Podczas implantacji cewnika dożylnego nie stosuje się znieczulenia miejscowego, aby uniknąć zmian w wynikach operacji. - Podłączyć kaniulę iniekcyjną ze stali nierdzewnej o rozmiarze 26 do strzykawki Hamilton wypełnionej 1 μl stężonego roztworu AAV: AAV5-hSyn-tdTomato lub AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
UWAGA: oChIEF jest wariantem wrażliwej na niebieskie opsyny kanałowej opsyny (ChR2), która może reagować na szeroki zakres częstotliwości, a zatem ma zastosowanie w eksperymentach długotrwałej depresji o niskiej częstotliwości (LTD) omówionych w tym protokole, ale także do eksperymentów z długotrwałym wzmocnieniem o wysokiej częstotliwości (LTP). Konstrukt oChIEF został podarowany przez dr Rogera Tsiena i przetworzony w celu pakowania i oczyszczania przez Duke Viral Vector Core. Potrzebne są co najmniej 3-4 tygodnie między dniem wstrzyknięcia a dniem indukcji LTD, aby umożliwić optymalną ekspresję wirusa w przyśrodkowym jądrze kolankowatym zakończeń aksonów wzgórza (MGN).
UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, AAV jest uważany za organizm o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL-1), o niskim ryzyku samozakażenia, chyba że do jego produkcji używa się wirusa pomocniczego. Jego stosowanie wymaga zatwierdzenia przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC), a odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) muszą być używane przez cały czas zgodnie z wytycznymi instytucji, aby ograniczyć niepotrzebne narażenie. - Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie 0,5 mm od przodu do tyłu czaszki i usuń leżącą nad nią tkankę, aby odsłonić powierzchnię czaszki.
- Wyrównaj głowę szczura w osi przedniej/tylnej i zeruj współrzędne stereotaktyczne do bregmy.
- Wywierć trzy małe otwory w czaszce za pomocą narzędzia Dremel wyposażonego w małe wiertło. Użyj śrubokręta, aby mocno zamocować ze stali nierdzewnej (M2x4 965-A2) na miejscu.
UWAGA: są niezbędne do prawidłowego wiązania cementu dentystycznego i tworzenia solidnych, trwałych nasadek głowic. Położenie powinno być rozłożone w poprzek osi przednio-tylnej czaszki, z dala od miejsca wstrzyknięcia AAV. - Wywierć obustronne otwory do wstrzyknięcia AAV na podstawie współrzędnych z Atlasu Mózgu Szczura (Watson i Paxinos) dla przyśrodkowej części jądra kolankowatego przyśrodkowego (MGN); w mm od bregma, przednio-tylna (AP): -5,4; przyśrodkowo-boczna (ML): ±3,0; grzbietowo-brzuszna (DV): -6,6. Powoli opuszczać kaniule iniekcyjne (4 mm/min), aż zostaną umieszczone w MGN. Wstrzyknąć stężony roztwór AAV z szybkością 0,1 μl/min.
- Pozostaw kaniulę do wstrzykiwań na miejscu na 5 minut po zakończeniu infuzji, aby umożliwić dyfuzję z dala od kaniuli, a następnie powoli wycofaj kaniulę z mózgu.
- Bezpośrednio po wstrzyknięciu wirusa kontynuuj wszczepianie światłowodów celujących w końcówki MGN-LA.
- Użyj narzędzia Dremel do wiercenia obustronnych otworów pod implanty światłowodowe celujące w boczne ciało migdałowate (w mm od bregma, AP: -3.0; ML ±5.1).
- Użyj kleszczyków, aby chwycić skuwkę implantu światłowodowego i przymocować ją do adapterów stereotaktycznych, aby były bezpiecznie utrzymywane na miejscu.
- Powoli opuszczaj włókna z prędkością 2 mm/min, aż końcówka włókna znajdzie się w grzbietowej części LA (grzbietowo-brzuszna [DV]: -7,9 mm).
- Najpierw przymocuj okucia do czaszki za pomocą cienkiej warstwy kleju błyskawicznego Loctite, a następnie cementu dentystycznego i przykryj skuwki tulejami i osłonami przeciwpyłowymi o średnicy 1,25 mm.
UWAGA: Wybór kleju do mocowania okuć do czaszki powinien zostać zatwierdzony przez lokalną lub instytucjonalną komisję ds. opieki i użytkowania zwierząt. Loctite jest używany w tym badaniu, aby niezawodnie przymocować okucia do czaszki po próbach i błędach za pomocą wielu klejów; Można jednak rozważyć dostępne alternatywy.
- Po zabiegach chirurgicznych szczury trzymane są w pomieszczeniach pojedynczo i zapewniają swobodny dostęp do pożywienia i wody. Zapewnienie opieki pooperacyjnej zgodnej z wytycznymi instytucjonalnymi. Codziennie przepłukiwać cewniki solą fizjologiczną zawierającą gentamycynę (5 mg/ml) i heparynę (30 USP/ml) w celu utrzymania drożności. Co najmniej 5 dni po operacji i 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentów behawioralnych, pokarm ogranicza szczury do ~90% ich wagi podczas swobodnego karmienia.
2. Samodzielne podawanie kokainy przez gryzonie i instrumentalne wygaszanie dźwigni
UWAGA: Wszystkie procedury behawioralne są przeprowadzane w standardowych komorach kondycjonowania instrumentalnego, wyposażonych w dwie wysuwane dźwignie na jednej ścianie, światło bodźcowe nad każdą dźwignią, generator tonów, światło domowe i pompę infuzyjną.
- Poddaj szczury codziennym 1-godzinnym sesjom treningowym samodzielnego podawania kokainy (2 mg/ml) zgodnie z harmonogramem wzmacniania według harmonogramu 1 (FR1) o stałym stosunku.
- Umieszczaj szczury w komorze operacyjnej każdego dnia i pozwól szczurom nacisnąć dźwignię. Naciśnięcie wyznaczonej "aktywnej dźwigni" (z przeciwwagą między lewą i prawą dźwignią) powoduje infuzję kokainy (1,0 mg/kg/infuzję) i 10-sekundową prezentację złożonej wskazówki świetlnej i tonalnej. Naciśnięcie wyznaczonej "nieaktywnej dźwigni" nie ma zaprogramowanych efektów.
- Kontynuuj eksperymenty z samodzielnym podawaniem przez co najmniej 10 dni i do momentu, gdy szczury pomyślnie zdobędą co najmniej 8 naparów dziennie przez 3 kolejne dni. Niespełnienie kryteriów akwizycji do 20 dnia skutkuje wykluczeniem z badania.
- Po pomyślnym spełnieniu kryteriów nabycia, poddaj szczury 1-godzinnym sesjom instrumentalnego wymierania przez 6-10 d.
- Umieść szczury w komorach operacyjnych i pozwól szczurom swobodnie naciskać dźwignię. Jednak reakcje zarówno na aktywne, jak i nieaktywne dźwignie nie mają zaprogramowanych konsekwencji.
- Niech szczury kontynuują instrumentalne wymieranie codziennie, aż nastąpi średnio < 25 naciśnięć dźwigni w ciągu dwóch kolejnych dni.
3. Indukcja optogenetyczna in vivo LTD
UWAGA: Eksperymenty z hamowaniem optogenetycznym odbywają się 24 godziny po ostatnim dniu wyginięcia instrumentalnego.
- Podłącz krosowe do niebieskiej diody laserowej 473 nm za pomocą obrotowego złącza zawieszonego nad czystą, standardową klatką dla gryzoni ze zdjętą pokrywą. Taka konfiguracja pozwala gryzoniom na swobodne poruszanie się po klatce podczas stymulacji optogenetycznej.
- Włącz diodę laserową zgodnie z instrukcją obsługi i podłącz do generatora impulsów. Dostosuj ustawienia tak, aby po włączeniu szczur otrzymywał 900 impulsów światła 2 ms przy 1 Hz.
UWAGA: Podczas obsługi lasera należy zawsze używać odpowiedniej ochrony oczu. - Zmierz natężenie światła przez krosowy za pomocą czujnika światła. Dostosuj intensywność lasera tak, aby strumień świetlny przez krosowy wynosił ~5-7 mW.
- Umieść szczury w czystej klatce. Zdejmij osłony przeciwpyłowe i tuleje tulejowe, odsłaniając tuleje. Podłącz krosowe obustronnie do implantów światłowodowych. Pozwól szczurom badać środowisko przez 3 minuty przed indukcją LTD.
- Włącz generator impulsów, aby zainicjować stymulację optogenetyczną.
UWAGA: Chociaż jest to mało prawdopodobne, jeśli szczury doświadczą jakichkolwiek niepożądanych reakcji na stymulację, eksperyment jest natychmiast przerywany, a szczury są odpowiednio uśpione w oparciu o wytyczne instytucjonalne. - Po indukcji LTD trzymaj szczury w klatce przez 3 minuty, a następnie umieść je z powrotem w klatkach domowych.
- W przypadku eksperymentów kontrolnych należy zastosować tę samą procedurę stymulacji na szczurach, u których występuje ekspresja wirusa kontrolnego AAV5-tdTomato. W przypadku pozorowanych eksperymentów podłącz krosowy do światłowodu szczurów, które wyrażają wirusa AAV5-oChIEF, ale podczas 15-minutowej sesji nie jest dostarczana stymulacja.
4. Przetestuj wpływ stymulacji optogenetycznej na kokainę wywołaną sygnałem Seeking
- 24 godziny po stymulacji optogenetycznej in vivo umieść szczury z powrotem w komorach kondycjonowania instrumentalnego. Szczury są poddawane 1-godzinnej standardowej sesji przywracania indukowanej sygnałem w celu oceny zachowań związanych z poszukiwaniem kokainy.
UWAGA: Podczas przywrócenia wywołanego sygnałem, odpowiedź na aktywną dźwignię daje 10-sekundową prezentację sygnału związanego z kokainą, ale bez wlewów kokainy. - Wykonaj drugi test przywracający do pracy co najmniej 1 tydzień po pierwszym teście, aby ustalić, czy indukcja optogenetyczna LTD skutkuje długotrwałym zanikiem kokainy