Obrazowanie tkanek głębokich mózgu danio pręgowanego przy użyciu trójfotonowego mikroskopu fluorescencyjnego

Abstract

Źródło: Hontani, Y., et al. Mikroskopia fluorescencyjna trójfotonowa tkanek głębokich w nienaruszonym mózgu myszy i danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film pokazuje konfigurację i wykonanie obrazowania trójfotonowego w znieczulonym mózgu danio pręgowanego. Protokół umożliwia wizualizację głębokich tkanek neuronów znakowanych fluorescencyjnie, ujawniając aktywność neuronalną i struktury w czasie rzeczywistym do zastosowań badawczych w dziedzinie neurobiologii.

Protocol

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Obrazowanie przyżyciowe w mózgu danio pręgowanego
   UWAGA: Aby prawidłowo zlokalizować mózg ryby pod soczewką obiektywu, na tej samej ścieżce, co światło wzbudzenia (CCD), stosuje się wtórną kamerę ze sprzężeniem ładunkowym do obrazowania szerokokątnego.
   
   1. Ustaw mikroskop i skalibruj moc.
   2. Umieść obiektyw o małym powiększeniu (zwykle 4x) na mikroskopie.
   3. Umieścić szalkę Petriego zawierającą rybę i probówki pod mikroskopem.
   4. Użyj źródła światła z diodą elektroluminescencyjną (LED), aby oświetlić szalkę Petriego.
   5. Otwórz tryb aparatu w oprogramowaniu do akwizycji obrazów (Rysunek 1).
   6. Kliknij opcję Na żywo.
   7. Wybierz kanał A po prawej stronie ekranu.
   8. Dostosuj ustawienia histogramu, aby obraz był wyraźnie widoczny.
      UWAGA: W razie potrzeby należy je zaktualizować.
   9. Ustaw ustawienie silnika w sterowniku silnika na Base.
   10. Opuść obiektyw, aż ryba będzie widoczna.
       UWAGA: Upewnij się, że soczewka obiektywu nie ma żadnego fizycznego kontaktu z głowicą.
   11. Umieść środek głowy ryby w środku pola widzenia.
   12. Przesuń cel w górę i odsuń go od głowy ryby.
   13. Wymień soczewkę obiektywu o małym powiększeniu na soczewkę obiektywową o wysokim otworze numerycznym (NA) dla 3PM (mikroskopia trójfotonowa).
       UWAGA: Soczewka o małym powiększeniu i soczewka obiektywowa o wysokim NA nie muszą być parafokalne, ale muszą być wystarczająco blisko, aby ryba znajdowała się w polu widzenia soczewki obiektywu o wysokiej NA.
   14. Powoli opuść soczewkę obiektywu, upewniając się, że obiektyw nie ma żadnego fizycznego kontaktu z głowicą. W oprogramowaniu kamery CCD przestań przesuwać obiektyw, gdy widoczny jest czubek głowy. Ustaw położenie z na 0 μm.
       UWAGA: Upewnij się, że pod soczewką obiektywu nie ma pęcherzyków powietrza podczas korzystania z obiektywu zanurzonego w wodzie.
   15. Wyłącz źródło światła LED i zamknij ciemną kurtynę wokół systemu.
   16. Ustaw oprogramowanie do akwizycji obrazu w trybie Multiphoton GG dla obrazowania 3P i ustaw moc pod soczewką obiektywu na mniej niż 1 mW (z częstotliwością powtarzania impulsów ~1 MHz).
   17. Zmień przycisk ustawień silnika z podstawy na obiektyw na sterowniku silnika.
   18. Zgaś światło w pokoju.
   19. Włącz lampy fotopowielacza (PMT) i otwórz migawkę źródła wzbudzenia 3PM. Upewnij się, że kontur kości pojawia się w kanale sygnału fluorescencji z powodu autofluorescencji oraz w kanale sygnałowym trzeciej harmonicznej (THG) z powodu THG kości (ryc. 1C).
   20. Wykonuj obrazowanie na różnych głębokościach, zwiększając poziomy mocy podczas głębszego obrazowania.

Results

Rysunek 1: Reprezentatywne zrzuty ekranu dla obrazowania przyżyciowego u ryb (sekcja protokołu 1). (A) Widok w trybie kamery w oprogramowaniu do akwizycji obrazu z założonym obiektywem 4x. Kluczowe funkcje oprogramowania są ...

Materials