In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.

Streszczenie

Nasze rozumienie tego, jak i kiedy komórki raka piersi przechodzą z utrwalonych guzów pierwotnych do ognisk przerzutowych, wzrosło w wyjątkowym tempie od czasu pojawienia się technologii obrazowania bioluminescencyjnego in vivo ^1-3. Rzeczywiście, możliwość lokalizacji i ilościowego określania wzrostu guza podłużnie w jednej kohorcie zwierząt aż do zakończenia badania, w przeciwieństwie do poświęcania poszczególnych grup zwierząt w określonych punktach czasowych analizy, zrewolucjonizowało sposób, w jaki badacze analizują przerzuty raka piersi. Niestety, obecne metodologie wykluczają ocenę w czasie rzeczywistym krytycznych zmian zachodzących w systemach sygnalizacji komórkowej, gdy komórki raka piersi (i) ewoluują w obrębie guzów pierwotnych, (ii) rozprzestrzeniają się po organizmie i (iii) ponownie inicjują programy proliferacyjne w miejscach powstania zmian przerzutowych. Jednakże niedawne postępy w obrazowaniu bioluminescencyjnym umożliwiają obecnie jednoczesne ilościowe określanie specyficznych zmian spatiotemporalnych w ekspresji genów w funkcji rozwoju guza i progresji przerzutowej poprzez zastosowanie reakcji luminescencyjnych z wykorzystaniem podwójnego substratu. W tym celu badacze wykorzystują dwa enzymy lucyferazy wytwarzające światło, wyizolowane ze świetlika (Photinus pyralis) i morskiego kwiatuszka (Renilla reniformis), z których oba reagują na wzajemnie wykluczające się substraty, co wcześniej ułatwiło ich szerokie zastosowanie w analizach genów reporterowych w układach komórkowych in vitro ⁴. Przedstawiamy tutaj użyteczność in vivo tych dwóch enzymów w taki sposób, że jedna reakcja luminescencyjna specyficznie oznacza rozmiar i lokalizację rozwijającego się guza, podczas gdy druga reakcja luminescencyjna służy jako sposób wizualizacji stanu aktywacji specyficznych systemów sygnalizacyjnych podczas odrębnych etapów rozwoju guza i przerzutów. Zatem cele niniejszego badania są dwukrotne. Po pierwsze, opiszemy kroki niezbędne do stworzenia podwójnych linii komórkowych reporterów bioluminescencyjnych, a także kroki potrzebne do ułatwienia ich zastosowania w wizualizacji regulacji spatiotemporalnej ekspresji genów podczas specyficznych etapów kaskady przerzutniczej. Wykorzystując model przerzutów raka piersi 4T1, wykazujemy, że aktywność in vivo syntetycznego promotora elementu wiążącego Smad (SBE) była znacznie zmniejszona w przerzutach płucnych w porównaniu z aktywnością mierzoną w guzie pierwotnym ^4-6. Niedawno wykazano, że przerzuty raka piersi są regulowane przez zmiany w mikrośrodowisku guza pierwotnego i reaktywnym zrębie, w tym te zachodzące w fibroblastach i infiltrujących komórkach odpornościowych ^7-9. W związku z tym naszym drugim celem będzie wykazanie użyteczności podwójnych technik bioluminescencyjnych w monitorowaniu wzrostu i lokalizacji dwóch unikalnych populacji komórek znajdujących się w jednym zwierzęciu podczas wzrostu i przerzutowania raka piersi.

Protokół

1. Stabilna ekspresja lucyferazy Renilla pod promotorem CMV

1. Transfekcja i selekcja stabilnej populacji klonalnej jest preferowaną metodą ekspresji tego reportera lucyferazy renilla. Podejście to zapewnia bardziej spójną i jednolitą ekspresję lucyferazy renilla po późniejszym wprowadzeniu dodatkowych wtórnych konstruktów reporterowych (np. lucyferazy świetlika lub białek fluorescencyjnych).
2. Przetransfekuj interesujące badanie komórki nowotworowe wektorem ekspresyjnym kodującym lucyferazę renilla, takim jak pcDNA3.1-Hygro lub innym plazmidem zawierającym marker selekcyjny.
3. Po transfekcji poddaj transfektanty optymalnemu stężeniu antybiotyku przez kilka dni lub tygodni, aby ułatwić izolację pojedynczych kolonii, które następnie są izolowane indywidualnie i poddawane pasażowaniu.
4. Wyselekcjonuj ≥10 pojedynczych kolonii wykazujących ekspresję lucyferazy renilla, aby monitorować stopień tej ekspresji.
5. Kolonie wykazujące wysoką ilość lucyferazy renilla są następnie poddawane analizom funkcjonalnym, aby upewnić się, że (i) zachowane zostały właściwości patofizjologiczne ich odpowiedników rodzicielskich oraz (ii) wartości ekspresji renilla nie wykazują odchyleń ani nie zmieniają się w czasie. Kroki te są absolutnie niezbędne, aby uniknąć izolacji i badania wariantów/dewiantów klonalnych oraz aby potwierdzić prawidłową integrację konstruktu renilla z genomem.
6. Po wyizolowaniu i zweryfikowaniu stabilnego transfektanta można usunąć presję selekcyjną, mając pewność, że ekspresja lucyferazy renilla pozostanie stała przez dłuższy czas zarówno in vitro, jak i in vivo.

2. Ekspresja, selekcja i weryfikacja funkcjonalna lucyferazy świetlika sterowanej przez promotor indukowalny

1. Subklonuj badany promotor do plazmidu reporterowego pGL4-luciferase zawierającego marker selekcyjny (np. puromycynę), który różni się od markera użytego do selekcji stabilnej ekspresji lucyferazy renilla (np. hygromycyny).
2. Wykonaj transfekcję komórek nowotworowych zgodnie z Krokiem I, a następnie dokonaj selekcji stabilnej poliklonalnej populacji komórek wykazujących ekspresję lucyferazy świetlikowej. Ponieważ miejsce integracji genu reporterowego w genomie może wywoływać błędne efekty w zakresie jego ekspresji i regulacji, zdecydowanie zaleca się selekcję poliklonalnych populacji komórek wykazujących ekspresję lucyferazy świetlikowej zamiast populacji klonalnych, aby zapewnić, że (i) ekspresja genu reporterowego dokładniej odzwierciedla ekspresję genu endogennego w komórkach rodzicielskich oraz (ii) efekty integracji wpływające na ekspresję genów zostaną uśrednione i zminimalizowane w heterogenicznej populacji komórek.
3. Komórki nowotworowe zmodyfikowane w celu stabilnej ekspresji zarówno lucyferazy renilla, jak i świetlikowej, określa się zbiorczo jako podwójne komórki reporterowe bioluminescencyjne lub komórki DBR.
4. Wykorzystując tradycyjne in vitro testy reporterowe lucyferazy w komórkach, zweryfikuj, czy komórki DBR regulują ekspresję lucyferazy świetlikowej, dodatnio lub ujemnie, w sposób zgodny z tym zaobserwowanym w komórkach rodzicielskich przejściowo transfekowanych tymi wektorami. Podobnie zweryfikuj, czy ekspresja lucyferazy renilla pod kontrolą promotora CMV nie jest regulowana przez różne stymulacje komórkowe lub warunki traktowania.
5. W tym celu hoduj komórki DBR oraz komórki rodzicielskie na płytkach 24-dołkowych, a następnie wykonaj przejściową kotransfekcję komórek rodzicielskich oryginalnymi konstruktami CMV-renilla i promoter-firefly, które zostały użyte do wytworzenia komórek DBR.
6. Następnie potraktuj komórki DBR i transfekowane komórki rodzicielskie czynnikami lub środkami farmakologicznymi znanymi z regulacji badanego promotora, a następnie zmierz luminescencję lucyferazy świetlikowej i renilla, korzystając z zestawu Promega Dual Luciferase Assay Kit.

3. Wytwarzanie pierwotnych guzów piersi 4T1

1. Komórki przerzutowego raka piersi 4T1, w których stwierdzono brak przywspółistniejących patogenów gryzoni, zostały zmodyfikowane w celu stabilnej ekspresji lucyferazy renilla pod promotorem CMV (pcDNA3.1-CMV-renilla luciferase-hygro) oraz lucyferazy świetlikowej pod promotorem SBE (pGL4.2-SBE-firefly luciferase-puro), zgodnie z powyższym opisem. Ortotopowe przeszczepienie tych komórek raka piersi prowadzi do powstania spontanicznych przerzutów, głównie w płucach.
2. Podczas namnażania komórek 4T1 w tradycyjnych dwuwymiarowych systemach hodowli tkankowych nie należy dopuścić do osiągnięcia przez nie konfluencji; należy je pasażować w dniu poprzedzającym inokulację in vivo.
3. Komórki 4T1 należy rozdzielić poprzez trypsynizację, dokładnie wypłukać w pożywce wzrostowej, a następnie rozcieńczyć w PBS do stężenia 2x10⁵ komórek/ml i niezwłocznie przechowywać w lodzie.
4. Samice myszy Balb/C (w wieku 4-6 tygodni) należy znieczulić dawką indukcyjną 3% izofluranu i utrzymywać w znieczuleniu przy dawce 1% izofluranu. Miejsce wstrzyknięcia należy przygotować, przecierając je 70% alkoholem izopropylowym. Używając pęsety, należy delikatnie chwycić i unieść czwarty gruczał piersiowy pachwinowy. Ostrożnie wprowadzić igłę o rozmiarze 27,5 G ściętym końcem do góry i wstrzyknąć w tkankę tłuszczową gruczołu piersiowego bezpośrednio pod brodawką, dbając szczególnie o to, aby nie wprowadzić igły do jamy brzusznej. Puścić gruczoł i powoli wstrzyknąć 50 μl zawiesiny komórkowej (1x10⁴ komórek) do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego.

4. Wstępne obrazowanie podwójnie luminescencyjne

1. Bezpośrednio po wszczepieniu komórek 4T1 do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego, gdy myszy nadal znajdują się pod wpływem znieczulenia, wstrzyknąć 100 μl RediJect Coelenterazine do bocznej żyły ogonowej. Jest to optymalne stężenie substratu zalecane przez dostawcę i najlepiej tolerowane przez zwierzę.
2. Natychmiast umieść mysz w stożku nosowym z izofluranem w systemie obrazowania IVIS-20 i wykonaj obraz luminescencyjny trwający od 0,5 do 1 minuty. Szybkość działania pomiędzy wstrzyknięciem a akwizycją obrazu jest bardzo istotna, ponieważ sygnał lucyferazy renilla gwałtownie spada około 30 sekund po wstrzyknięciu. Umieść mysz z powrotem w klatce i pozwól jej dojść do siebie przez ≥1 godzinę, co zapewni rozproszenie pozostałego sygnału lucyferazy renilla oraz pełne wybudzenie myszy z anestezji.
3. Podać 150 mg/kg soli potasowej D-lucyferyny poprzez Wykonać wstrzyknięcie d.o.m. (dos brzuszny) i odczekać 5 minut. Jest to optymalne stężenie D-lucyferyny, które zapewnia stabilny sygnał luminescencyjny przez 5–15 minut po wstrzyknięciu do zwierząt badawczych. Zanestezjować mysz izofluranem i umieścić ponownie w urządzeniu IVIS-20, dbając o to, aby zwierzę znajdowało się w pozycji bardzo zbliżonej do pozycji podczas pierwotnej akwizycji sygnału renilli. Całkowita intensywność sygnału świetlika będzie zależeć od aktywności badanego promotora, w związku z czym wizualizacja aktywności lucyferazy świetlika może wymagać dłuższego czasu akwizycji.
4. Używając oprogramowania IVIS Living Image w trybie „photons”, należy wyznaczyć wartości dla akwizycji renilla oraz firefly w celu ustalenia bazowych względnych stosunków luminescencji (RLR).

5. Podłużne obrazowanie luminescencyjne

1. Komórki 4T1 są wysoce agresywne, przez co inokulacja 1x10⁴ komórek zazwyczaj prowadzi do powstania wyczuwalnego guza w ciągu 1 tygodnia oraz do śmierci zwierzęcia w ciągu 4-5 tygodni. Guzy 4T1 wykazują naturalną tendencję do owrzodzenia w 4. tygodniu. Wzrost i utrzymywanie owrzodziałych guzów może wymagać oddzielnej zgody IACUC. Przedstawione tutaj badania nad guzami 4T1 zostały zatwierdzone przez IACUC na Case Western Reserve University.
2. Zgodnie z powyższym opisem, myszy powinny być co tydzień wstrzykiwane RediJect Coelenterazine w celu monitorowania ogólnego wzrostu guza i przerzutów, a także D-lucyferyną w celu monitorowania sygnalizacji specyficznej dla danej ścieżki w różnych etapach rozwoju guza. Należy każdorazowo zadbać o to, aby sygnał lucyferazy renilla całkowicie zanikł przed akwizycją sygnału lucyferazy świetlikowej.
3. W miarę rozwoju i progresji guzów 4T1, akwizycje lucyferazy renilla powinny być normalizowane względem początkowych wartości renilla zmierzonych w momencie inokulacji komórek nowotworowych, aby znormalizować i śledzić wzrost guza pierwotnego. Co ważniejsze, obliczanie wartości RLR w czasie pozwoli ustalić regulację czasową poszczególnych systemów sygnalizacyjnych w odniesieniu do wzrostu i progresji guza.
4. Jawne przerzuty do płuc stają się widoczne w ciągu 3-4 tygodni po wszczepieniu komórek 4T1 do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego. Porównanie wartości RLR w płucach w stosunku do wartości obliczonych dla guza pierwotnego pozwala ustalić regulację przestrzenną poszczególnych systemów sygnalizacyjnych w odniesieniu do wzrostu guza i przerzutów.

6. Podwójne obrazowanie bioluminescencyjne dwóch unikalnych typów komórek w jednym organizmie

1. Zmodyfikuj jedną linię komórkową raka piersi w celu stabilnej ekspresji lucyferazy renilla pod promotorem CMV, zgodnie z powyższym opisem. Powtórz ten proces modyfikacji, wykorzystując lucyferazę świetlikową pod promotorem CMV w drugiej, odrębnej linii komórkowej raka piersi.
2. W niniejszym badaniu zmieszano komórki 4T1 wykazujące ekspresję lucyferazy renilla z ich nieprzerzutowymi i izogenicznymi odpowiednikami 4T07 wykazującymi ekspresję lucyferazy świetlikowej ^{10, 1}. Różne proporcje tych zmieszanych populacji komórek raka piersi są następnie wstrzykiwane do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego zgodnie z powyższym opisem.
3. Natychmiast wykonaj obrazy bioluminescencyjne dla lucyferazy świetlikowej i renilla, aby ustalić początkowe RLR reprezentatywne dla danej mieszaniny wszczepionych komórek.
4. Podłużne obrazowanie dualne bioluminescencją pozwoli zwizualizować i śledzić zmiany w składzie komórkowym w obrębie guza pierwotnego, a także czasowo-przestrzenną przerzutowość każdej z pochodnych raka piersi w odniesieniu do wzrostu i progresji nowotworu.
5. Alternatywnie, poszczególne populacje komórek raka piersi można wszczepić w różne miejsca u myszy ( np. do prawego i lewego podbrzusznego tłuszczu gruczołu piersiowego), aby ocenić wpływ systemowy, jaki te dwie populacje wywierają na siebie nawzajem podczas różnych etapów wzrostu guza i przerzutowania.

7. Reprezentatywne wyniki:

Główną zaletą podwójnego obrazowania bioluminescencyjnego jest fakt, że każdy obraz jest wewnętrznie spójny i kontrolowany, dzięki czemu utrzymujące się sygnały pochodzące z guza pierwotnego służą jako istotny miernik oceny ogólnego sukcesu lub niepowodzenia każdej akwizycji dla lucyferazy renilla oraz firefly. Ten aspekt procedury obrazowania jest szczególnie ważny podczas rejestrowania aktywności lucyferazy renilla, której substrat, coelenterazyna, jest wysoce wrażliwy na utlenianie, co prowadzi do zjawiska autoluminescencji. Rysunek 1A przedstawia przykład tego efektu ubocznego, który objawia się natychmiast jako niespecyficzne sygnały luminescencyjne pochodzące z przewodu pokarmowego, a nie z ustalonego guza pierwotnego. Zazwyczaj niespecyficzne sygnały coelenterazyny występują po nieudanych wtryskach dożylnych substratu lucyferazy renilla. Jednak po uzyskaniu silnych sygnałów renilla pochodzących z guza pierwotnego (Rysunek 1B, lewy obraz), można bezpiecznie przystąpić do pomiarów sygnalizacji specyficznej dla danej ścieżki uzyskanych z obrazowania lucyferazy firefly (Rysunek 1B, prawy panel), której substrat D-lucyferyna jest wysoce stabilny po wstrzyknięciu dojamowym i generuje pomijalne poziomy tła autoluminescencyjnego.

Rysunek 1. Pozyskiwanie obrazów bioluminescencyjnych pochodzących z renilli i świetlika w celu obliczenia in vivo RLRs. (A) Przykład nieudanej iniekcji dożylnej koelenterazyny, która doprowadziła do niespecyficznego sygnału z przewodu pokarmowego. Okrąg i PT wskazują przybliżoną lokalizację guza pierwotnego. (B) Udany obraz renilla myszy z guzem pierwotnym 4T1 i przerzutami do płuc (panel lewy; 4 tygodnie po wszczepieniu do tkanki tłuszczowej). Odpowiadający temu obraz firefly umożliwia obliczenie stosunków RLR dla guza pierwotnego oraz jego przerzutów do płuc. (C) Graficzna reprezentacja współczynników RLR guza pierwotnego i przerzutów do płuc obliczonych dla myszy przedstawionych na panelu B (n=4).

Dyskusja

Niezaprzeczalna siła technik obrazowania bioluminescencyjnego tkwi w ich zdolności do ilościowego określania wzrostu i przerzutowania nowotworów w złożonych badaniach podłużnych, które w niniejszym przypadku obejmowały wykorzystanie agresywnych komórek raka piersi 4T1. Ponieważ procedury te opierają się na stabilnej integracji obu konstruktów reporterowych lucyferazy, techniki te mogą być łatwo adaptowane i przeniesione na inne linie komórek nowotworowych o różnym czasie latencji i potencjale przerzutowym. Podobnie jak w wynikach przedstawionych w niniejszej pracy, obliczanie specyficznych RLR w wolno rozwijających się guzach pierwotnych i ich końcowych przerzutach umożliwia spatiotemporalną identyfikację w czasie rzeczywistym specyficznych zdarzeń sygnalizacyjnych, które zachodzą podczas progresji przerzutowej nowotworów, niezależnie od czasu ich latencji. Po zidentyfikowaniu specyficznych zdarzeń regulacyjnych promotora istotne jest wycięcie zarówno guza pierwotnego, jak i jego zmian przerzutowych w celu przeprowadzenia standardowych analiz immunohistochemicznych oraz analiz różnicowej ekspresji genów, aby zweryfikować podobną regulację endogennego genu i/lub białka.

Mówiąc ściśle, głównym wyzwaniem w podwójnych analizach bioluminescencyjnych jest stosunkowo krótki czas trwania sygnałów lucyferazy renilla. W związku z tym technika obrazowania ta wymaga znacznej optymalizacji procedury wstrzykiwania do żyły ogonowej, a także natychmiastowego obrazowania poszczególnych wstrzykniętych zwierząt, co jest procesem czasochłonnym i nieco mniej wydajnym w porównaniu z obrazowaniem lucyferazy świetlika. Niedawno firma Promega wprowadziła „Viviren”, który stanowi drugą generację substratu lucyferazy, w którym miejsca utleniania są zablokowane poprzez estryfikację do momentu wniknięcia cząsteczki do komórek, kiedy to ulega ona szybkiej deestryfikacji. Łącznie ten nowy substrat skutecznie obniża autoluminescencję oraz niespecyficzną modyfikację i/lub degradację powiązaną z autoluminescencją indukowaną przez renilla ¹². Dzięki temu nowy substrat lucyferazy renilla generuje jaśniejsze sygnały luminescencyjne; jednak nadmierne koszty związane z nabyciem i stosowaniem „Viviren” sprawiły, że przeprowadzono stosunkowo niewiele badań niezbędnych do oceny ogólnej użyteczności tego substratu w podwójnych analizach bioluminescencyjnych. Wreszcie, czułość każdego testu bioluminescencyjnego jest krytycznie zależna od kamery CCD wykorzystywanej do rejestrowania pojedynczych jednostek światła. W istocie, wraz z udoskonalaniem tych technologii, przewidujemy moment w przyszłości, w którym nasza zdolność do wizualizacji złożonych, zapośredniczonych przez światło reakcji bioluminescencyjnych będzie mogła być efektywnie realizowana u zwierząt swobodnie poruszających się ¹³.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pGL4.2-Puro [luc2Wektor [/Puro]	Promega Corp.	E6751
System wielowykrywalny Glomax	Promega Corp.
seria IVIS 200	Caliper Life Sciences
System dwucyfrowego testu reporterowego lucyferazy	Promega Corp.	E1960
Rediject c–lenterazyna-h	Caliper Life Sciences	760506
Sól potasowa D-lucyferyny	Caliper Life Sciences	122796